Non-invaziv Hipertermi Kanser Tedavisi için Altın Nanoparçacıklannm ve Biyolojik Sistemleri ile Radyofrekans Etkileşimleri değerlendirilmesi için Protokoller

Özet

Biz 13.56 MHz radyofrekans (RF) etkileşimlerini araştırmak için kullanılan protokolleri açıklar hem biyolojik olmayan ve biyolojik sistemlerde (in vitro / in vivo) altın nanoparçacık koloitlerle elektrik-alanlar. Bu etkileşimler, kanser terapisinde uygulamalar için araştırılmaktadır.

Özet

Var olan muadillerine göre daha az toksik ve invazif kanser tedavileri son derece tercih edilir. Minimal toksisite neden vücudun derinlerine nüfuz RF elektrik alanlarının kullanımı, şu anda non-invaziv kanser tedavisinin uygun bir araç olarak çalışılmaktadır. Bu içselleştirilmiş nanopartiküller (NPS) ile RF enerji etkileşimleri sonuçta hücre nekrozu biten, daha sonra hücre (hipertermi) aşırı ısınmaya neden olabilir ısı kurtarmak için düşünülmüştür.

Biyolojik olmayan sistemlerin durumda, son derece konsantre edildi NP koloidler tarafından serbest bırakılan ısı miktarının ilgili ayrıntılı protokolleri mevcut. Biyolojik sistemlerde, in vitro deneylerin halinde, etkili bir şekilde önemli ölçüde verileri örtücü kütle ortam ısıtma yapılar olmadan RF enerjisine kanser hücrelerini açığa çıkarmak için uyulması gereken teknikler ve koşullarını tarif eder. Son olarak, ayrıntılı bir metodoloji F vermeyeceğimveya ektopik karaciğer kanser tümörleri ile vivo fare modelleri.

Giriş

(Nedeniyle doğal elektrik dielektrik etmek üzere) biyolojik doku ile RF enerji emme sonunda hipertermi ile hücre ölümüne yol açan, zamanın bir fonksiyonu olarak, yüksek sıcaklıklarda doku ile sonuçlanır. Kanser hipertermi kanser hücresi içinde, içselleştirme ve sağlam komşu, sağlıklı normal hücreleri bırakarak, RF-ısı dönüştürücüler olarak hareket hedeflenen nanomalzemelerin kullanılarak optimize edilebilir olduğu varsayılmaktadır. Çeşitli raporlar zaten NPlerin çeşitli hangi kanser nekroz ^1-4 yardımı gibi etkili RF ısı kaynaklarına hareket olduğunu göstermiştir.

Bu açıdan, altın NPS (AuNPs) ^3-5 karbon nanotüpleri ¹ ve kuantum noktaları ^6, in vitro ve in vivo deneylerde RF kullanıldığında, ⁷ verici özellikler göstermiştir. Bir RF-alana maruz kalan, bu NPlerin ısıtma mekanizmasının tam doğası halen tartışılıyor olsa da, bir dizi bölgesininAuNPs kullanarak temel deneyler NP büyüklüğü ve toplama iki devlete de büyük önem vermiştir. Bir ^RF-8 alana maruz kaldığında çapı <10 nm sadece AuNPs ısı olacağı gösterilmiştir. AuNPs toplanır Ayrıca, bu ısıtma mekanizması önemli ölçüde azalırlar. Bu yığılma durum aynı zamanda etkili bir terapi RF ⁴ endolysomal hücre içi bölmeler içinde AuNP kolloidal kararlılığını optimize üzerine önem in vitro modeller içinde geçerli kılındı. Ancak, bu verileri toplamak ve değerlendirmek için kullanılan teknikler ve deneysel ilkeler özellikle NP taneciklerinden RF ısı profilleri doğrulanması durumunda, sorunlu olabilir.

Çeşitli raporlar, NPS içerisinde süspanse edilir plan iyonik süspansiyonun Joule ısıtma ana RF ısı üretim kaynağı olup NPS kendilerini ^9-12 olabilir göstermiştir. Bizim son kağıt ⁸ t doğrulanmış olmasına rağmenO 10 nm daha az çapları AuNPs ısı üreten RF etkileşimleri kullanmak, bu yazı boyunca daha ayrıntılı olarak bu protokolleri açıklamak hedefliyoruz.

Ayrıca protokolleri ve in vitro ve in karaciğer kanseri modelleri için in vivo ve hem de in hipertermik termal maddeler olarak AuNPs etkinliğini değerlendirmek için gerekli olan teknikleri göstermektedir. Biz sitrat başlıklı AuNPs basit koloitler öncelikle odak olsa da, aynı teknikler bu tür antikor ve kemoterapi ile konjüge kompleksleri gibi diğer AuNP melez uygulanabilir. Bu ilkelere bağlı kalarak Deneyciler umarım hızla etkili bir RF kaynaklı termal Hyperthermic ajan olmak için herhangi bir nanomaterial için potansiyelini değerlendirmek gerekir.

Protokol

Bütün deney bir genel görünüşü Şekil 1'de gösterilmiştir.

Daha fazla detay aşağıda 1-3 adımları tasvir edilmiştir.

1.. NP Colloids Değerlendirilmesi RF Isıtma: Bir Örnek olarak AuNPs

1. Genel olarak, her numune NP araştırılmaktadır için, ilk olarak arka plan iyonları ve kirleri çıkarmak için iyonu giderilmiş (Di) su ile santrifüj filtre ile örnek birkaç kez yıkayın. Tüm iyonlar ve kirletici yıkanmış olan sıvı DI su gibi benzer RF ısıtma oranları (HR) sahiptir AuNP süspansiyondan kaldırılmış olacaktır. Bu saflaştırma işlemi, aynı zamanda elde edilecek NPlerin daha yüksek konsantrasyonları sağlar. Bu örnekte AuNPs kullanarak rağmen, temel ilkeler, diğer NP malzemelere uygulanabilir fazlalaştı.
2. Bir örnek olarak, çapı 5 nm arasında ticari olarak temin edilebilen AuNPs bir 500 ml şişe saflaştırılması ve daha sonra, elektrik-fi bir 13.56 MHz RF alanına tabi tutabilireld gücü 90 kV / m.
   1. ~ Altı 50 kDa santrifüj filtre tüpleri arasındaki stok AuNP solüsyonu ve bölünmüş 125 ml alın. 3.000 rpm'de santrifüj. 2 dakika bekletildikten sonra 5 saniye için. Daha fazla stok solüsyonu ile süzülür tampon ve dolum filtrelerini çıkarın. Tüm 500 ml süzülmüş edene kadar tekrarlayın.
   2. DI su benzer bir hacmi ile filtre tampon ve yaklaşık olarak yerine 8 kez (ya da filtre tampon RF HR DI suya eşdeğer kadar) tekrar edin. UV-Vis analizi de kirletici absorpsiyon tepeleri izlemek için kullanılabilir, dikkat edin. Tampon kirletici tam olarak her filtre içine pipet yaklaşık olarak 0.5 ml DI su çıkarıldı ve tekrar pipetleme AuNPs yeniden süspanse edildikten sonra. Bu tamamen filtreden AuNPs kaldırmak ve tam süspansiyonu için izin vermelidir. Bir 15 ml Eppendorf tüpüne altı süspansiyonlar birleştirin.
   3. AuNPs arıtılmış ve konsantre edildikten sonra, ICP-OES ve / veya ICP-MS, UV-vis ve concentratio veri Zeta potansiyelini kullanarak numuneyi analizn ve NP istikrar, sırasıyla. SEM ve / veya TEM analizi de morfolojik veriler elde etmek için kullanılabilir. Bu tekniklerin ayrıntılı örnek hazırlama ⁴ literatürde bulunabilir.
3. Kanzius RF önceki çalışmalarda ^8'de tarif sistemi, ya da bu sistemin Türevler, (herhangi bir örnek mevcut olan) havada RF elektrik alanı, ve böylece, bir 1.3 ml silindirik bir kuartz küvet yer ~ küvete içindeki 90 kV / m kullanma. Standart bir örnek için tuzlu su (% 0.9 NaCl) elektrik alanı ~ 1.1 kV / m azaltılmış olacaktır. Bu karşılaştırmalar, farklı sistemler arasında yapılacak izin vermek için kullanılan yaklaşık durumlardır.
   1. Pipet kuartz küvet içine saflaştırılmış AuNP koloidin, 1000 mg / l örneğin 1.3 ml ve RF-alan içine bu tanıtmak. Bu özel bir dahili teflon numune tutucu kullanılarak yapılabilir. 120 saniye bir süre için ya da örnek elektrik arkı ya da hızlı kaynamasını önlemek için 70 ° C ulaşana kadar RF-alana örnek Açığa. CaIR kamera ve ilgili yazılım kullanılarak termal görüntüleme verileri (aynı zamanda kontrol alanlarını) pture. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
   2. DI su tamponundan AuNPs elde etmek için bir 50 kDa santrifüj filtre ile filtre örneği. Üç kez tekrar, RF-alanına tampon yeniden ortaya. AuNP kolloidin ve plan DI su tampon arasında HR'ler farkı nedeniyle AuNPs kendilerini HR belirler. ~ HRS elde etmek için bekleyebilirsiniz 0.3 ° C / sn ve ~ 0.25 ° C / sn bir AuNP bağımlı İK vermek için 0.05 ° C / sn. In vitro / in vivo deneyler için 1.3 ml su içinde filtreden kalan AuNPs yeniden süspanse edin.

2. Nanopartikül destekli RF kaynaklı Hipertermi: In vitro çalışmalar

1. Bu in vitro çalışmalar, 2B tekli katmanlar meydana getirmeyen hücre kanser türü her türlü uygulanabilir. Bu deneyde, Hep3B hücre kaynaklı insan hepatoselüler karsinom kullanın.
   1. Plaka ~ 50.000 celbüyüme ortamı içinde 1 ml bir 12-yuvalı plakanın ön üç kuyu ls. Bu 6 kez (kontrolleri olarak NP çalışmalar için üç tabak ve üç tabak kullanın) tekrarlayın. NPs tanıtmadan önce 24 saat boyunca 37.5 ° C'de inkübe edin. 5 dakika için biyogüvenlik kabini UV ışığa maruz kullanarak ilk NPs sterilize edin.
   2. Her içine de, 1000 mg / L AuNP çözeltisi 0.1 ml tanıtmak ve başka bir 24 saat süre ile bırakın. Üç kontrol hücre plakalarının her bir oyuğuna 0.1 ml su eklenir ve de 24 saat süre ile bırakın.
   3. 24 saat geçtikten sonra hücre ortamı aspire ve herhangi bir yüzey-bağlı AuNPs çıkarmak için PBS ile yıkayın. Hücre ortamı değiştirin. Hücreler artık RF maruziyeti için hazırız.
2. RF-alan içinde her bir 12-yuvalı hücre paketi yerleştirin. Hücreler 31 ° C'ye soğuyana kadar bekleyin RF jeneratör açın ve 3.5 dakika boyunca maruz. Hücre ortamının nihai sıcaklığı ~ 37 ° C olacak RF alanı kapatın. Hücreleri çıkarmak ve analizden önce 24 saat için bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin.
   1. kuvöz ve aspire hücre ortamından hücreleri çıkarın. MTT ayıracı 0.4 ml 'de her bir kuyucuğa hücre ortamının 1.6 ml ilave edilir. 4 saat hücreleri inkübe edin. Ortam aspire ve dimetil sülfoksit (DMSO), 2 ml ile değiştirin. Bir tezgah rocker hücre plakaları yerleştirin ve DMSO MTT reaktifleri çözmek için izin vermek için 10 dakika boyunca bırakın. Son olarak, optik olarak pipet 100 Bir 96-yuvalı plaka her bir ul ve bu SpectroStar Nano plaka okuyucusu gibi bir plaka okuyucusu kullanılarak 570 nm de iyi okuma.

3. Nanopartikül destekli RF kaynaklı Hipertermi: In vivo çalışmalar

1. Bu in vivo çalışmalar, ortotopik veya dış murin modelinde katı tümörler oluşturan herhangi bir kanser türüne uygulanabilir. Bu deney, bir dış tümör BALB-C çıplak fare modelinde Hep3B karaciğer kanser hücrelerini kullanır.
2. Not: Tüm in vivo deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde yürütülür. Ayrıca, göstermiştir ediliyordu protokol Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) rehberliği ve onayı altında gerçekleştirildi.
   1. Uygun büyüme ortamı ile bir doku kültürü şişesi içinde hücrelerin uygun bir sayısı (100 ~ k) büyütün. Hücre kültürü süresince,% 5 _CO2 ile 37 ° C inkübatör içinde inkübe edin.
   2. Tripsin (şişeden ayırmak için) hücreleri tedavi ve her bir 25 ul için 2000000 hücre ihtiva eden bir çözelti üretir. (Buz üzerinde) Matrigel eşit miktarda eklenir ve nihai enjeksiyon solüsyonu hazırlamak için iyice karıştırın. Fare sırtında istenilen pozisyon içine bu çözüm enjekte edilir ve tümörler istenilen boyutta (çoğu hücreler için 2-4 hafta) büyümek için zaman uygun miktarda bekleyin. RF maruz kalma öncesinde, BALB-C Çıplak fareler katı ektopik tümörler 0.5-1 cm çapına taşımalıdır.
3. 1. ANAE tarafından (bu durumda BALB-C çıplak fare) kullanılmak üzere fareler hazırlamakIP enjeksiyon yoluyla ketamin ve ksilazin eden bir çözelti ile sthetizing. Fareler, uykuya dalma olsa da, 37 ° C'de sıcaklığı kontrol edilen bir oda içinde tutmak Toplam 20 fare, tüm rulman benzer boyutta tümörler gerekli olacaktır. No AuNP enjeksiyonları ile her iki grup: geri kalan 10 fare RF-maruz bırakılan ve RF maruz kalan kontrol grubu arasında bölünecektir ise On fare (son olarak adı geçen, sadece PBS enjeksiyonu) ile bağlantılı olarak ve AuNPs olmadan kullanılacaktır.
   2. Bir kez uygun şekilde anestezi, doğrudan bir 27 G iğne ile bir 1-cc şırıngası kullanılarak tümör içine enjekte AuNPs. AuNP Çözelti PBS 0.1 ml 200 mg / L'lik bir konsantrasyonda Au olmalıdır. Enjeksiyonundan sonra, alkollü bir mendille kan emer ve enjeksiyon siteyi silmek için cerrahi bir bez kullanın.
   3. Daha sonra RF jeneratörünün alıcı baş tedavi edilecek olan fare monte edin. Tümör iletim kafasına en yakın olan ve böylece fare konumlandırılmalıdır. Tedavi edilecek olmayan alanları Kalkan, hem de sensibakır şerit ile, bu tür gözler, kulaklar ve ayak parmakları gibi alanları çabaya verilen. Hiçbir yük birikimi oluşur böylece bakır şerit uygun topraklama uçağı temas olduğundan emin olun. Ayrıca, pozlama alan tedavi edilmesi istenen bölgeye boyutundan daha büyük, en az 1 cm'lik bir boşluk olması gerekir.
   4. Pozisyon IR termal kamera tümör ve tedavi alanında görünür böylece. 5 dakika RF açın. Elde edilen sıcaklık eğrisi kaydedilir. Tedavisi derhal sıcaklıkları daha yüksek 42 ° C dur tedavi elde edin.
4. 1. Onlar bilinçli kadar RF maruz kalma sıcak bir odasında anestezi fareler kurtardıktan sonra.
   2. Daha sonra aynı fareler 48 saat ile deneyi (- 3.4.1 3.3.1 adımlar) tekrarlayın.
   3. Deneyden sonra, kurumsal protokolleri ve prosedürlere uygun olarak fareler euthanize. Tümör ağırlığını kaydedin. Histolojik analiz için formalin kullanılarak tümörler düzeltmek ve parafin onları gömmek. Tümör bölümleri tipik haliyle wit boyanırh hematoksilen ve eozin ve ölçme terapötik etkinlik, örneğin Ki-67 ile ilgili hedefler için, vs, kaspaz-3 ayrılır.

Sonuçlar

1.. Bir örnek olarak AuNPs: NP koloitlerin RF ısıtma değerlendirilmesi.

Bölüm 1.1 izledikten sonra - 1.2.3 5 nm ve 10 nm çapında AuNPs son derece konsantre, kararlı, ve saflaştırılmış çözüm bekliyoruz. Stok solüsyonu olarak satın-500 ml kaynaktan, 1.000 mg / L'lik bir konsantrasyonda solüsyonun en azından bir 4 ml elde etmek için beklemek AuNPs ve bu konsantrasyonda plan DI su tampon çözeltisi arasında saatte fark olmalıdır ~ 0.25 ° C / sn 'dir ve Şe...

Tartışmalar

Bu protokoller Deneyciler tam olarak (bu durumda AuNPs) kanser tedavisi için RF kaynaklı hiperterminin artırabilir nano ölçüde analizine izin verir. Birinci protokol spesifik olarak yüksek konsantre edilmiş ve saf hale AuNP örneklerinden ısı üretimini analiz ile ilgilidir. Diğer gruplar öncelikle AuNPs AuNPs kendilerini ^9-11 olup süspanse edilir önbelleklerden ısı üretimini bildirmiştir rağmen, bunların RF sistemleri çaplarda AuNPs düşük konsantrasyonlarda> 10 nm, hem de daha dü?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer