Протоколы для оценки радиочастотных взаимодействий с наночастиц золота и биологических систем для неинвазивной гипертермии лечению рака

Резюме

Описаны протоколы, используемые для исследования взаимодействий 13,56 МГц радиочастотной (РЧ) электрические-поля с золотой наночастицы коллоидов в обоих небиологических и биологических системах (в пробирке / VIVO). Эти взаимодействия находятся под следствием для применения в терапии рака.

Аннотация

Лечения рака, которые являются менее токсичными и инвазивными, чем их существующих аналогов весьма желательны. Использование радиочастотных электрических полей, которые проникают глубоко в тело, вызывая минимальную токсичность, в настоящее время изучается как жизнеспособное средство неинвазивной терапии рака. Предполагается, что взаимодействия РЧ-энергии с интернализованных наночастиц (NPS) может освободить тепло, которое затем может вызвать перегревание (гипертермия) клетки, в конечном счете заканчивается в некроза клеток.

В случае не-биологических систем, мы представляем детальные протоколы, касающиеся количественной оценки высвобождения тепла в высококонцентрированных НП коллоидов. Для биологических систем, в случае экспериментов в пробирке, мы опишем методы и условия, которые должны быть прилипшие к того, чтобы эффективно подвергать раковые клетки радиочастотной энергии без объемных медиа артефактов нагрева существенно закрывающие данных. Наконец, приведем подробной методики Fили в естественных условиях мышиных моделях с внематочной печеночных раковых опухолей.

Введение

Поглощение радиочастотной энергии биологической тканью (в связи с присущей им электрической проницаемости) приводит к температурах повышенных тканей в зависимости от времени, которое в конечном итоге приводит к гибели клеток гипертермии. Предполагается, что рак гипертермия может быть оптимизирована за счет использования целевых наноматериалов, которые позволяли бы в раковой клетке и действуют как RF-тепловых преобразователей, оставляя соседние здоровые, нормальные клетки нетронутыми. Несколько докладов уже показали, что разнообразие ИГ может выступать в качестве эффективных источников тепла РФ, которые помогают в некроза рака ^1-4.

В этом отношении, золотые наночастицы (AuNPs) ^3-5, углеродные нанотрубки ^1, и квантовые точки ^{6, 7} выставлен захватывающие характеристики при использовании в как в пробирке и в естественных экспериментов РФ. Хотя точная природа отопительного механизме этих наночастиц при воздействии ВЧ-области все еще обсуждается, серияфундаментальные эксперименты с использованием AuNPs уделяет большое значение как на размер НП и агрегации государств. Было показано, что только AuNPs с диаметром <10 нм будет нагреваться при воздействии РЧ поля ^8. Кроме того, этот механизм нагрева значительно ослабляется, когда AuNPs агрегируются. Это условие агрегации также подтверждено в моделях в пробирке, что размещенных важность при оптимизации AuNP коллоидной стабильности в endolysomal внутриклеточным для действенного РФ терапии ^4. Тем не менее, методы и экспериментальные принципы, используемые для сбора и оценки этих данных может быть проблематичным, особенно в случае проверки анкет тепла РФ от НП коллоидов.

Несколько докладов показали, что джоулев нагрев фонового ионного подвески, что наночастицы подвешены в может быть основным источником производства тепла РФ, а не сами ^9-12 НЧ. Хотя наша недавняя работа ⁸ утверждало тон использовать радиочастотных взаимодействий в генерации тепла от AuNPs диаметров менее 10 нм, мы стремимся, чтобы описать эти протоколы более подробно в этой статье.

Мы также продемонстрировать протоколы и методы, необходимые для оценки эффективности AuNPs как гипертермических тепловых агентов в в пробирке и в естественных условиях экспериментов для моделей рака печени. Хотя мы ориентированы прежде всего на простых коллоидов цитрата крышками AuNPs, те же методы могут быть применены к другим гибридов AuNP, таких как антитела и химиотерапии, конъюгированным комплексов. Придерживаясь этих принципов экспериментатор должен, мы надеемся быть в состоянии быстро оценить потенциал для любого наноматериала быть эффективным РФ вызванной тепловой гипертермическая агент.

протокол

Полный обзор экспериментальный изображен на рисунке 1.

Более подробная информация представлены на шаги 1-3 ниже.

1. Оценивая РФ Подогрев НП коллоидов: AuNPs В качестве примера

1. В общем, для каждого образца NP исследуется, сначала промыть образцы несколько раз через фильтр центрифугирования деионизированной (DI) водой, чтобы удалить фоновые ионы и примеси. Все ионы и примеси будут удалены из суспензии AuNP когда жидкость вымывания имеет аналогичные скорости нагрева РЧ (часы) в качестве дистиллированной воды. Этот процесс очистки позволяет также более высоких концентрациях наночастиц, которые будут получены. Стоит отметить, что, хотя использование AuNPs в этом примере, основные принципы могут быть применены к другим материалам НП.
2. В качестве примера, очищают на 500 мл бутылку коммерчески доступных AuNPs диаметром 5 нм, а затем подвергнуть их на 13,56 МГц РЧ электрического поля-Fiполем сила 90 кВ / м.
   1. Возьмите ~ 125 мл из раствора складе AuNP и раскола между шестью 50 кДа центрифуги рукава фильтра. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту. в течение 2 мин 5 сек. Удалить отфильтрованные буфера и пополнения фильтры с большим маточного раствора. Повторяйте, пока все 500 мл не был отфильтрован.
   2. Заменить отфильтрованный буфер с аналогичным объемом дистиллированной водой и повторить примерно 8 раз (или до тех пор, отфильтрованные буферные РФ HRs не эквивалентны дистиллированной воды). Обратите внимание, UV-Vis анализ также может быть использован для мониторинга загрязнений пики поглощения. Как только буфер загрязнители были полностью удалены, пипетки примерно 0,5 мл ДИ воды в каждый фильтр и ресуспендируйте AuNPs повторным пипетированием. Это должно полностью удалить AuNPs из фильтра и обеспечить полный ресуспендированием. Смешайте все шесть суспензий в один 15 мл трубки Эппендорф.
   3. После того, как AuNPs были очищены и концентрируют, анализировать примера с использованием ICP-OES и / или ИСП-МС, UV-VIS и Зета потенциал для данных о concentratioн и стабильность Н.П., соответственно. SEM и / или анализ ПЭМ также могут быть использованы для получения морфологические данные. Подробное пробоподготовки для этих методов можно найти в литературе ^4.
3. Использование системы Kanzius РФ, описанную в предыдущих исследованиях ⁸ или дифференцирования этой системой, место для 1,3 мл цилиндрическую кварцевую кювету таким образом, чтобы электрического поля РФ в воздухе (без образца настоящее время) будет ~ 90 кВ / м внутри кюветы. Для стандартного образца солевом растворе (0,9% NaCl) электрического поля будет снижена до ~ 1,1 кВ / м. Таковы приблизительные условия, используемые для обеспечения сравнения должен быть заключен между различными системами.
   1. Пипетка 1,3 мл 1000 мг / л очищенной пробы AuNP коллоида в кварцевую кювету и ввести это в ВЧ-поле. Это может быть сделано с помощью специально построенный держатель образца тефлон. Защиту образец в ВЧ-поле в течение 120 сек или пока образец достигает 70 ° С, чтобы предотвратить электрическую дугу или бурного кипения. Калифорнияpture данные тепловизионных (а также области управления) с помощью ИК-камера & соответствующее программное обеспечение. Повторите эту процедуру три раза.
   2. Фильтр образца через другой фильтр центрифуги 50 кДа, чтобы извлечь AuNPs из буфера дистиллированной воды. Re-подвергайте буфер для ВЧ-поле, снова три раза. Разница в часах между коллоида AuNP и фоновой DI воды буфера определяет HR из-за самих AuNPs. Ожидайте получения-часового ~ 0,3 ° С / сек и 0,05 ° C / сек дать AuNP зависимую HR в ~ 0,25 ° C / сек. Ресуспендируют оставшиеся AuNPs из фильтра в 1,3 мл воды для лабораторного естественных условиях экспериментов /.

2. Наночастиц при содействии РФ гипертермии: в пробирке исследования

1. Эти исследования в пробирке может быть применен к любому типу рака типа клеток, которые образуют 2D монослоев. В этом эксперименте использовать человеческий гепатоцеллюлярной карциномы, полученных Hep3B клетки.
   1. Тарелка ~ 50000 челлс в передних трех лунках 12-луночного планшета с 1 мл питательной среды. Повторите это 6 раз (использовать три пластины для исследований NP и три тарелки в качестве контроля). Выдержите на 37,5 ° С в течение 24 ч перед введением NPS. Стерилизовать NPs первом использовании биобезопасности кабинета УФ-освещенности в течение 5 мин.
   2. В каждую лунку внести 0,1 мл раствора 1,000 мг / л AuNP и оставить еще на 24 часов. Добавить 0,1 мл воды в каждую лунку трех пластин контрольных клеток, а также оставить в течение 24 часов.
   3. После 24 часа в сутки прошли, аспирация клеточные СМИ и промыть PBS, чтобы удалить любые поверхностные переплете AuNPs. Замените клеток СМИ. Клетки готовы к радиочастотному воздействию.
2. Место каждого пакета клеток 12-а в РФ-поле. Подождите, пока клетки не охлаждают до 31 ° С. Включите генератор РФ и подвергнуть в течение 3,5 мин. Конечная температура клеточных сред будет ~ 37 ° C. Выключите радиочастотное поле. Удалить ячейки и поместить их в инкубаторе в течение 24 ч до проведения анализа.
   1. Удаление клеток из инкубатора и средств массовой информации аспирации клеток. Добавить 1,6 мл клеточной массовой информации в каждую лунку, а в 0,4 мл МТТ реагента. Инкубируйте клетки в течение 4 часов. Аспирируйте СМИ и заменить с 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Поместите клеток пластины на скамейке коромысла и оставить на 10 мин, чтобы позволить ДМСО для растворения МТТ реагентов. Наконец, пипетки 100 мкл в каждую лунку в 96-луночный планшет и оптически считывать также при 570 нм с использованием планшет-ридера, такие как планшет-ридере SPECTROstar Nano.

3. Наночастиц при содействии РФ гипертермии: IN VIVO исследования

1. Эти естественных условиях исследования в может быть применен к любому типу рака, который образует твердые опухоли в ортотопической или эктопической мышиной модели. Этот эксперимент использует Hep3B раковые клетки печени в внематочной BALB-C Обнаженная модель мыши опухоли.
2. Примечание: все естественных условиях эксперименты в выполнены в соответствии со всеми соответствующими руководящими принципами, правилами и регулирующими органами. Кроме того, протокол, демонстрируется была выполнена под руководством и утверждения Техасского университета MD Anderson Cancer центров по уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC).
   1. Grow соответствующее количество клеток (~ 100 К) в колбе для культивирования тканей с соответствующей ростовой среды. Выдержите в инкубаторе 37 ° C с 5% CO ₂ в течение всего срока клеточной культуре.
   2. Treat клетки трипсином (для отсоединения из колбы) и производить раствор 2000000 клеток на каждые 25 мкл. Добавить равное количество Матригель (на льду) и тщательно перемешать, чтобы подготовить окончательное решение впрыска. Введите это решение в нужное положение на спине мыши и ждать соответствующего количества времени для опухоли расти до нужного размера (2-4 недели для большинства клеток). Перед воздействия РЧ, BALB-C Голые мыши должны нести твердых внематочной опухолей 0,5-1 см в диаметре.
3. 1. Подготовка мышей, которые будут использоваться (в данном случае BALB-C голых мышей) по anaesthetizing их с раствором кетамина и ксилазина путем инъекции IP. В то время как мыши, засыпаете, держать их в камеру с контролируемой температурой при 37 ° С 20 мышей в общей сложности будут необходимы, все несущие подобные опухоли размера. Десять мышей будет использоваться в сочетании с и без AuNPs (последний только инъекции PBS), а остальные 10 мышей будут разделены между РФ-инфицированными и не являющимися РФ, подвергшихся воздействию управления: обе группы без каких-либо AuNP инъекций.
   2. После того, как правильно анестезировали, впрыснуть AuNPs непосредственно в опухоль с использованием 1-CC шприц с иглой 27 G. Решение должно быть AuNP в концентрации Au 200 мг / л в 0,1 мл PBS. После инъекции, использовать хирургическую тампон, чтобы поглотить кровь и протрите место инъекции спиртом.
   3. Затем установите мышь, чтобы лечиться на приемной главы ВЧ генератора. Мышь должна быть расположена таким образом, что опухоль находится ближе всего к голове передачи. Щит области, которые не должны быть обработаны, а также чувствительностьTive такие области, как глаза, уши и пальцы ног, с медной ленты. Будьте уверены, что медная лента соответствующим контакте с заземляющим плоскость так, чтобы взимать плату наращивание не происходит. Кроме того, область экспозиции должны быть зазор не менее 1 см, превышающих размер требуемого лечения.
   4. Позиция ИК тепловизионная камера так, что опухоль и область лечения могут видеть. Включите РФ в течение 5 мин. Запишите результирующую кривую температуры. Если терапия достигает температуры больше, чем 42 ° C лечения немедленно прекратить.
4. 1. После экспозиции РФ восстановить мышей от анестезии в теплой камере, пока они не осознают.
   2. Повторите эксперимент с тем же мышам 48 часов позже (шаги 3.3.1 - 3.4.1).
   3. После эксперимента мышей эвтаназии в соответствии с институциональными протоколы и процедуры. Запись веса опухоли. Для гистологического анализа исправить опухоли с использованием формалина и вставлять их в парафин. Опухолевые разделы, как правило, окрашивали остроумиеч гематоксилином и эозином и для целей, имеющих отношение к затворения терапевтической эффективности, например Ki-67, расщепляется каспазы-3, и т.д..

Результаты

1. Оценка высокочастотного нагрева НП коллоидов: AuNPs в качестве примера.

После выполнения раздел 1.1 - 1.2.3 рассчитывать на высокой концентрацией, стабильную и очищенную раствор 5 нм и AuNPs диаметра 10 нм. Из 500 мл качестве купленных маточного раствора, ожидают получить по крайней...

Обсуждение

Эти протоколы позволяют экспериментатор полностью проанализировать, в какой степени наноматериалы (в данном случае AuNPs) может увеличить РФ гипертермии для лечения рака. Первый протокол конкретно касается анализа производства тепла из высококонцентрированных и очищенных образцов AuNP....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer