비 침습 온열 암 치료를위한 금 나노 입자 및 생물 시스템과 고주파의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

요약

우리는 13.56 MHz의 고주파 (RF)의 상호 작용을 조사하는 데 사용되는 프로토콜을 설명하는 두 비 생물학적, 생물학적 시스템 (생체 외 / 생체)의 금 나노 입자 콜로이드와 전기 분야. 이러한 상호 작용은 암 치료에 응용 프로그램에 대한 조사를 받고 있습니다.

초록

기존에 비해 독성이 덜하고 침략 암 치료는 매우 바람직하다. 최소한의 독성을 일으키는 깊이 체내에 침투 RF 전기 필드의 사용은, 현재 비 침습성 암 치료의 유력한 수단으로 연구되고있다. 이는 나노 입자를 내재화 공단과 RF 에너지의 상호 작용이 궁극적으로 세포 괴사로 끝나는, 다음 셀 (고열)가 과열 될 수있는 열을 해방시킬 수있는 것이 구상된다.

비 생물학적 시스템의 경우, 우리는 고농도 NP 콜로이드에 의해 해방 된 열을 정량화에 관한 자세한 프로토콜을 제시한다. 생물학적 시스템의 경우, 시험 관내 실험의 경우, 우리는 효율적으로 크게 데이터를 모호하게 대량 미디어 난방 유물없이 RF 에너지에 암 세포를 노출하기 위해 준수해야하는 기술과 조건을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 상세한 방법론 F 줄또는 이소성 간 암 종양 생체 마우스 모델에서.

서문

(때문에 고유의 전기 유전율) 생체 조직에 의한 RF 에너지의 흡수는 결국 고열에 의해 세포 죽음에 이르게 시간의 함수로 높은 조직의 온도에서 발생합니다. 그것은 암 고열이 암세포 내에 내부화 그대로 인접 건강한, 정상 세포를 남기고 RF-열 변환기로서 작용 대상 나노 물질의 사용을 통해 최적화 될 수 있다고 가정한다. 몇몇 보고서는 이미 국민 연금 다양한하는 암 괴사 ^1-4 원조 효과적인 RF 열원의 역할을 할 수있는 것으로 나타났습니다.

이들 관해서, 금 NP에 (금 나노 입자) ^3-5, 탄소 나노 튜브 ¹ 및 양자점 ⁰⁶ 모두 시험 관내 및 생체 내 RF 실험에 사용될 때 ^{7 흥미로운} 특성을 나타내왔다. RF 필드에 노출이 된 NP의 가열기구의 정확한 특성은 여전히​​ 논의되고 있지만, 일련의금 나노 입자를 사용하여 기본적인 실험은 NP의 크기와 응집 상태 모두에서 큰 의미를 두었다. 그것은 RF 필드 ^8에 노출되면 직경 <10 nm의 만 금 나노 입자를 가열 할 것으로 나타났다. 금 나노 입자가 응집되는 경우이 가열기구는 크게 감쇠된다. 이 집계 조건은 효과적인 RF 치료 ⁴ endolysomal 세포 구획 내에서 AuNP 콜로이드 안정성을 최적화에 중요성을 배치 체외 모델 내에서 확인되었다. 그러나,이 데이터를 수집하고 평가하는 데 사용되는 기술과 실험 원리 특히 NP 콜로이드로부터 RF 열 프로파일을 검증하는 경우에 문제가 될 수있다.

몇몇 보고서는 국민 연금이있는 일시 중단 배경 이온 정지 줄 난방의 주요 RF 열 생산의 소스가 아닌 국민 연금 자체 ^9-12 될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리의 최근 종이 ^(8)는 t을 확인했지만그는 10 ㎚ 이하의 직경의 금 나노 입자의 열을 생성하는 RF 상호 작용의 사용, 우리는이 문서를 통해보다 자세히 이러한 프로토콜을 설명하는 것을 목표로하고 있습니다.

또한 프로토콜 및 시험 관내 및 간암 모델 생체 내 실험에서 모두 온열 열 보호제로서 금 나노 입자의 효과를 평가하기 위해 필요한 기술들을 설명한다. 우리는 구연산 덮인 금 나노 입자의 간단한 콜로이드에 주로 초점을하지만, 동일한 기술은 항체 및 화학 요법 복합 단지와 같은 다른 AuNP 하이브리드에 적용 할 수 있습니다. 이러한 원칙을 준수하여 실험자 희망 빠르게 효과적인 RF 유도 열 온열 요원이 될 수있는 나노 물질에 대한 가능성을 평가 할 수 있어야한다.

프로토콜

완전한 실험 개요는도 1에 도시된다.

더 자세한 사항은 아래의 1-3 단계에 묘사되어있다.

1. NP 콜로이드의 평가 RF 난방 : 예를 들어 금 나노 입자

1. 일반적으로, 각각의 NP 샘플이 조사되고 들면 제 배경 이온 및 오염 물질을 제거하는 탈 이온 (DI) 물로 원심 분리 필터를 통해 샘플을 여러 번 세척 하였다. 모든 이온과 오염 물질이 씻겨되는 액체가 DI 워터와 유사한 RF 가열 속도 (시간)이 AuNP 현탁액에서 제거 된 것입니다. 이러한 정제 공정은 얻어지는 NP에 높은 농도를 허용. 이것은이 예에서 금 나노 입자를 사용하지만, 기본 원리는 다른 NP 재료에 적용 할 수 있다는 것을 주목할 가치가있다.
2. 예를 들어, 지름 5 ㎚의 상업적으로 이용 가능한 금 나노 입자의 500 ㎖ 병을 정화하고 전기 무선 인터넷의 13.56 MHz의 RF 필드에 대상ELD 강도 90 kV의 / m.
   1. ~ 여섯 50 kDa의 원심 분리기 필터 튜브 사이의 주식 AuNP 솔루션 및 분할에서 125 mL를 취하여. 3,000 rpm에서 원심 분리기. 2 분 5 초. 더 원액을 여과 버퍼와 리필 필터를 제거합니다. 모두 500 ㎖를 여과 될 때까지 반복합니다.
   2. DI 물과 비슷한 양으로 필터링 된 버퍼를 교체하고 약 8 배 (또는 필터링 된 버퍼 RF의 시간 DI 물에 해당 될 때까지)를 반복합니다. UV-VIS 분석은 또한 오염물 흡수 피크를 모니터링하는 데 사용될 수 있습니다. 버퍼 오염 물질은 완전히 각 필터로, 피펫 약 0.5 ml의 DI 물을 제거하고 반복 피펫 팅에 의해 금 나노 입자를 재현 탁하고 나면. 이것은 완전히 필터에서 금 나노 입자를 제거하고 전체 재 부유를 허용해야합니다. 한 15 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 여섯 현탁액을 결합합니다.
   3. 금 나노 입자는 정제, 농축 한 후, I​​CP-OES 및 / 또는 ICP-MS, UV-VI와 concentratio의 데이터에 대한 제타 전위를 사용하여 샘​​플을 분석N과 순이익 안정성, 각각. SEM 및 / 또는 TEM 분석은 형태 학적 데이터를 얻기 위해 사용될 수있다. 이러한 기술에 대한 상세한 샘플 준비는 문헌 ^4에서 찾아 볼 수있다.
3. Kanzius RF의 이전 연구 ^8에 설명 된 시스템, 또는이 시스템의 유도, (아무 샘플 현재에) 공기 RF 전기장이 될 수 있도록 1.3 ㎖의 원통형 석영 큐벳을 배치 ~ 큐벳 내부 90 kV의 / M을 사용. 표준 식염수 샘플 (0.9 % 염화나트륨) 전기 필드 ~ 1.1 kV의 / m로 감소 될 것이다. 이러한 비교는 서로 다른 시스템간에 이루어질 수 있도록하는 데 사용되는 대략적인 조건이다.
   1. 피펫 석영 큐벳에 정제 AuNP 콜로이드의 1,000 ㎎ / ℓ의 시료 1.3 ㎖ 및 RF 필드에이를 소개합니다. 이렇게 맞춤형 테플론 샘플 홀더를 사용하여 수행 할 수있다. 120 초 동안 또는 샘플이 전기 불꽃 또는 빠른 비등을 방지하기 위해 70 °의 C에 도달 할 때까지 RF 필드에 샘플을 노출. 캘리포니아IR 카메라 및 관련 소프트웨어를 사용하는 열 화상 화 데이터 (뿐만 아니라 제어 분야) pture. 이 과정을 세 번 반복합니다.
   2. DI 물 버퍼에서 금 나노 입자를 추출하는 다른 50 kDa의 원심 분리 필터를 통해 샘플을 고를. 세 번 다시, RF 필드에 버퍼를 재 노출. AuNP 콜로이드와 배경 DI 물 버퍼 사이의 홈런의 차이로 인해 금 나노 입자 자신에게 인사를 결정합니다. ~의 홈런을 얻을 것으로 예상 0.3 ° C / 초와 ~ 0.25 ° C / 초 AuNP 따라 HR을 제공하기 위해 0.05 ° C / 초. 생체 외 / 생체 실험에 1.3 ㎖의 물을 필터에 남아있는 금 나노 입자를 재현 탁.

2. 나노 입자를 이용한 RF 유도 고열 : 체외 연구

1. 이러한 시험 관내 연구는 2 차원 단일 층을 형성하는 암 세포 유형 중 어느 타입에 적용될 수있다. 이 실험에서 인 Hep3B 세포 유래 인간의 간세포 암을 사용합니다.
   1. 플레이트 ~ 50,000 CEL성장 배지 1 ㎖와 12 - 웰 플레이트의 앞 세 개의 우물에 LS. 이 6 번 (컨트롤로 NP 연구를위한 3 개의 판과 3 개의 판을 사용)을 반복합니다. NPS를 도입하기 전에 24 시간 동안 37.5 ° C에서 알을 품다. 5 분 동안 바이오 안전성 내각 UV 빛 노출을 사용하여 첫 번째 NPS를 소독.
   2. 각에 잘 1,000 ㎎ / L AuNP 솔루션의 0.1 ML을 소개하고 또 다른 24 시간 동안 둡니다. 세 제어 셀 플레이트의 각 웰에 물 0.1 ㎖를 추가하고 또한 24 시간 동안 둡니다.
   3. 24 시간이 경과 한 후, 세포 미디어를 대기음 및 표면 바인딩 된 금 나노 입자를 제거하는 PBS로 세척. 세포 미디어를 교체합니다. 세포는 현재 RF 노출에 대한 준비가되어 있습니다.
2. RF 필드에서 각 12도 전지 팩을 넣습니다. 세포가 31 ° C로 냉각 될 때까지 기다립니다 RF 발생기의 전원을 켜고 5 분 동안 노출. 세포 미디어의 최종 온도는 ~ 37 ℃가 될 것입니다 RF 필드를 끕니다. 세포를 제거하고 분석하기 전에 24 시간 동안 인큐베이터에 배치합니다.
   <리> 보육 및 대기음 세포 미디어에서 세포를 제거합니다. MTT 시약 0.4 ml로 잘뿐만 아니라 각 셀 매체의 1.6 ML을 추가합니다. 4 시간 동안 세포를 품어. 대기음 매체 및 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 중에서 2 ㎖로 대체. 벤치 로커의 셀 플레이트를 놓고 DMSO는 MTT 시약을 용해 할 수 있도록 10 분 동안 둡니다. 마지막으로, 광학적으로 피펫 100 개의 96 - 웰 플레이트에 각 μL와는 SPECTROstar 나노 플레이트 리더로 ​​플레이트 리더를 사용하여 570 nm에서 잘 읽어 보시기 바랍니다.

3. 나노 입자를 이용한 RF 유도 고열 : 생체 내 연구

1. 이러한 생체 내 연구는 동소 또는 자궁외 쥐 모델에서 고형 종양을 형성하는 암의 유형에 적용 할 수 있습니다. 이 실험은 이소성 종양 BALB-C 누드 마우스 모델에서 인 Hep3B 간암 세포를 사용한다.
2. 참고 : 모든 생체 실험은 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행. 또한, 설명하는 프로토콜은 텍사스 대학 MD 앤더슨 암 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의지도와 승인하에 수행되었다.
   1. 적절한 성장 배지와 조직 배양 플라스크에서 세포의 적절한 수 (100 ~ K)을 성장한다. 세포 배양 기간 동안 5 % CO _2와 37 ° C 배양기에서 배양한다.
   2. 트립신 (플라스크에서 분리)와 세포를 치료하고 매 25 μL에 대한 2 백만 세포의 솔루션을 생산하고 있습니다. (얼음) 리겔의 동일한 양을 추가하고 최종 주입 용액을 제조 잘 혼합. 마우스의 뒷면에 원하는 위치에이 솔루션을 주사하고 종양이 원하는 크기 (대부분의 세포에 대한 2-4 주)에 성장하는 시간의 적당량을 기다립니다. RF 노출 전에, BALB-C 누드 마우스는 고체 자궁외 종양에게 0.5 cm 직경를 부담해야한다.
3. 1. anae 의해 (이 경우 BALB-C 누드 마우스) 사용되는 마우스를 준비IP의 주사 케타민과 자일 라진의 솔루션을 sthetizing. 쥐가 잠 동안, 37 ℃에서 온도 조절 실에 보관 총 20 마우스는 모든 베어링과 유사한 크기의 종양이 필요합니다. 더 AuNP 주사로 두 그룹 : 나머지 10 마우스는 RF 노출 및 비 RF 노출 컨트롤 사이에 분할됩니다 동안 열 마우스 (후자 인 PBS 주사 만)와 함께 및 금 나노 입자없이 사용됩니다.
   2. 일단 적절히 마취 직접 27 G 바늘로 1-CC 주사기를 이용하여 종양에 금 나노 입자를 주입. AuNP 솔루션은 PBS 0.1 ㎖에 200 ㎎ / L의 오 농도에 있어야합니다. 분사 후 닦아 알코올을 혈액을 흡수하고 주사 부위를 닦아 수술 면봉을 사용합니다.
   3. 그런 RF 발생기의 수신 머리에 처리 될 마우스 마운트. 종양이 전송 머리에 가장 가까운 수 있도록 마우스가 위치해야합니다. 피 처리되지 않은 영역을 차폐뿐만 아니라 센시구리 테이프로, 같은 눈, 귀, 발가락 등의 분야를 세 심하게 배. 아무 책임도 상승이 발생하지 않도록 구리 테이프가 적절하게 접지면과 접촉되어 있는지 확인합니다. 또한, 노광 영역은 원하는 치료 부위의 크기보다 적어도 1cm의 간격이 있어야.
   4. 위치 IR 열 화상 카메라 종양 치료 영역이 표시되도록. 5 분 동안 RF를 켭니다. 그 결과 온도 곡선을 기록한다. 치료는 즉시 온도보다 42 ° C의 정지 처리를 실현합니다.
4. 1. 그들은 의식이 될 때까지 RF 노출은 따뜻한 실에서 마취에서 마우스를 복구 한 후.
   2. 나중에 같은 쥐 48 시간과 실험을 (- 3.4.1 3.3.1 단계)를 반복합니다.
   3. 실험 후, 기관 프로토콜 및 절차에 따라 마우스를 안락사. 종양의 무게를 기록한다. 조직 학적 분석을 위해 포르말린을 사용하여 종양은 고정 및 파라핀을 포함 할 수 있습니다. 종양 섹션은 일반적으로 재치 더러워H의 헤 마톡 실린 및 에오신 및 계측 치료 효과, 예를 들어, KI-67와 관련된 대상에 대해는, 등 카스파 제 3을 절단.

결과

1. 예를 들어 금 나노 입자 : NP 콜로이드의 RF 가열을 평가.

1.1 절 다음 한 - 1.2.3을 5 나노 미터, 10 나노 미터 직경의 금 나노 입자의 고도의 집중, 안정, 정제 솔루션을 기대합니다. 원액을 구입 한 그대로, 500 ㎖에서 1000 ㎎ / L의 농도에서 용액의 적어도 4 밀리리터를 구하는 것이 기대 금 나노 입자와이 농도의 배경 DI 물 완충 용액 사이의 홈런의 차이는해야 ~ 0.25 ° C / 초 및

토론

이러한 프로토콜은 실험자 완전히 (이 경우는 금 나노 입자) 암 치료를위한 RF 유도 고열을 증가 할 수있는 나노 정도를 분석 할 수있다. 첫 번째 프로토콜은 특히 고농도 정제 AuNP 샘플에서 열 생산을 분석 다룬다. 다른 그룹은 주로 금 나노 입자는 금 나노 입자 자체 ^9-11 아니라 현탁 버퍼로부터 열 생산을보고되었지만, 그들의 RF 시스템은 직경이 금 나노 입자의 낮은 농도> 10 ㎚뿐만 아?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
500 ml gold nanoparticles (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml and 15 ml volumes)
MEM X1 Cell Culture Media	Cellgro	10-101-CV	(add extra nutrients as necessary)
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135-500 ml
Copper Tape	Ted Pella	16072
Equipment
Kanzius RF System (13.56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
IR Camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA)	Contact FLIR
1.3 ml Quartz Cuvette	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
Teflon Sample holder with Rotary Stage	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
Zetasizer	Malvern	Zen 3600 Zetasizer