蛋白质纯化方法测定结合亲和力微尺度热泳

摘要

可广泛用于微型热泳（MST）无需纯化从细胞裂解液中的目标蛋白的结合亲和力的测定。该协议涉及过表达GFP融合蛋白，在非变性条件下的细胞裂解，MST信号检测在不同浓度的配体的存在下。

摘要

蛋白质相互作用的定量表征是在几乎任何领域的生命科学，特别是药物发现至关重要。 K _D测定所需要的现有的方法获得纯化的蛋白质，还代可以是费时和昂贵的。我们已经开发出一种测定结合亲和力的微尺度热泳（MST）协议，允许未经纯化的目标蛋白从细胞裂解液。该方法涉及过表达GFP的融合蛋白，在非变性条件下的细胞裂解。该方法应用到STAT3-GFP瞬时表达在HEK293细胞中的第一次，以确定具有不同序列的寡核苷酸的充分研究的转录因子的亲合性的。该协议是简单的，并且可以有各种不同的应用研究小分子，肽，DNA，RNA的蛋白质的相互作用，和对roteins。

引言

亲和力的分子间相互作用的定量表征是非常重要的生物医学研究在许多领域。约束力的解离常数（K _D）是必不可少的，不仅在药物发现的，但也是一个重要的参数，表征任何生物系统中的任何二进制的相互作用。生化用于检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法，如免疫沉淀和酵母双杂交筛选，不告知我们这些交互是多么紧张，而亲和定义，这是否存在特别复杂的给定条件下体内 。在药物发现过程中，结合法的发展是必要的，往往是最耗时的步骤之一。 _杀敌测定最常用的方法包括荧光偏振，表面等离子体共振（SPR）技术^，2放射配体结合^，3温滴定量热平衡态^，4透析（ED），超滤（UF），第⁵和超速离心（UC）。他们需要纯化的靶蛋白的数量显著。微量热泳（MST）是一个迅速发展的方法，该方法检测在一个微小的温度梯度定向的分子运动。任何更改的运动沿温度梯度的相对变化的生物分子导致的水合壳^8，7 MST是用来确定结合亲和力，并已申请了荧光标记的蛋白质或荧光配体的配体结合研究靶蛋白。 ⁹ MST允许直接在溶液中的相互作用的测量，而不需要固定到表面上（无固定技术）。实际上，任何有约束力的MST信号的变化是伴随着的大小变化，虽然从系统到系统的显着不同。对于检测MST分子运动，他们必须荧光NT。这种方法的主要限制，可以变成优势。如果在任何系统中作为GFP融合蛋白的表达，它是唯一的荧光分子，从而可以从细胞溶胞产物不经分离或无细胞表达系统研究。代约束条件允许以最少的文物的细胞裂解液中的主要挑战。在这里，我们描述了一个协议，可用于许多可溶性蛋白和膜蛋白的细胞裂解物的制备和MST实验。

STAT蛋白是潜在的胞质转录因子激活的酪氨酸磷酸化胞外信号响应和参与许多生物过程，包括免疫，造血，炎症，和发展^10，在哺乳动物，STAT家族由STAT 1，2，3，4的，5A，5B，和6。所有激活的统计数据绑定到相同的DNA序列，所谓的气体图案，IFN-γ的激活序列。然而，transcri不同统计的ptional效果有很大的不同^。11尽管在许多病理过程中的参与和广泛的研究，产生超过17,000出版物，K _D STAT相互作用不同的DNA序列尚未确定。只有相对亲和力不同的统计变种天然气动机特点^。11蛋白表达和纯化困难是表征统计的DNA结合选择性的主要障碍。虽然大多数研究都集中在"激活"的统计资料，这成了转录因子酪氨酸磷酸化，非磷酸化的统计（U-统计）转录调控作用的作用正在迅速崛起。 ^然而 ，这些机制的了解甚少，不清楚是否实际上U-统计与DNA结合，或通过与其他转录因子的相互作用行事。最近，我们已经表明，U-STAT3可以绑定到DNA顺序CES不同气图案具有更高的亲和力^。13的发现具有重大意义，为我们理解这一重要蛋白质的生物学功能。我们应用微尺度热泳，确定相对亲和力STAT3气和AT丰富的寡核苷酸Ş+100（ 图4）。几乎相同的协议被用于不同的的STAT3的配位体，脂肽类抑制剂的结合在K _D测定¹⁴否将关联的转录因子，作为阴性对照，使用GFP-STAT1结合从而证实选择性相互作用时，可检测到的。 ¹⁴

研究方案

1。细胞裂解液的制备

该协议的目的是，粘附细胞，任何GFP融合蛋白表达。所需的细胞数可以从低至10 ⁶到多达20×10 ⁶细胞，这取决于蛋白质表达的水平上。例如，裂解的HEK细胞过表达GFP-STAT3的准备处理10 T75烧瓶中生长的细胞裂解液用1毫升至70％附近汇合。然而，这种裂解液稀释150倍，以提供最佳的荧光水平MST实验。根据调查的性质和细胞内的蛋白质的本地化强烈地依赖于细胞裂解协议。超声描述如下，如果使用清洁剂，是不可取的，因为蛋白质的不稳定性，可能是​​最好的选择。不同的添加剂可以被添加到的裂解缓冲液中，以防止蛋白质修饰反应:乙二胺四乙酸防止磷酸化，钒酸钠抑制蛋白酪氨酸磷酸酶，所以dium氟化物是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂。

1. 准备裂解液。对于下面的组合物易于提取胞浆蛋白效果很好的25mM三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH值8.0，和蛋白酶抑制剂混合物稀释100倍（Sigma-Aldrich公司P2714，由2毫米AEBSF，0.3μM抑肽酶，130μM乌苯美司， 1 mM的EDTA，14微米E-64，1微米亮肽素）。另外，对于减可溶性蛋白，可以使用商业的RIPA缓冲液，蛋白酶抑制剂鸡尾酒和非变性洗涤剂。将缓冲区保持在冰上。
2. 简要地用冰冷的PBS，用10毫升每T75烧瓶中的缓冲液洗涤细胞。细胞置于冰上5分钟，或直至细胞开始从烧瓶中分离。刮细胞与细胞刮刀，如果有必要分离。
3. 悬浮细胞在10毫升冰冷的PBS和转移到预冷的14毫升圆底离心管。
4. 沉淀细胞在4℃下以400〜600×g离心5分钟。结合细胞从几个瓶中，在这一点上我f需要。
5. 删除PBS上清，加入200μl冰冷的裂解缓冲液重悬沉淀，将悬浮液转移到一个预先冷的1.5毫升的Eppendorf管。
6. 细胞置于冰上，以减少局部过热。裂解细胞的3倍10秒的超声脉冲在30％幅度，用一个2-3毫米预冷尖。保持在表面之下的前端，以尽量减少起泡。使用洗涤剂时的缓冲区，并在冰上孵育30分钟，而不是省略这一步。
7. 正确的裂解液，如果需要使用5 M氯化钠含有生理浓度盐（氯化钠100毫米）。
8. 通过离心分离收集溶胞产物于4℃在26000×g离心10分钟。
9. 确定最佳的溶胞产物稀释（在下面的第3节中所描述的）和所需的滴定（通常大约300μl的预稀释的溶胞产物）的细胞裂解液的量。
10. 等分试样的溶胞产物和存储在温度适合接受调查的蛋白质（-80℃，在大多数情况下）。

2。 MST缓冲器选择和准备

1. 由于蛋白 - 配体的相互作用依赖于缓冲液条件下，MST缓冲组合物的选择是基于一个特定系统的属性。它一般是有利的，至少两种不同的缓冲液进行测试。
2. 准备5倍MST缓冲区。我们有很好的经验，这两种成分:的HEPES（250毫米HEPES，pH值7.4; 25毫米氯化镁_2，500 mM氯化钠，0.25％NP-40）和三羟甲基氨基甲烷盐酸（250毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸，pH值7.4，氯化钠750毫米，50毫米氯化镁₂ 0.05％吐温20）。此外，BSA（结合混合物在最后的5％）可以帮助防止粘连蛋白塑料管和玻璃毛细管。 NaN ₃的（0.5毫摩尔），也可以包括在内，以防止微生物的生长。

3。优化裂解液稀释的测定

1. 选择LED的激励源，具有波长λ= 470nm的上MST仪器。
2. 加载毛细血管与CE会提取稀释2倍和10倍，MST缓冲。
3. 执行"查找毛细血管"的操作对MST仪器控制软件。在稀释的溶胞产物的最佳荧光范围是从400到1500荧光单位。

4。的优化配体的浓度范围的测定

1. 的配位体的最高浓度应该是至少20倍高于预期的解离常数。
2. 最低的配位体的浓度应低于摩尔浓度的荧光蛋白。

请参阅配体浓度范围内估计的NanoTemper技术集中搜索工具。

5。细胞裂解液的制备和配体的稀释

1. 将需要数（通常为10-16）0.5毫升低吸附离心管冰管架。移取25μl的的MST缓冲液每根管子的底部。股票的配位体溶液中加入25μl的第一桶ë键（＃1，配位体的最高浓度），并进行串行使用的管的其余部分的配位体的2倍稀释。保持机架配体冰样品。
2. 慢慢地在冰上解冻细胞裂解液。
3. 与MST缓冲液稀释的细胞裂解物的荧光靶蛋白的结合反应中，以提供最佳水平。最终蛋白质浓度应该是接近预期的K _D或更低。最终的解决方案中，应调整，以取得必要数量的荧光计数。 GFP-STAT3的溶胞产物中的浓度的测定，该仪器校准的荧光素与帮助。绿色荧光蛋白的溶胞产物中的摩尔浓度测定使用荧光素和绿色荧光蛋白的荧光量子产率，0.85和0.61的比例分别为^15。

6。微尺度热泳作用研究

1. 选择LED激发源，λ= 470纳米在MST仪器。
2. 地点0.5毫升低吸附管在TUBE机架对面配体连续稀释样品管。小心地加入15微升的细胞裂解物的每​​个管的底部。尽量不要接触管壁，避免样品损失。
3. 的配位体的样品中加入15μl的最高浓度（＃1）到相应的管＃1与细胞裂解物。拌匀，改变枪头。重复此步骤，除了最后一个，这应该不含有配位体与管的其余部分。
4. 最后一根试管中加入15μl的MST缓冲到拌匀。
5. 填补约2/3的第一毛细管从管＃1的结合混合物，向中心倾斜移动至该溶液，并将其放置在毛细管的毛细管托盘＃1的位置（最近的位置的纸盒开口） 。重复此步骤，与其余毛细血管。毛细管两端可以插入较长的实验用蜡。
6. 托盘放置里面MST仪器和关闭乐器的大门。
7. 执行"查找毛细血管"命令让仪器的毛细血管，并找到准确的位置，测量荧光的样品。
8. 的荧光信号强度的基础上，调整LED的功率（10-100％），使其到400-1,500个单位时间间隔。
9. 点击"开始"按钮，执行热泳实验。可以选择一个以上的IR-激光功率的试验，以便找到特定的系统的最佳温度梯度。收藏毛细血管为同一组中的从2-3的运行数据，以确保测量的可重复性。它要花费10-12分钟运行一组16个毛细管。

7。微尺度的热泳数据分析

1. 打开分析软件。
2. 加载的项目文件夹。在出现的信息运行浏览器，选择收集在一个特定的红外激光功率热泳曲线。有一个选项，收集各种条件下，如红外激光功率打开所有热泳的痕迹，LED p奥尔，温度，浓度等 。切换和关闭一次，然后选择任何曲线分析，实验的名称（点击）。
3. 在的评价点数图"窗口中，选择T-跳热泳或热泳。确保正确定位，蓝色和红色的线条。要获得与标准偏差的平均点，选择"使用平均"或"区分运行"单独运行。
4. 要绘制的解离常数合适的，选择"一般"，进入并修复标记的分子浓度值（检查一个合适的窗口"菜单中的"集中"广场），贴合的曲线。其标准差的K _D值出现在一个单独的弹出信息窗口。山法绘制一个合适的，选择"一般"，希尔法，然后贴合的曲线。 EC ₅₀的亲和力在这种情况下，其标准偏差值。 _杀敌或山"边界"的特征时，也可以利用饱和在绑定状态没有达到。
5. 保存在一个文本文件中，平均拟合数据传送到Excel。
6. 剧情F _范数 （归一化荧光），ΔF _范数 （如果不同的实验进行比较，在归一化荧光的差异），或分数绑定（见下面的公式）作为分子浓度的未标记的（滴定）的函数。

界的馏分（馏分在一个复杂的分子）=（千卡（C） - 未结合的）/（结合未结合的），其中，的千卡（C）是浓度C测定的热泳，未结合未结合的状态（当分子热泳在一个复杂的），并绑定是完全束缚态的热泳。

结果

测量非磷酸化STAT3的寡核苷酸结合蛋白的亲合性。

STAT3-GFP表达HEK293细胞，使用荧光标记的STAT3的DNA结合测定作为源。用RIPA缓冲液（20×10 ⁶细胞/ ml）制备细胞裂解液。对于结合的研究，裂解物稀释150倍MST DNA的结合缓冲液中的荧光蛋白的结合反应（约20纳米），以提供最佳水平。未转染的HEK293细胞中已被用于评估的背景荧光，这被证明是不可探测的，即使在非...

讨论

蛋白表达和纯化是一个费 ​​力和昂贵的步骤，然而，有必要由目前使用最多的方法测定相互作用的K _D。 MST的应用可避免蛋白质纯化，从而大大简化和加快相互作用的定量表征。难以表达和纯化的蛋白质，如膜蛋白和转录因子的情况下特别显着的优点。

的主要限制和要求的MST是作为与绿色荧光蛋白融合的蛋白质的表达能力。然而，构建表达GFP融合人类和小鼠蛋白质?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent/material	Company	Catalogue Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064