Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Resumo

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Resumo

Caracterização quantitativa das interações proteína é essencial em praticamente qualquer campo das ciências da vida, particularmente a descoberta da droga. A maioria dos métodos actualmente disponíveis de determinação de K _D requerem acesso a proteína de interesse, a geração do qual pode ser demorado e caro purificada. Nós desenvolvemos um protocolo que permite a determinação da afinidade de ligação por termoforese microescala (MST) sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O método envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida e a lise das células em condições não desnaturantes. Aplicação do método para a STAT3-GFP expresso transitoriamente em células HEK293 permitem determinar, pela primeira vez que a afinidade do factor de transcrição bem estudado para oligonucleótidos com sequências diferentes. O protocolo é simples e pode ter uma variedade de aplicações para o estudo das interacções de proteínas com moléculas pequenas, péptidos, ADN, ARN, e proteins.

Introdução

Caracterização quantitativa da afinidade de interacções intermoleculares é importante em muitas áreas da investigação biomédica. Binding constante de dissociação (K _D) é essencial não só na descoberta de drogas, mas também é um parâmetro importante na caracterização de qualquer interacção binário em qualquer sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para a detecção de interações proteína-proteína, tais como imunoprecipitação e fermento telas de dois híbridos, não nos informar sobre como apertada são essas interações, enquanto a afinidade define se este complexo particular, existe sob determinadas condições in vivo. No processo de descoberta de drogas, o desenvolvimento de ensaio de ligação é uma das mais necessárias e frequentes das etapas mais demoradas. Métodos mais comumente usados ​​de determinação K _D incluem polarização de fluorescência, ^uma ressonância plasmon de superfície tecnologia (SPR), ² ligação radioligante, ^{3 de} calorimetria de titulação isotérmica, ⁴ equilibrihum diálise (ED), ⁵ de ultrafiltração (UF), ⁵ e ultracentrifugação (UC). ⁶ Todos eles requerem quantidades significativas de proteína alvo purificada. Termoforese microescala (MST) é um método rápido desenvolvimento que detecta o movimento dirigido de moléculas com um gradiente de temperatura microscópica. Quaisquer alterações da concha de hidratação de biomoléculas em resultado de uma mudança relativa do movimento ao longo do gradiente de temperatura. MST ⁷ é utilizado para determinar as afinidades de ligação e tem sido aplicado para estudar a ligação de proteínas marcadas com fluorescência ou ligandos fluorescentes ligando a uma ^{proteína-alvo, 8. 9} MST permite a medição de interacções directamente em solução, sem a necessidade de imobilização de uma superfície (imobilização de tecnologia livre). Praticamente, qualquer ligação é acompanhada por uma mudança no sinal de MST, embora a dimensão da alteração varia de sistema para sistema significativamente. Para a detecção da molécula de movimento pelo MST, eles têm que ser fluorescênciant. Esta importante limitação do método pode ser transformado em uma vantagem. Se a proteína é expressa como uma fusão de GFP em qualquer sistema, que será a única molécula fluorescente e, assim, pode ser estudada, sem isolamento a partir do ligado de células ou sistema de expressão isento de células. Geração de lisados ​​de células que permitem a ligação com artefactos condições mínimas é o principal desafio. Aqui, nós descrevemos um protocolo de preparação da célula e ligado de experiência MST que pode ser usado para muitas proteínas solúveis e de membrana.

Proteínas STAT são latentes factores de transcrição activados por citoplasmáticos fosforilação da tirosina em resposta a sinais extracelulares e estão envolvidos em muitos processos biológicos, incluindo imunidade, hematopoiese, inflamação e desenvolvimento. ¹⁰ Nos mamíferos, a família STAT STAT consiste de 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B e 6. Todas as estatísticas são activados sabe ligar-se a mesma sequência de DNA, assim chamado padrão GÁS, IFN-gama ativada sequência. No entanto, a transcriptional efeitos de diferentes estatísticas são muito diferentes. ¹¹ Apesar de envolvimento em muitos processos patológicos e estudos extensivos rendendo mais de 17.000 publicações, a K _D de STAT interacções com diferentes sequências de ADN que não foram determinadas. Apenas a afinidade relativa dos diferentes estatísticas às variantes do motivo de gás foi caracterizada. ¹¹ Dificuldades na expressão e purificação de proteínas são os principais impedimentos para a caracterização da selectividade de ligação do ADN estatísticas. Embora a maioria dos estudos têm-se centrado sobre o papel dos Stats "ativados", que se tornou sinônimo de fator de transcrição Tyr-fosforilada, o papel da não-fosforilada STATs (U-Stats) na regulação da transcrição está emergindo rapidamente. ¹² No entanto, estes mecanismos são mal compreendidos, e não ficou claro se U-STATs realmente se ligar ao DNA ou agir através de interações com outros fatores de transcrição. Demonstrámos recentemente que a L-STAT3 pode ligar ao DNA sequencialmenteces diferentes motivos de gás com ainda maior afinidade ^13. A descoberta tem implicações significativas para a nossa compreensão das funções biológicas desta importante proteína. Temos aplicado termoforese microescala para determinar as afinidades relativas de STAT3 ao gás e oligonucleótido rica em AT S 100 (Figura 4). Quase protocolo idêntico foi usado para a determinação de K _D para a ligação de um ligando a STAT3 diferente, um inibidor de lipopéptido. ^{14 N} a ligação de um factor de transcrição relacionadas, GFP-STAT1, que foi utilizado como um controlo negativo pode ser detectada confirmando assim a selectividade da interacção. ¹⁴

Protocolo

1. Preparação de lisado celular

Este protocolo destina-se a células aderentes que expressam qualquer proteína GFP fundida. O número de células necessário pode variar de tão baixo quanto ⁶ a 10 até 20 x 10 ⁶ células, dependendo do nível de expressão da proteína. Por exemplo, lisado de células HEK-sobre-expressam GFP STAT3 foi preparado por tratamento de células crescidas em frascos T75 10 a cerca de 70% de confluência com 1 ml de tampão de lise. No entanto, este lisado teve de ser diluída 150 vezes para fornecer um nível óptimo de fluorescência para o experimento de MST. Protocolo de lise celular depende fortemente das propriedades e localização intracelular da proteína em estudo. Se o uso de detergentes é indesejável devido à instabilidade da proteína, sonicação descrito abaixo, pode ser a melhor escolha. Diferentes aditivos podem ser adicionados ao tampão de lise para evitar as reacções de modificação da proteína: EDTA evita a fosforilação, vanadato de sódio inibe a proteína tirosina fosfatases, de modofluoreto de sódio é um inibidor de Ser / Tre fosfatases.

1. Preparar tampão de lise. For-a-extraem fáceis proteínas citoplasmáticas a composição seguinte funciona bem: 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, mistura de inibidores de protease e diluiu-se 100 vezes (P2714 Sigma-Aldrich, consistindo de AEBSF 2 mM, 0,3 uM de aprotinina, bestatina 130 | iM, EDTA 1 mM, 14 fiM de E-64, 1 mM leupeptina). Alternativamente, as proteínas solúveis menos, pode-se utilizar tampão RIPA comercial, com inibidores de protease e cocktail de detergentes não desnaturantes. Manter o tampão em gelo.
2. Lave as células brevemente com PBS gelado utilizando 10 ml de tampão por frasco T75. Manter as células em gelo durante 5 minutos, ou até que as células começam a retirar do frasco. Raspe as células com raspador de células para retirar, se necessário.
3. Ressuspender as células em 10 ml PBS gelado e transferir para um tubo de 14 ml prechilled centrífuga de fundo redondo.
4. Células por centrifugação a 400-600 xg a 4 ° C durante 5 min. Combine as células de vários frascos, neste ponto if necessário.
5. Remover PBS sobrenadante e ressuspender o pellet em 200 ul de tampão de lise arrefecido com gelo, transferindo a suspensão para um pré arrefecida tubo Eppendorf de 1,5 ml.
6. Manter as células em gelo para minimizar o sobreaquecimento local. Lisar as células com 3x 10 segundos pulsos de sonicação a 30% da amplitude, usando um 2-3 mm ponta pré-refrigerados. Mantenha a ponta abaixo da superfície para minimizar a formação de espuma. Omitir este passo quando se utiliza detergente contendo tampão e incubar em gelo durante 30 min em vez disso.
7. Corrigir a solução lisado para conter a concentração de sal fisiológica (NaCl 100 mM), se necessário, utilizando-se 5 M de NaCl.
8. Recolhe lisados ​​por centrifugação a cerca de 26.000 x g a 4 ° C durante 10 min.
9. Determinar o lisado diluição óptima (tal como descrito na secção 3 a seguir) e da quantidade de lisado necessário para uma titulação (tipicamente cerca de 300 ul de lisado de pré-diluída).
10. Alíquotas do ligado e armazenar a temperatura adequada para a proteína em estudo (-80 ° C, na maioria dos casos).

2. Seleção tampão MST e Preparação

1. Uma vez que as interacções proteína-ligando são dependentes de condições de tampão, a composição do tampão MST é escolhido com base nas propriedades de um sistema particular. É geralmente vantajoso para testar pelo menos dois buffers diferentes.
2. Prepare dois buffers MST 5x. Tivemos boas experiências com estas duas composições: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM _MgCl2, 500 mM de NaCl, 0,25% de NP-40) e Tris-HCl (250 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 750 mM, 50 MgCl ₂ mM, 0,05% de Tween-20). A adição de BSA (5% na mistura final vinculativa) pode ajudar a prevenir a adesão de proteínas para tubos de plástico e de vidro capilares. NaN ₃ (0,5 mM), também podem ser incluídos para evitar o crescimento de microorganismos.

3. Determinação da diluição óptima Lysate

1. Seleccione a fonte de excitação de LED com comprimento de onda = 470 nm λ no instrumento MST.
2. Carregar capilares com o cevai extrair diluído 2 e 10x com tampão MST.
3. Execute "Encontre Capilares" Operação em software de controle de instrumento MST. A gama óptima de fluorescência em lisado é diluído entre 400 e 1500 unidades de fluorescência.

4. Determinação da Gama óptima concentração de ligando

1. A concentração mais elevada do ligando deveria ser pelo menos 20x maior que a constante de dissociação esperado.
2. A menor concentração de ligando deve ser mais baixa do que a concentração molar da proteína fluorescente.

Consulte a ferramenta Localizador Concentration Technologies NanoTemper para o ligante estimativa faixa de concentração.

5. Preparação de lisado celular e as diluições do ligando

1. Colocar uma armação de tubo com um número necessário (geralmente 10-16) de 0,5 ml em tubos de centrifugação LoBind gelo. Pipetar 25 ul de tampão de MST para a parte inferior de cada tubo. Adicionar 25 ul da solução de estoque de ligando para a primeira cubae (# 1, a concentração de ligando mais elevada) e efectuar a diluição em série de duas vezes do ligando utilizando o resto dos tubos. Mantenha o rack com amostras de ligante no gelo.
2. Célula Thaw lisado lentamente no gelo.
3. Diluir o lisado celular com tampão de MST para fornecer o nível óptimo da proteína alvo fluorescente nas reacções de ligação. Concentração final de proteína deve ser perto de esperada K _D ou inferior. Deve ser ajustado para se obter o número necessário de contagens de fluorescência na solução final. Para a determinação da concentração de GFP-STAT3 no ligado, o instrumento foi calibrado com uma ajuda de fluoresceína. A concentração molar de GFP no ligado foi determinada utilizando a relação de fluoresceína e rendimentos quânticos de EGFP, 0,85 e 0,61, respectivamente, ^15.

6. Microescala termoforese Estudos Encadernação

1. Selecione a fonte de excitação LED com λ = 470 nm sobre o instrumento MST.
2. Colocar 0,5 ml tubos LoBind na tube prateleira em frente tubos com amostras de ligante de diluição em série. Adicionar cuidadosamente 15 mL do lisado de células para a parte inferior de cada tubo. Tente não tocar as paredes do tubo para evitar a perda de amostra.
3. Adicionam-se 15 ul da amostra do ligando com a maior concentração (# 1) para o tubo correspondente # 1 com o ligado de células. Misture bem e mudar a ponta da pipeta. Repetir este passo com o resto dos tubos, excepto para a última, que deve conter nenhum ligando.
4. Adicionar 15 ul de tampão de MST para o último tubo e misturar bem.
5. Encha cerca de 2/3 do primeiro capilar com a mistura de ligação de tubo # 1, incliná-la para mover a solução para o centro, e colocar o tubo capilar sobre a bandeja capilar para a posição # 1 (na posição mais próxima da abertura da bandeja) . Repita este passo com o resto capilares. Extremidades capilares pode ser conectado com cera para experimentos mais longos.
6. Coloque a bandeja dentro do instrumento MST e fechar a porta do instrumento.
7. Execute "Encontre Capilares"de comando para permitir que o instrumento encontrar posições exactas dos capilares e medir a fluorescência das amostras.
8. Com base na intensidade do sinal de fluorescência, ajustar o LED (10-100%) a fim de o intervalo de unidades 400-1,500.
9. Clique no botão "Iniciar" para executar o experimento termoforese. Mais do que uma fonte de laser de infravermelho podem ser escolhidos para a experiência, a fim de encontrar o gradiente de temperatura óptima para o sistema particular. Recolha de dados 2-3 funcionamentos para o mesmo conjunto de capilares para assegurar a reprodutibilidade das medições. Leva 10-12 min para executar um conjunto de 16 capilares.

7. Microescala termoforese Análise de Dados

1. Abra o software de análise.
2. Coloque a pasta do projeto. Nas Informações apareceu Run Visualizador selecionar coletadas em curvas específicas IR laser do poder thermophoretic. Existe uma opção de abrir todos os vestígios recolhidos thermophoretic sob várias condições, tais como a potência do laser IR, LED power, temperatura, concentração, etc. de uma vez e, em seguida, escolher todas as curvas para análise trocando-os dentro e fora (clique no nome do experimento).
3. Na janela do gráfico de Pontos de Avaliação, selecione o termoforese ou termoforese com T-jump. Certifique-se de que as linhas azul e vermelha estão posicionados corretamente. Para obter os pontos médios com desvios-padrão, selecione "Usar Média" ou "Distinguir corre" para ensaios separados.
4. Para traçar um ajuste constante de dissociação, selecione "Usar média", introduza e fixe o valor de concentração molécula marcada (marque a opção "concentração" quadrado em um menu de janela de ajuste) e ajustar a curva. O valor de K _D com seu desvio padrão aparece em uma janela de informações pop-up separada. Para traçar um ajuste utilizando o método de Hill, escolha "Média", o método de Hill, e depois ajustar a curva. O valor de CE ₅₀ de afinidade com o seu desvio padrão está representado neste caso. O recurso de K _D ou Hill "fronteira" também pode ser utilizado quando a saturaçãonum estado de associação não será atingido.
5. Salvar os dados médios caber em um arquivo de texto e transferir para o Excel.
6. Lote F _norma (fluorescência normalizado), Af _norma (diferença na fluorescência normalizada se experiências diferentes são comparados), ou fracção ligada (ver a fórmula seguinte), como uma função do não marcado (titulada) a concentração molécula.

Fracção ligada (fracção de moléculas num complexo) = (Therm (C)-desacoplado) / (limite-desacoplado), onde Therm (C) é termoforese medida para a concentração C, é desacoplado termoforese para o estado livre (quando as moléculas são não em um complexo), e é obrigado termoforese para o estado completamente amarrado.

Resultados

Medição da afinidade de ligação a oligonucleótidos STAT3 não fosforilada da proteína.

As células HEK293 que expressam STAT3-GFP foram usados ​​como uma fonte de STAT3 marcado por fluorescência para ensaio de ligação de DNA. Os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão RIPA (20x10 ⁶ células / ml). Para estudos de ligação, os lisados ​​foram diluídos 150 vezes com MST tampão de ligação de ADN para fornecer o nível óptimo da...

Discussão

A expressão de proteínas e de purificação é um passo trabalhoso e caro, o que é, no entanto, necessárias para a determinação do K _D 'interacções pelo método mais usado actualmente. Aplicação de MST permite evitar a purificação de proteínas, assim, simplificar e acelerar significativamente caracterização quantitativa de interacções. Ele apresenta vantagens particularmente importantes no caso de-a-expressam difíceis e purificar proteínas, tais como proteínas de membrana e os factores...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064