Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Riepilogo

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Abstract

Caratterizzazione quantitativa delle interazioni della proteina è essenziale in praticamente ogni campo delle scienze della vita, in particolare di scoperta di nuovi farmaci. La maggior parte dei metodi attualmente disponibili di determinazione K _D richiedono accesso purificata proteina di interesse, di generazione che può essere lunga e costosa. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente di determinare l'affinità di legame per thermophoresis microscala (MST) senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il metodo prevede sovraespressione della proteina GFP-fuso e lisi cellulare in condizioni non denaturanti. Applicazione del metodo di STAT3-GFP espresso transitoriamente in cellule HEK293 permesso di determinare per la prima volta l'affinità del fattore di trascrizione ben studiato per oligonucleotidi con sequenze differenti. Il protocollo è semplice e può avere una varietà di applicazione per studiare le interazioni delle proteine ​​con piccole molecole, peptidi, DNA, RNA, e proteins.

Introduzione

Caratterizzazione quantitativa di affinità di interazioni intermolecolari è importante in molti settori della ricerca biomedica. Legame costante di dissociazione (K _D) è essenziale non solo nella scoperta della droga, ma è anche un parametro importante caratterizzazione di ogni interazione binaria in qualsiasi sistema biologico. Metodi biochimici utilizzati per il rilevamento di interazioni proteina-proteina, come la immunoprecipitazione e lievito schermi a due ibridi, non ci informano su quanto stretto sono quelle interazioni, mentre affinità definisce se questo particolare complesso esiste in determinate condizioni in vivo. Nel processo di scoperta di nuovi farmaci, lo sviluppo del saggio di legame è uno dei più necessaria e spesso i passi più in termini di tempo. Metodi più utilizzati per la determinazione K _D includono polarizzazione di fluorescenza, ¹ tecnologia risonanza plasmonica di superficie (SPR), vincolante radioligando ^{2, 3} isotermica di titolazione calorimetria, ⁴ Equilibrium dialisi (ED), ⁵ ultrafiltrazione (UF), ⁵ e ultracentrifugazione (UC). ⁶ Tutte richiedono notevoli quantità di proteina purificata bersaglio. Thermophoresis microscala (MST) è un metodo rapido sviluppo che rileva la regia movimento delle molecole in un gradiente di temperatura microscopico. Eventuali modifiche del guscio di idratazione biomolecole comportano un cambiamento relativo di movimento lungo il gradiente di temperatura. ⁷ MST viene utilizzato per determinare affinità di legame ed è stato applicato per lo studio legame alle proteine ​​fluorescente o ligandi fluorescenti ligando ad una proteina bersaglio. ^{8, 9} MST consente di misurare direttamente interazioni in soluzione, senza la necessità di immobilizzazione di una superficie (immobilizzazione tecnologia senza). Praticamente, qualsiasi associazione è accompagnato da un cambiamento nel segnale MST, anche se la dimensione del cambiamento differisce da sistema a sistema in modo significativo. Per la rilevazione di movimento molecola da MST, devono essere fluorescenzant. Questo importante limitazione del metodo può essere trasformato in un vantaggio. Se una proteina è espressa come una fusione GFP in qualsiasi sistema, sarà la sola molecola fluorescente e quindi può essere studiata senza separazione dal lisato cellulare o sistema di espressione acellulare. Generazione di lisati cellulari che permettono di condizioni vincolanti con manufatti minimali è la grande sfida. Qui si descrive un protocollo di cellule lisate e sperimentare MST che può essere utilizzato per molte proteine ​​solubili e di membrana.

Proteine ​​STAT sono latenti fattori di trascrizione attivati ​​da citoplasmatici fosforilazione della tirosina in risposta a segnali extracellulari e sono coinvolti in molti processi biologici tra immunità, ematopoiesi, infiammazione e sviluppo. ¹⁰ Nei mammiferi, la famiglia STAT costituito STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B e 6. All Stats attivati ​​sono noti per legarsi alla stessa sequenza di DNA, così chiamato motivi GAS, IFN-gamma attivato sequenza. Tuttavia, la transcrieffetti facoltativo, di diverse statistiche sono molto diversi. ¹¹ Nonostante il coinvolgimento in molti processi patologici e ampi studi che producono oltre 17.000 pubblicazioni, la K _D di interazioni STAT con diverse sequenze di DNA non sono stati determinati. Solo affinità relativa delle diverse statistiche varianti del motivo GAS è stato caratterizzato. ¹¹ Difficoltà di espressione e purificazione di proteine ​​sono i principali ostacoli nella caratterizzazione di STAT 'DNA selettività vincolante. Anche se la maggior parte degli studi si sono concentrati sul ruolo delle stats "attivato", che divenne sinonimo di fattore di trascrizione Tyr-fosforilata, il ruolo del non-fosforilata Stats (U-stats) nella regolazione della trascrizione sta emergendo rapidamente. ¹² Tuttavia, questi meccanismi sono poco conosciute, e non era chiaro se U-stats in realtà si legano al DNA o di agire attraverso le interazioni con altri fattori di trascrizione. Abbiamo recentemente dimostrato che l'U-STAT3 può legarsi al DNA sequenzialeCES diverso da motivi a gas con ancora maggiore affinità. ¹³ La scoperta ha implicazioni significative per la nostra comprensione delle funzioni biologiche di questa importante proteina. Abbiamo applicato thermophoresis microscala per determinare affinità relative di STAT3 a GAS e AT-ricco oligonucleotide S 100 (Figura 4). Protocollo pressoché identico è stato utilizzato per la determinazione K _D per il legame di un ligando diverso STAT3, un inibitore lipopeptide. ¹⁴ N. vincolante per un fattore di trascrizione correlato, GFP-STAT1 che è stato utilizzato come controllo negativo si poteva individuare confermando selettività di interazione. ¹⁴

Protocollo

1. Preparazione del lisato

Questo protocollo è destinato cellule aderenti esprimono alcuna proteina GFP-fusa. Numero di cellule necessarie possono variare da un minimo di 10 ⁶ di ben 20 x 10 ⁶ cellule, a seconda del livello di espressione della proteina. Per esempio, lisato di cellule HEK overexpressing GFP-STAT3 è stato preparato trattando cellule coltivate in fiasche T75 10 vicino al 70% di confluenza con 1 ml di tampone di lisi. Tuttavia, questo lisato stati diluiti 150 volte per fornire il livello ottimale di fluorescenza per esperimento MST. Protocollo di lisi cellulare dipende fortemente dalle proprietà e la localizzazione intracellulare della proteina in esame. Se si utilizza un detersivo è indesiderabile a causa dell'instabilità proteica, sonicazione descritta di seguito, potrebbe essere la scelta migliore. Diversi additivi possono essere aggiunti al tampone di lisi per prevenire reazioni di modificazione proteica: EDTA impedisce fosforilazione, vanadato sodico inibisce proteine ​​fosfatasi tirosina, cosìdium fluoruro è un inibitore di Ser / Thr fosfatasi.

1. Preparare tampone di lisi. Per estrarre a-easy-proteine ​​citoplasmatiche la seguente composizione funziona bene: 25 mM Tris HCl, pH 8.0, e cocktail inibitore di proteasi diluita 100 volte (Sigma-Aldrich P2714, consistente in 2 mM AEBSF, 0.3 mM aprotinina, 130 pM Bestatina, 1 mM EDTA, 14 mM E-64, 1 mM leupeptina). In alternativa, per le proteine ​​meno solubili, si può usare tampone RIPA commerciale con inibitori della proteasi cocktail e detergenti non denaturanti. Tenere il tampone sul ghiaccio.
2. Lavare le cellule brevemente con PBS freddo utilizzando 10 ml di tampone per T75 pallone. Mantenere le cellule in ghiaccio per 5 minuti, o fino a quando le cellule iniziano staccandosi dal pallone. Raschiare le cellule con raschietto cella di staccare, se necessario.
3. Risospendere le cellule in 10 ml di PBS freddo ghiaccio e trasferimento ad un prechilled 14 ml a fondo sferico da centrifuga.
4. Cellule pellet per centrifugazione a 400-600 xga 4 ° C per 5 min. Combinare le cellule di diversi palloni, a questo punto if necessario.
5. Rimuovere PBS surnatante e risospendere pellet in 200 ml di tampone di lisi ghiacciato, il trasferimento di sospensione per un pre freddo 1,5 ml provetta Eppendorf.
6. Mantenere le cellule in ghiaccio per ridurre al minimo il surriscaldamento locale. Lyse cellule con 3x 10 sec impulsi di ultrasuoni al di ampiezza 30%, con un 2-3 mm punta pre-raffreddata. Tenere la punta sotto la superficie per ridurre al minimo la formazione di schiuma. Omettere questo passo quando si usano detergenti contenenti buffer e incubare in ghiaccio per 30 minuti, invece.
7. Correggere la soluzione lisato di contenere la concentrazione salina fisiologica (NaCl 100 mM), se necessario, con 5 M NaCl.
8. Raccogliere lisati mediante centrifugazione a circa 26.000 xga 4 ° C per 10 min.
9. Determinare la diluizione lisato ottimale (come descritto nella sezione 3 di seguito) e la quantità di lisato necessaria per una titolazione (in genere circa 300 ml di lisato pre-diluito).
10. Aliquotare il lisato e conservare a temperatura appropriata per la proteina in esame (-80 ° C, in molti casi).

2. MST Buffer selezione e preparazione

1. Poiché le interazioni proteina-ligando dipendono dalle condizioni di buffer, MST composizione del tampone viene scelta in base alle proprietà di un particolare sistema. E 'generalmente vantaggioso testare almeno due differenti tamponi.
2. Preparare 2 5x buffer MST. Abbiamo avuto buone esperienze con queste due composizioni: HEPES (250 HEPES mM, pH 7.4, 25 mM _MgCl2, 500 mM NaCl, 0.25% NP-40) e Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7.4, 750 mM NaCl, 50 mM _MgCl2; 0,05% Tween-20). L'aggiunta di BSA (5% nella miscela finale vincolante) può aiutare a prevenire l'adesione di proteine ​​per tubi di plastica e di vetro capillari. NaN ₃ (0,5 mM) può anche essere incluso per prevenire la crescita di microrganismi.

3. Determinazione ottimale lisato di diluizione

1. Selezionare la sorgente di eccitazione LED con la lunghezza d'onda λ = 470 nm sullo strumento MST.
2. Caricare capillari con il cell estratto diluito 2 e 10x con tampone MST.
3. Eseguire l'operazione di "Trova Capillari" sul software di controllo dello strumento MST. Il range ottimale di fluorescenza in lisato diluito è da 400 a 1.500 unità di fluorescenza.

4. Determinazione del legante ottimale range di concentrazione

1. La più alta concentrazione del ligando deve essere almeno 20 volte superiore alla costante di dissociazione atteso.
2. La concentrazione minima ligando deve essere inferiore concentrazione molare della proteina fluorescente.

Fare riferimento alla Technologies strumento Finder Concentrazione NanoTemper per il ligando concentrazione gamma di stima.

5. Preparazione del lisato e diluizioni Ligand

1. Posizionare un rack tubo con un numero necessario (di solito 10-16) di 0,5 ml provette LoBind sul ghiaccio. Pipettare 25 ml di tampone MST al fondo di ogni provetta. Aggiungere 25 ml di soluzione madre ligando alla prima vascae (# 1, ligando più alta concentrazione) ed eseguire di serie di diluizioni doppie del ligando con il resto dei tubi. Tenere il rack con i campioni ligando su ghiaccio.
2. Cella disgelo lisato lentamente sul ghiaccio.
3. Diluire lisato cellulare con tampone MST per fornire il livello ottimale della proteina bersaglio fluorescente nelle reazioni di legame. Concentrazione proteica finale dovrebbe essere vicino al previsto K _D o inferiore. Dovrebbe essere aggiustata per ottenere necessario numero di conteggi fluorescenza nella soluzione finale. Per la determinazione della concentrazione di GFP-STAT3 nel lisato, lo strumento è stato calibrato con un ausilio di fluoresceina. La concentrazione molare di GFP nel lisato è stato determinato usando rispettivamente il rapporto di fluoresceina e EGFP rese quantiche, 0,85 e 0,61. ¹⁵

6. Microscala Thermophoresis Studi di rilegatura

1. Selezionare la sorgente di eccitazione LED con λ = 470 nm sullo strumento MST.
2. Luogo provette da 0,5 ml LoBind nel tube cremagliera di fronte tubi con ligando campioni di diluizione in serie. Aggiungere con cautela 15 ml di lisato cellulare al fondo di ogni tubo. Provare a non toccare pareti del tubo per evitare la perdita del campione.
3. Aggiungere 15 microlitri di campione ligando con la più alta concentrazione (# 1) al tubo corrispondente # 1 con il lisato cellulare. Mescolare bene e cambiare una punta della pipetta. Ripetere questa fase con il resto dei tubi eccetto l'ultima, che dovrebbe contenere alcun ligando.
4. Aggiungere 15 ml di tampone MST all'ultima provetta e mescolare bene.
5. Riempire circa 2/3 della prima capillare con la miscela associazione dal tubo # 1, inclinarlo per spostare la soluzione verso il centro, e posizionare il capillare sul vassoio capillare nella posizione # 1 (la posizione più vicina all'apertura vassoio) . Ripetere questa operazione con il resto capillari. Estremità del capillare possono essere collegati con la cera per gli esperimenti più lunghi.
6. Collocare il vassoio all'interno dello strumento MST e chiudere la porta dello strumento.
7. Eseguire "Trova Capillari"comando per lasciare lo strumento trovare posizioni precise dei capillari e misurare la fluorescenza dei campioni.
8. In base all'intensità del segnale di fluorescenza, regolare la potenza del LED (10-100%) per portarlo in 400-1,500 unità di intervallo.
9. Fare clic sul pulsante "Start" per eseguire l'esperimento thermophoresis. Più di una potenza IR-laser può essere scelta per l'esperimento per trovare il gradiente di temperatura ottimale per il particolare sistema. Raccogliere dati 2-3 piste per lo stesso insieme di capillari per garantire la riproducibilità delle misurazioni. Ci vogliono 10-12 minuti per eseguire una serie di 16 capillari.

7. Microscala Thermophoresis Data Analysis

1. Aprire il software di analisi.
2. Caricare la cartella del progetto. Nel Informazioni Run Viewer apparso selezionare raccolti ad un laser di potenza specifiche curve thermophoretic IR. C'è una possibilità di aprire tutte le tracce thermophoretic raccolti in diverse condizioni quali la potenza del laser a infrarossi, LED power, temperatura, concentrazione, ecc. in una sola volta e poi la scelta di eventuali curve di analisi da loro accensione e spegnimento (clicca sul nome del dell'esperimento).
3. Nella finestra del grafico i punti di valutazione, selezionare l'thermophoresis o thermophoresis con T-salto. Assicurarsi che le linee blu e rosse sono posizionati correttamente. Per ottenere i punti medi con deviazioni standard, selezionare "Utilizza media" o "Distinguere corre" per esecuzioni separate.
4. Per tracciare una costante forma di dissociazione, selezionare "uso medio", inserire e fissare il valore di concentrazione molecola etichettato (controllare la piazza "concentrazione" in un menu a finestra in forma), e montare la curva. Il valore di K _D con la sua deviazione standard compare in una informazione finestra pop-up separata. Per tracciare una misura con il metodo Hill, selezionare "Media", metodo di Hill, e poi misura la curva. Il valore di affinità EC ₅₀ con la sua deviazione standard è mostrato in questo caso. La caratteristica di K _D o Hill "confine" può essere utilizzato anche quando la saturazionein uno stato vincolato non viene raggiunto.
5. Salvare i dati medi di adattarsi in un file di testo e trasferire in Excel.
6. Plot F _norma (fluorescenza normalizzata), Af _norma (differenza di fluorescenza normalizzato se diversi esperimenti sono confrontati), o frazione legata (vedere la formula seguente) come funzione della concentrazione molecola non marcato (titolato).

Frazione legata (frazione di molecole in un complesso) = (Therm (C)-non legato) / (bound-legato), dove Therm (C) è thermophoresis misurato per la concentrazione di C, non legato è thermophoresis per lo stato non legato (quando le molecole sono non in un complesso), e legato viene thermophoresis per lo stato completamente legato.

Risultati

Misurando l'affinità di non fosforilata STAT3 legame proteico oligonucleotidi.

Cellule HEK293 esprimenti STAT3-GFP sono stati utilizzati come fonte di fluorescente STAT3 per saggio di legame al DNA. I lisati cellulari sono stati preparati usando tampone RIPA (20x10 ⁶ cellule / ml). Per studi di legame, i lisati sono stati diluiti con 150x MST tampone di legame al DNA per fornire il livello ottimale della proteina fluorescente nella reazione di legame (circa 20 n...

Discussione

Espressione e purificazione di proteine ​​è un passo laboriosa e costosa, che è, tuttavia, necessario per la determinazione delle interazioni 'K _D dal metodo più usato. Applicazione del MST permette di evitare la purificazione di proteine ​​così in modo significativo semplificare ed accelerare la caratterizzazione quantitativa delle interazioni. Esso presenta vantaggi particolarmente significativo nel caso di-to-esprimere difficili e purificare proteine, quali le proteine ​​di membrana e f...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064