Очистки белков-Free метод привязки Определение Affinity по Микромасштабные Термофорез

Резюме

Микромасштабные термофореза (MST) могут быть широко использованы для определения аффинности связывания без очистки целевого белка из клеточных лизатов. Протокол включает сверхэкспрессии GFP-слитый белок, лизис клеток в неденатурирующих условиях, и обнаружение MST сигнала в присутствии различных концентраций лиганда.

Аннотация

Количественная характеристика белковых взаимодействий необходимо практически в любой области наук о жизни, в частности лекарственных препаратов. Большинство доступных в настоящее время методы определения K _D необходим доступ к очищенного белка, представляющего интерес, генерация которого может быть трудоемким и дорогим. Мы разработали протокол, который позволяет для определения аффинности связывания по микромасштабной термофореза (MST) без очистки целевого белка из клеточных лизатов. Способ включает гиперэкспрессией GFP-слитого белка и лизиса клеток в неденатурирующих условиях. Применение метода к STAT3-GFP временно экспрессированного в клетках НЕК293, позволил определить впервые сродство хорошо изученных фактора транскрипции олигонуклеотиды с различными последовательностями. Протокол является простым и может иметь различные применения для исследования взаимодействия белков с небольшой молекулы, пептиды, ДНК, РНК и рroteins.

Введение

Количественная характеристика сродства межмолекулярных взаимодействий важно во многих областях биомедицинских исследований. Связывание константа диссоциации (K _D) имеет важное значение не только в лекарственных препаратах, но также является важным параметром в характеристике любого парного взаимодействия в любой биологической системы. Биохимические методы, используемые для выявления белок-белковых взаимодействий, таких как дрожжи и иммунопреципитацией двугибридная экраны, не сообщите нам о том, как плотно те ​​взаимодействия, в то время как близость определяет, что данный комплекс существует в данных условиях в естественных условиях. В процессе лекарственных средств, обязательного анализа развития является одним из необходимых и часто наиболее трудоемких шагов. Наиболее часто используемые методы определения _Уб включают поляризации флуоресценции, ¹ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) технологии, ² связывания радиоактивного, ³ изотермических калориметрии титрования, ⁴ равновесиигм диализа (ЭД), ⁵ ультрафильтрации (UF), ⁵ и ультрацентрифугирования (UC). ⁶ Все они требуют значительных количеств очищенного белка-мишени. Микромасштабные термофореза (MST) является быстро развивающийся метод, обнаруживающий направленное движение молекул в микроскопической градиента температуры. Любые изменения гидратной оболочки биомолекул приводит к относительному изменению движение вдоль градиента температуры. ⁷ MST используется для определения аффинности связывания и был применен для исследования связывания лиганда с флуоресцентно меченых белков или флуоресцентных лигандов с белком-мишенью. ^{8, 9} MST позволяет измерять взаимодействие непосредственно в растворе без необходимости иммобилизации на поверхности (иммобилизации без технологии). Практически любое связывание сопровождается изменением MST сигнал, хотя размер изменение отличается от системы к системе значительно. Для обнаружения движения молекул по MST, они должны быть флуоресцируютNT. Это главное ограничение метода можно превратить в преимущество. Если белок экспрессируется как GFP синтеза в любой системе, это будет только флуоресцентные молекулы и, следовательно, могут быть изучены без выделения из клеточного лизата или бесклеточной системе экспрессии. Генерация клеточных лизатов, которые позволяют условия связывания с минимальными артефактами является серьезной проблемой. Здесь мы опишем протокол клеточного лизата подготовки и MST эксперимент, который может быть использован для различных растворимых и мембранных белков.

STAT белки скрыты цитоплазматическими факторами транскрипции активируется фосфорилирование тирозина в ответ на внеклеточные сигналы и участвуют во многих биологических процессах, включая иммунитет, кроветворение, воспаление и развитие. ¹⁰ У млекопитающих, STAT семья состоит из STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B и 6. Все активированные статы известно, связывается с той же самой последовательности ДНК, так называемого газового мотив, IFN-гамма активирован последовательности. Тем не менее, transcriptional последствия различные статистические данные очень разные. ⁺¹¹ несмотря на участие во многих патологических процессов и обширные исследования получая более 17000 изданий, _Уб STAT взаимодействий с различными последовательностями ДНК не были определены. Только относительной близости различных статистику, чтобы варианты ГАЗ Мотив был охарактеризован. ¹¹ Трудности в выражении и очистки белков являются основными препятствиями в характеристике ДНК STATs 'селективности связывания. Хотя большинство исследований были сосредоточены на роли "активированный" статистику, которая стала синонимом Тир-фосфорилированному транскрипционный фактор, роль нефосфорилированные STATs (U-STATs) в регуляции транскрипции быстро развивается. ¹² Тем не менее, эти механизмы изучены плохо, и неясно, является ли U-STATs фактически связываются с ДНК или действовать через взаимодействие с другими факторами транскрипции. Недавно мы показали, что U-STAT3 может связываться с ДНК последовательномCES отличается от ГАЗ мотивы с еще более высоким сродством. ⁺¹³ открытие имеет большое значение для нашего понимания биологических функций этого важного белка. Мы применили микромасштабной термофореза для определения относительного сродства STAT3 на газ и АТ-богатых олигонуклеотидных S +100 (рис. 4). Почти одинаковый протокол не был использован для определения K _D для связывания различных STAT3 лиганд, липопептидный ингибитора. ¹⁴ Нет связывания связанных фактора транскрипции, GFP-STAT1, который был использован в качестве отрицательного контроля могут быть обнаружены таким образом подтверждая селективность взаимодействия. ¹⁴

протокол

1. Приготовление клеточных лизата

Этот протокол предназначен для прилипшие клетки, экспрессирующие GFP-любое слитого белка. Необходимое количество клеток может варьироваться от самого низкого показателя 10 ⁶ до целых 20 х 10 ⁶ клеток, в зависимости от уровня экспрессии белка. Например, лизат клеток НЕК гиперэкспрессией GFP-STAT3 получали обработкой клетки, выращенные в 10 колбах Т75 до около 70% слияния с 1 мл лизирующего буфера. Однако этот лизат был быть разбавлен в 150 раз, чтобы обеспечить оптимальный уровень флуоресценции для эксперимента MST. Протокол Лизис клеток сильно зависит от свойств и внутриклеточной локализации белка под следствием. При использовании моющих средств нежелательно, поскольку нестабильность белка, обработка ультразвуком, описанных ниже, может быть лучшим выбором. Различные добавки могут быть добавлены в буфере для лизиса, чтобы предотвратить реакции модификации белков: ЭДТА предотвращает фосфорилирование, ванадат натрия ингибирует тирозин-фосфатазы белка, таксреде фтора является ингибитором Ser / Thr фосфатазы.

1. Подготовка буфера для лизиса. Для простого в извлекать цитоплазматических белков следующий состав хорошо работает: 25 мМ Трис-HCl, рН 8,0, и коктейль ингибитора протеазы разводили в 100 раз (Sigma-Aldrich P2714, состоящий из 2 мМ AEBSF, 0,3 мкМ апротинина, 130 мкМ бестатин, 1 мМ ЭДТА, 14 мкМ Е-64, 1 мкМ лейпептина). Кроме того, в менее растворимые белки, можно использовать коммерческие буфере RIPA с ингибиторами протеазы коктейль и неденатурирующем моющих средств. Держите буфера на льду.
2. Вымойте клетки кратко ледяным PBS с использованием 10 мл буфера на T75 колбу. Хранить клетки на льду в течение 5 минут, или пока клетки начинают отделения от колбы. Очистите клеток с клеточным скребком, чтобы отделить в случае необходимости.
3. Ресуспендируют клеток в 10 мл ледяной PBS и переносят в охлажденный 14 мл круглой трубы центрифуги дно.
4. Гранул клетки центрифугированием при 400-600 мкг при 4 ° С в течение 5 мин. Объединение ячеек нескольких колб В этот момент яF необходимости.
5. Удалить PBS супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл ледяного буфера для лизиса, передача подвески на предварительно охлажденным 1,5 мл пробирок Эппендорф.
6. Держите клетки на льду, чтобы минимизировать локального перегрева. Клетки лизируют с 3-кратным 10 импульсов сек обработки ультразвуком при 30% амплитуды, используя 2-3 мм, предварительно охлажденный наконечник. Держите кончик ниже поверхности, чтобы минимизировать пенообразования. Пропустить этот шаг при использовании моющих средств содержащих буфера и инкубируют на льду в течение 30 мин вместо.
7. Исправьте лизатом решения содержат физиологическую концентрацию соли (100 мМ NaCl), при необходимости с использованием 5 М NaCl.
8. Сбор лизаты путем центрифугирования при 26000 об мкг при 4 ° С в течение 10 мин.
9. Определение оптимального разведения лизата (как описано в разделе 3 ниже), и количество лизата необходимое для одного титрования (обычно около 300 мкл предварительно разбавленного лизата).
10. Алиготе лизата и хранить при температуре, необходимой для белка под следствием (-80 ° С, в большинстве случаев).

2. MST Выбор буфера и подготовка

1. Так как белок-лиганд, зависит от условий буфер, буфер МСТ композиция выбирается в зависимости от свойств конкретной системы. Обычно целесообразно проверить по крайней мере двух различных буферах.
2. Подготовьте 2 5x буферов MST. У нас был хороший опыт работы с этими двумя композициями: HEPES (250 мМ HEPES, рН 7,4, 25 мМ MgCl _2, 500 мМ NaCl, 0,25% NP-40) и Трис-HCl (250 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 750 мм NaCl; 50 _мМ MgCl2, 0,05% Твин-20). Добавление BSA (5% в конечной смеси для связывания) может помочь предотвратить адгезию белков в пластиковые пробирки и стеклянных капилляров. NaN ₃ (0,5 мМ) также могут быть включены для предотвращения роста микроорганизмов.

3. Определение оптимальных разбавления Lysate

1. Выберите светодиодного источника возбуждения с длиной волны λ = 470 нм на приборе MST.
2. Загрузите капилляров с СЕбудете извлекать разбавляют в 2 и 10 раз буфером MST.
3. Выполните "Найти капилляры" операция на управление компьютерами инструмента MST. Оптимальный диапазон флуоресценции в разбавленном лизатом составляет от 400 до 1500 единиц флуоресценции.

4. Определение оптимального диапазона концентраций лиганда

1. Самые высокие концентрации лиганда должно быть не менее 20 раз выше, чем ожидаемое Константу диссоциации.
2. Самые низкие концентрации лиганда должна быть ниже, чем молярная концентрация флуоресцентного белка.

Обратитесь к концентрации NanoTemper технологий Finder инструмент для оценки диапазона концентрации лиганда.

5. Подготовка клеточного лизата и разведения лиганда

1. Положите трубку стойка с необходимого количества (обычно 10-16) 0,5 мл пробирок LoBind центрифуги на льду. Пипеткой 25 мкл буфера для MST в нижней части каждой трубы. Добавить 25 мкл раствора лиганда с первой ваннее (# 1, лиганд высокая концентрация) и выполнять серию двукратных разведений лиганда использованием остальной части трубы. Держите стойки с лиганда образцы на льду.
2. Оттепели клеточного лизата медленно на льду.
3. Развести клеточного лизата с буфером MST чтобы обеспечить оптимальный уровень флуоресцентного белка-мишени в реакции связывания. Конечной концентрации белка должно быть близким к ожидаемому _Уб или ниже. Следует регулироваться для получения необходимого количества флуоресценции рассчитывает в конечном растворе. Для определения GFP-STAT3 концентрации в лизате, прибор был откалиброван с помощью флуоресцеина. Молярная концентрация GFP в лизате определяли, используя соотношение количества флуоресцеин и EGFP квантовые выходы, 0,85 и 0,61 соответственно. ¹⁵

6. Микромасштабные Термофорез Исследования связывания

1. Выберите светодиодного источника возбуждения с λ = 470 нм на приборе MST.
2. Место 0,5 мл LoBind труб в тВБО стойку напротив труб с лиганда серийных образцов разбавления. Осторожно добавляют 15 мкл клеточного лизата в нижней части каждой трубы. Старайтесь не дотрагиваться до стенок трубы, чтобы избежать потери образцов.
3. Добавьте 15 мкл образца лиганд с высокой концентрацией (№ 1) к соответствующей трубе № 1 с клеточного лизата. Хорошо перемешайте и изменить пипетки. Повторите этот шаг с остальной частью трубки, за исключением последнего, который не должен содержать лиганд.
4. Добавьте 15 мкл буфера MST до последней трубки и хорошо перемешать.
5. Заполните примерно 2/3 от первой капиллярной со связыванием смеси из трубы № 1, наклонить его для перемещения решение по направлению к центру, и поместить капиллярной на капиллярной лотка в положение № 1 (самое близкое положение к открытию лотка) . Повторите этот шаг с остальными капилляров. Концами капилляра можно подключить с воском для длительного эксперимента.
6. Поместите лоток внутри прибора MST и закройте дверь прибора.
7. Выполните "Найти капилляры"команды, чтобы прибор найти точное положение капилляров и измерение флуоресценции образцов.
8. На основе интенсивности флуоресценции сигнале, отрегулируйте питание светодиодов (от 10-100%), чтобы привести его в 400-1,500 интервал единиц.
9. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы выполнить термофореза эксперимента. Более ИК-мощность лазера может быть выбран для эксперимента, чтобы найти оптимальный температурный градиент для конкретной системы. Сбор данных от 2-3 работает по тому же набору капилляров чтобы обеспечить воспроизводимость результатов измерений. Это занимает 10-12 минут, чтобы выполнить один из 16 капилляров.

7. Микромасштабные Термофорез Анализ данных

1. Откройте программное обеспечение для анализа.
2. Загрузите папку проекта. В появившемся просмотра выберите Run информация собрана в определенном ИК мощности лазера термофоретическая кривых. Существует возможность открытия всех термофоретическая следы собранные в различных условиях, таких как мощность ИК-лазер, светодиодный PАуэр, температура, концентрация и т.д.. сразу, а затем выбрать любой кривые для анализа их включения и выключения (нажмите на название эксперимента).
3. В окне графика оценки точек, выберите ТФ или ТФ с Т-прыжок. Убедитесь, что синие и красные линии расположены правильно. Чтобы получить усредненные точки со стандартными отклонениями, выберите "Использовать Средний» или «Различают работает" для отдельных трасс.
4. Для построения константа диссоциации нужным, выберите "Использовать Средний", введите и исправить меченого значения концентрации молекул (проверить "концентрации" квадрат в припадке меню окна), и установите кривую. Величина К _D с его стандартного отклонения появляется в отдельном информации всплывающем окне. Для построения установите ее с помощью гнездовым способом, выберите "Средний", гнездовым способом, а затем строите кривую. EC ₅₀ сродства с его значением стандартного отклонения показано в этом случае. Особенностью _Уб или Хилл "Граница" также может быть использован при насыщениив связанном состоянии не достигнут.
5. Сохраняем среднюю Подобрать данные в текстовый файл и передать в Excel.
6. Участок F _нормы (нормированной флуоресценции) настройки f _нормы (разность нормированного флуоресценции при различных экспериментах, по сравнению) или фракцию связан (см. формулу ниже) в зависимости от немеченого (титрование) концентрации молекул.

Фракцию Связанный (доля молекул в комплексе) = (Therm-(С) несвязанный) / (связанного несвязанного), где Therm (С) термофореза измерена концентрация С, несвязанный является ТФ в свободном состоянии (когда молекулы Не в комплексе), а граница термофореза для полностью связанном состоянии.

Результаты

Измерение сродства нефосфорилированные STAT3 связывание белка с олигонуклеотидов.

НЕК293 клетках, экспрессирующих STAT3-GFP были использованы в качестве источника флуоресцентно меченных STAT3 для связывания ДНК анализа. Клеточные лизаты получали с использованием RIPA бу?...

Обсуждение

Выражение и очистка белка является трудоемким и дорогостоящим шагом, который, однако, необходимы для определения K взаимодействий _"D большинство используемых в настоящее время способом. Применение MST позволяет избежать очистки белка таким образом, значительно упрощая и ускоря...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent/material	Company	Catalogue Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064