שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Summary

thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

Abstract

אפיון כמותי של אינטראקציות חלבון חיוני כמעט בכל תחום של מדעי חיים, ובמיוחד גילוי סמים. רוב השיטות הקיימים כיום של נחישות _D K דורשים גישה למטוהרי חלבון של עניין, דור אשר יכול להיות זמן רב ויקר. פיתחנו פרוטוקול המאפשר לקביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis microscale (MST) ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. השיטה כרוכה בביטוי יתר של החלבון ה-GFP, התמזגו ותמוגה תא שבאינו denaturing תנאים. יישום השיטה לSTAT3-GFP transiently מתבטא בתאי HEK293 אפשרו לקבוע בפעם הראשונה את הזיקה של גורם השעתוק למד היטב לoligonucleotides עם רצפים שונים. הפרוטוקול הוא פשוט, ויכול להיות מגוון רחב של יישומים לחקר אינטראקציות של חלבונים עם מולקולות קטנות, פפטידים, DNA, RNA, ו-proteins.

Introduction

אפיון כמותי של זיקה של אינטראקציות מולקולאריים חשוב בתחומים רבים של המחקר ביו. מחייבים ניתוק קבוע (K _{ד ')} הוא חיוני לא רק בגילוי סמים, אבל הוא גם פרמטר חשוב באפיון של כל אינטראקציה בינארי בכל מערכת ביולוגית. שיטות המשמשות לזיהוי ביוכימיים של אינטראקציות בין חלבונים, כגון immunoprecipitation ושמרי מסכי שני היברידיים, לא להודיע ​​לנו על כמה חזק הן אינטראקציות אלה, תוך זיקה מגדירה אם מורכב מסוים זה קיים בתנאים שניתנו in vivo. בתהליך גילוי תרופות, פיתוח assay מחייב הוא אחד ולעתים קרובות יש צורך בצעדים שדורשים זמן רב ביותר. שיטות נפוצות ביותר של נחישות _D K כוללות קיטוב הקרינה, טכנולוגית ¹ plasmon פני תהודה (SPR), ² radioligand מחייב, ³ קלורימטריה טיטרציה איזוטרמי, ⁴ equilibriאום הדיאליזה (ED), ⁵ ultrafiltration (UF), ⁵ וultracentrifugation (UC). ⁶ כל אחד מהם דורשים כמויות משמעותיות של חלבון המטרה מטוהר. thermophoresis microscale (MST) הוא שיטה המתפתחת במהירות שמזהה תנועה בבימויו של מולקולות בשיפוע טמפרטורה מיקרוסקופית. כל שינוי של מעטפת הלחות של ביומולקולות תוצאה בשינוי יחסי של תנועה לאורך שיפוע הטמפרטורה. ⁷ MST משמש כדי לקבוע זיקות מחייבות ויושם ללימוד יגנד מחייב לחלבוני שכותרתו fluorescently או ligands ניאון לחלבון המטרה. ^{8, 9} MST מאפשר מדידה של אינטראקציות ישירות בפתרון ללא צורך בקיבוע למשטח (טכנולוגיה ללא קיבוע). למעשה, כל מחייב מלווה בשינוי בMST אות, אם כי גודלו של השינוי שונה ממערכת למערכת באופן משמעותי. לצורך זיהוי של תנועת מולקולה על ידי MST, הם צריכים להיות לזרוחNT. מגבלה העיקרית של השיטה זו ניתן להפוך ליתרון. אם חלבון מתבטא כהיתוך GFP בכל מערכת, זה יהיה רק ​​מולקולת ניאון ובכך ניתן ללמוד ללא בידוד ממערכת ביטוי חופשי תא lysate התא או. הדור של lysates התא המאפשרים תנאים מחייבים עם ממצאים מינימאליים הוא האתגר הגדול. כאן אנו מתארים פרוטוקול של הכנת תא lysate וניסוי MST שיכול לשמש להרבה חלבונים מסיסים וקרום.

חלבוני STAT טמונים גורמי שעתוק cytoplasmic מופעלים על ידי זירחון טירוזין בתגובה לאותות תאיים, והם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל חסינות, hematopoiesis, דלקת, ופיתוח. ^-10 ביונקים, משפחת STAT מורכבת מ1 STAT, 2, 3, 4 , 5A, 5B, ו -6. כל הנתונים הסטטיסטיים המופעלים ידועים להיקשר לאותו רצף ה-DNA, שנקרא כך מוטיב גז, IFN-גמא הופעל רצף. עם זאת, transcriהשפעות ptional של נתונים סטטיסטיים שונות הן שונים מאוד. ¹¹ למרות המעורבות בתהליכים פתולוגיים רבים ומחקרים מקיפים מניב מעל 17,000 פרסומים, _D K של אינטראקציות STAT עם רצפי DNA שונים לא נקבע. רק זיקה היחסית של נתונים סטטיסטיים שונים לגרסות שונות של מוטיב גז התאפיינה. ¹¹ קשיים בביטוי חלבון וטיהור הם המכשולים העיקריים באפיון של ה-DNA המחייב סלקטיביות 'הסטטיסטיקה. על אף שרוב המחקרים התמקדו בתפקידו של סטטיסטיקה "מופעלת", שהפך לשם נרדף לגורם שעתוק Tyr-phosphorylated, התפקיד של נתונים סטטיסטיים שאינו phosphorylated (U-stats) ברגולציה של שעתוק מתגלה במהירות. ¹² עם זאת, מנגנונים אלה הם הבינו היטב, ולא היה ברורים אם U-STATS ממש להיקשר לדנ"א או לפעול באמצעות אינטראקציות עם גורמי שעתוק אחרים. הראנו לאחרונה כי U-STAT3 יכול להיקשר ל-DNA sequenיש CES שונה ממוטיבי גז עם זיקה גבוהה אף יותר. ¹³ הממצא השלכות משמעותיות על ההבנה של התפקודים הביולוגיים של חלבון חשוב זה שלנו. יש לנו ליישם thermophoresis microscale לקבוע זיקות יחסיות של STAT3 לגז ו-AT עשיר oligonucleotide S 100 (איור 4). פרוטוקול כמעט זהה שימש במשך נחישות _D K עבור קשירה של ליגנד STAT3 שונה, מעכב lipopeptide. ¹⁴ לא מחייב לגורם שעתוק קשור, ה-GFP-STAT1 ששימש כביקורת שלילית ניתן היה לזהות וכך אישר את הסלקטיביות של אינטראקציה. ¹⁴

Protocol

1. הכנת lysate התא

פרוטוקול זה מיועד לתאים חסיד מבטאים כל חלבון ה-GFP-התמזגו. מספר תא צורך יכול לנוע בין נמוכה כמו 10 ⁶ לרבים כמו 20 x 10 ⁶ תאים, תלוי ברמת ביטוי חלבון. לדוגמה, lysate של HEK תאי overexpressing GFP-STAT3 הוכן על ידי טיפול בתאים שגודלו 10 T75 צלוחיות ליד 70% confluency עם מאגר תמוגה 1 מ"ל. עם זאת, lysate הזה היה צריך להיות מדולל של פי 150 על מנת לספק רמה אופטימלית של הקרינה לניסוי MST. פרוטוקול תמוגה תא תלוי בחום על המאפיינים והלוקליזציה תאית של החלבון נחקר. אם אתם משתמשים בחומרי ניקוי אינו רצוי בגלל חוסר יציבות חלבון, sonication מתואר להלן, יכול להיות הבחירה הטובה ביותר. ניתן להוסיף תוספים שונים למאגר תמוגה כדי למנוע תגובות שינוי חלבון: EDTA מונע זרחון, vanadate נתרן מעכב phosphatases חלבון טירוזין, כךפלואוריד dium הוא מעכב של phosphatases Ser / Thr.

1. הכן מאגר תמוגה. לחלבוני cytoplasmic קלים כדי לחלץ-ההרכב הבא עובד היטב: 25 מ"מ טריס HCl, pH 8.0, ומעכבי פרוטאז קוקטייל מדולל פי 100 (סיגמא אולדריץ P2714, בהיקף של 2 מ"מ AEBSF, 0.3 מיקרומטר Aprotinin, bestatin מיקרומטר 130, 1 mM EDTA, 14 מיקרומטר E-64, leupeptin 1 מיקרומטר). לחלופין, לחלבונים פחות מסיסים, אפשר להשתמש חיץ Ripa מסחרי עם פרוטאז קוקטייל מעכבים וחומרי ניקוי שאינו denaturing. שמור על החיץ על קרח.
2. שטוף תאים לזמן קצר עם PBS קר כקרח באמצעות 10 מ"ל של חיץ לכל בקבוק T75. שמרו את התאים על קרח במשך 5 דקות, או עד שתאים מתחילים ניתוק מהבקבוק. לגרד תאים עם תא מגרד לנתק במידת צורך.
3. תאי Resuspend ב 10 מיליליטר הקרח הקר PBS ולהעביר צינור prechilled 14 מיליליטר סיבוב תחתון צנטריפוגה.
4. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב400-600 XG ב 4 ° C למשך 5 דקות. שלב את התאים ממספר צלוחיות בשלב זה אניF צורך.
5. הסר PBS supernatant וresuspend גלולה ב 200 μl של חיץ תמוגה קר כקרח, העברת השעיה לטרום מקורר 1.5 צינור Eppendorf מ"ל.
6. שמור את התאים על קרח כדי למזער את התחממות יתר מקומית. Lyse תאים עם 10 פעימות 3x שניות של sonication ב30% משרעת, באמצעות 2-3 מ"מ טיפ מראש צונן. שמור את הקצה מתחת לפני השטח כדי למזער את הקצף. השמט צעד זה בעת שימוש בחומרי ניקוי המכיל חיץ ולדגור על קרח למשך 30 דקות במקום.
7. תקן את פתרון lysate להכיל ריכוז מלח פיסיולוגי (100 מ"מ NaCl) במידת צורך באמצעות 5 M NaCl.
8. לאסוף lysates על ידי צנטריפוגה בכ -26,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
9. לקבוע את דילול lysate האופטימלי (כפי שמתואר בסעיף 3 להלן), והסכום של lysate הדרוש לטיטרציה אחד (בדרך כלל סביב 300 μl של lysate מראש בדילול מלא).
10. Aliquot lysate ולאחסן בטמפרטורה מתאימה לחלבון תחת חקירה (-80 מעלות צלזיוס, ברוב המקרים).

2. בחירת מאגר MST והכנה

1. מאז את אינטראקציות חלבון ליגנד תלויות בתנאי חיץ, חיץ הרכב MST נבחר בהתבסס על המאפיינים של מערכת מסוימת. זה בדרך כלל יתרון לבדיקה לפחות שני מאגרים שונים.
2. להכין 2 מאגרי MST 5x. היו לנו חוויות טובות עם שתי יצירות הבאות: HEPES (250 HEPES מ"מ, pH 7.4, 25 מ"מ MgCl _2; 500 מ"מ NaCl, 0.25% NP-40) וטריס HCl (250 מ"מ טריס HCl, pH 7.4, 750 מ"מ NaCl, 50 מ"מ MgCl _2; 0.05% Tween-20). תוספת של BSA (5% בתערובת המחייבת הסופית) יכולה לסייע במניעת הידבקות של חלבונים לצינורות פלסטיק וזכוכית נימים. יכול גם להיות כלול NaN ₃ (0.5 מ"מ) כדי למנוע צמיחה של מיקרואורגניזמים.

3. נחישות של דילול lysate האופטימלי

1. בחר את מקור עירור LED עם אורך גל λ = 470 nm על מכשיר MST.
2. טען נימים עם cell לחלץ דילול 2 ו10x עם חיץ MST.
3. לבצע את הפעולה "מצא את הנימים" בתוכנת בקרה של מכשיר MST. טווח הקרינה האופטימלי בlysate המדולל הוא מ400 עד 1,500 יחידות הקרינה.

4. קביעת טווח הריכוז האופטימלי ליגנד

1. הריכוז הגבוה ביותר של ליגנד צריך להיות לפחות 20x גבוה מקבוע דיסוציאציה הצפויה.
2. הריכוז הנמוך ביותר יגנד צריך להיות נמוך יותר מאשר ריכוז טוחנת של חלבון פלואורסצנטי.

עיין בכלי Finder ריכוז טכנולוגיות NanoTemper להערכת טווח הריכוז ליגנד.

5. הכנת lysate התא ודילולי יגנד

1. הנח מתלה צינור עם מספר דרוש (בדרך כלל 10-16) של 0.5 צינורות צנטריפוגה LoBind מ"ל על קרח. פיפטה μl 25 של חיץ MST לחלק התחתון של צינור אחד. הוסף 25 μl של פתרון מניות יגנד לאמבטיה הראשונההדואר (# 1, הריכוז הגבוה ביותר יגנד) ולבצע דילול כפול סידורי של ליגנד באמצעות שאר צינורות. שמור על המדף עם דגימות יגנד על קרח.
2. תא הפשרת lysate לאט על קרח.
3. לדלל lysate תא עם חיץ MST כדי לספק את הרמה האופטימלית של חלבון מטרת הניאון בתגובות מחייבות. ריכוז חלבון סופי צריך להיות קרוב הצפוי K _D או נמוך יותר. זה צריך להיות מותאם להשגת מספר דרוש של ספירת הקרינה בפתרון הסופי. לקביעת ריכוז ה-GFP-STAT3 בlysate, המכשיר כויל עם עזרה של העמסה. הריכוז הטוחנת של ה-GFP בlysate נקבע באמצעות היחס בין תשואות קוונטי EGFP ההעמסה ו, 0.85 ו 0.61 בהתאמה. ¹⁵

6. Microscale מחקרים מחייבים thermophoresis

1. בחר את מקור עירור LED עם λ = 470 nm על מכשיר MST.
2. 0.5 צינורות LoBind מ"ל מקום בtUbe מדף מול צינורות עם דגימות דילול סדרת יגנד. להוסיף 15 μl של lysate התא בזהירות לתחתית צינור אחד. נסה לא לגעת קירות צינור כדי למנוע אובדן מדגם.
3. הוסף 15 μl של מדגם יגנד עם הריכוז הגבוה ביותר (מס '1) לצינור המקביל # 1 עם lysate התא. מערבבים היטב ולשנות קצה פיפטה. חזור על פעולה זו עם שאר הצינורות מלבד אחרון, שאמור להכיל לא יגנד.
4. הוסף 15 μl של חיץ MST לצינור האחרון ומערבבים היטב.
5. מלא כ 2/3 מהנימים ראשונה עם התערובת המחייבת מצינור # 1, להטות אותו כדי להעביר את הפתרון לכיוון המרכז, ומניח על מגש נימי הנימים לעמדת המס '1 (העמדה הקרובה ביותר לפתיחת המגש) . חזור על פעולה זו עם שאר הנימים. קצות הנימים יכולים להיות מחוברים בשעווה לניסויים ארוכים יותר.
6. מניחים את המגש בתוך מכשיר MST ולסגור את הדלת של המכשיר.
7. מבצע "מצא את הנימים"הפקודה לתת למכשיר למצוא עמדות של הנימים מדויקות ולמדוד את הקרינה של הדגימות.
8. המבוסס על עוצמת אות הקרינה, להתאים את כוח LED (10-100%) כדי להביא אותו למרווח יחידות 400-1,500.
9. לחץ על הכפתור "התחל" כדי לבצע את ניסוי thermophoresis. יותר מפעם אחת כוח IR-לייזר יכול להיות שנבחר לניסוי על מנת למצוא את שיפוע הטמפרטורה האופטימלי למערכת המסוימת. איסוף נתונים 2-3 ריצות לאותה הקבוצה של נימי דם על מנת להבטיח את שחזור של מדידות. זה לוקח 10-12 דקות כדי להפעיל קבוצה אחת של 16 נימים.

7. ניתוח נתונים thermophoresis microscale

1. פתח את תוכנת ניתוח.
2. טען את תיקיית הפרויקט. במציג מידע הפעלה הופיע בחר נגבים בעקומות ספציפיות IR לייזר כוח thermophoretic. יש אפשרות לפתוח את כל עקבות thermophoretic נאספו בתנאים שונים, כגון כוח לייזר אינפרא אדום, LED עמ 'ower, טמפרטורה, ריכוז, וכו '. בפעם אחת ולאחר מכן בחירת עקומות כלשהן לניתוח על ידי החלפה אותם לסירוגין (לחץ על שמו של הניסוי).
3. בחלון גרף הנקודות ההערכה, בחר thermophoresis או thermophoresis עם T-קפיצה. ודא שקווים כחולים ואדומים ממוקמים בצורה נכונה. כדי להשיג את הנקודות הממוצעות עם סטיות תקן, בחר "שימוש ממוצע" או "להבחין פועל" לריצות נפרדות.
4. כדי להתוות כושר קבוע דיסוציאציה, בחר "שימוש ממוצע", ​​להיכנס ולתקן את ערך ריכוז המולקולה המסומן (סימון הריבוע "הריכוז" בתפריט חלון התאמה), ולהתאים את העקומה. ערך K _D עם סטיית התקן שלה מופיע בחלון קופץ מידע נפרד. כדי להתוות לנכון להשתמש בשיטת היל, בחר "ממוצע", ​​שיטת היל, ולאחר מכן להתאים את העקומה. ערך EC ₅₀ הזיקה עם סטיית התקן שלה מוצג במקרה זה. התכונה של "גבול" K _D או היל גם יכולה להיות מנוצל כאשר הרוויהבמצב הנכנס הוא לא הגיע.
5. שמור את נתוני הכושר הממוצעים בקובץ טקסט ולהעביר ל-Excel.
6. _נורמת עלילת F (הקרינה מנורמלת), ΔF _נורמה (הבדל בקרינה מנורמלת אם ניסויים שונים בהשוואה), או כל חלק קשור (ראה בנוסחה הבאה) כפונקציה של הריכוז ללא תווית המולקולה (טיטרציה).

שבריר Bound (חלק של מולקולות מורכבות ב) = (Therm (C), לא מאוגד) / (מאוגד-מאוגד), שבו Therm (ג) הוא thermophoresis נמדד C הריכוז, לא מאוגד הוא thermophoresis למדינה לא מאוגדת (כאשר מולקולות לא במתחם), וכרוך הוא thermophoresis למדינה מחויבת לחלוטין.

תוצאות

מדידת הזיקה של חלבון STAT3 הלא phosphorylated מחייב oligonucleotides.

HEK293 תאים לבטא STAT3-GFP שמשו כמקור STAT3 כותרתו fluorescently לassay מחייב ה-DNA. lysates התא הוכן באמצעות Ripa חיץ (20x10 ⁶ תאים / מ"ל). ללימודים מחייבים, את lysates דוללו 150X עם חיץ ה-DNA מחייב MST ?...

Discussion

ביטוי חלבון וטיהור הוא צעד מייגע ויקר, שהוא, לעומת זאת, יש צורך להגדרה של "אינטראקציות K _D על ידי שיטה הנפוצה ביותר כיום. יישום של MST מאפשר הימנעות טיהור חלבון ובכך לפשט באופן משמעותי ומאיץ אפיון כמותי של אינטראקציות. הוא מציג יתרונות משמעותיים במיוחד במקרה של ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the Reagent/material	Company	Catalogue Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064