建立一个<em&gt;在体外</em&gt;系统来研究细胞内的行为<em&gt;光滑念珠菌</em&gt;在人THP-1巨噬细胞

摘要

当前文章概述了一个协议来建立体外细胞培养模型系统来研究一种兼人体细胞内的真菌病原体光滑念珠菌与人体巨噬细胞将是一个有用的工具，以增进我们对真菌毒力机制知识的互动。

摘要

一种细胞培养模型系统中，如果主机环境条件密切模仿，可以作为一种廉价的，可再现的和容易可操纵替代动物模型系统中的微生物病原体感染的特定步骤的研究。一个人单核细胞株THP-1其中，经佛波酯治疗，分化为巨噬细胞，以前被用来研究的许多细胞内的病原体包括结核杆菌毒力的战略。在这里，我们讨论的协议制定的体外细胞培养模型使用THP-1巨噬细胞中描绘的人的机会性病原体酵母光滑念珠菌与宿主吞噬细胞的相互作用的系统。该模型系统结构简单，速度快，适合于高通量突变屏幕，并且不需要复杂的设备。一个典型的THP-1巨噬细胞感染实验大约需要24小时一个额外的24-48小时，使细胞内收回酵母生长在营养丰富的培养基进行菌落形成单位为基础的可行性分析。像其他的体外模型系统中，这种方法的一个可能的限制是难以外推得到的一个高度复杂的免疫细胞的电路存在于人类宿主的结果。然而，尽管这样，目前的协议是要阐明病原真菌可以采用回避/抵抗抗生素的反应和生存，适应和增殖的宿主免疫细胞的营养环境恶劣的策略非常有用。

引言

念珠菌是免疫功能低下患者¹危及生命的侵袭性真菌感染的主要原因。 光滑念珠菌 ，一个新兴的院内病原体，是从重症监护病房的患者取决于地理位置^1-3第二个或第三个最常见的孤立念珠菌。系统发育，C.光滑念珠菌 ，单倍体芽殖酵母，更密切相关的非致病模型酿酒酵母不是致病念珠菌。包括C。白色念珠菌 ^4。与此相一致，C。光滑缺少一些关键的真菌毒力性状，包括交配，分泌的蛋白水解活性和形态可塑性^4-5。

虽然C。光滑不形成菌丝，它可以生存和复制在小鼠和人类巨噬细胞^6-8这表明它已经开发了独特的发病机制。有限的信息，请访问有关的策略，C.采用光滑的生存贫营养的巨噬细胞内环境，抵制氧化和挂载宿主免疫细胞⁵非氧化宿主反应。一个与此相关巨噬细胞模型系统是一个先决条件划定C的相互作用光滑念珠菌与宿主吞噬细胞通过功能基因组学和蛋白质组学的方法。外周血单核细胞（PBMC）和人及鼠源的骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs），分别刚才被用来研究C的相互作用光滑念珠菌与宿主免疫细胞^7,9。然而，难以获得外周血单个核细胞和BMDMs，他们有限的生命跨度和不同哺乳动物捐助者之间的内在差异限制了这些细胞的利用率多才多艺的模型系统。

在这里，我们描述了一种建立在体外系统研究intracellul的C的AR行为光滑念珠菌细胞从人单核细胞系THP-1巨噬细胞。本协议的总体目标是制定可以很容易地操纵研究宿主真菌病原体相互作用的不同方面简单，价格低廉，快速，重现性细胞培养模型系统。

THP-1细胞先前已用于解密对广范围的病原体，包括细菌，病毒，真菌和^10-12的宿主免疫应答。单核细胞THP-1细胞易于维护，并且可以区分，在佛波酯治疗，巨噬细胞它模仿人类单核细胞源性巨噬细胞和表达适当的巨噬细胞标记物^13。 THP-1巨噬细胞模型系统的主要优点是易于使用性和缺乏先进的设备要求。

这里介绍的协议是很容易适应学习其他人的真菌病原体与居屋的相互作用吨的免疫细胞。当前的过程也可以用来识别毒力因子的感兴趣使用高通量突变体屏幕上的病原体。这证明型概念例证的成功使用THP-1培养模型系统来识别一组在人类巨噬细胞⁸所需的光滑念珠菌生存的56个基因。

研究方案

建议在执行C。光滑念珠菌感染的实验与生物安全防护水平的2实验室（BSL-2）。

1. 制备THP-1巨噬细胞单层。
2. C.编制光滑念珠菌细胞悬液。
3. THP-1巨噬细胞C的感染光滑的细胞。
4. 测量通过集落形成单位测定吞噬率和细胞内复制。
5. 监控用共聚焦激光扫描显微镜细胞内复制。

1。 THP-1巨噬细胞单分子膜的制备

1. THP-1是一个1岁男孩患急性单核细胞白血病¹⁴痛苦的外周血来源的人类单核细胞系。 THP-1中，悬浮细胞系，是经常在潮湿的5％CO ₂中在补充有10％FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基中维持在37℃。治疗与佛波醇12 - myristaTE 13 - 乙酸酯（PMA，佛波酯）导致的THP-1单核细胞的终末分化成巨噬细胞。重要的是，PMA处理不影响细胞活力及分化的细胞不分裂。
2. 种子约1.5×10 ⁶ THP-1单核细胞在100毫米的培养皿中，在RPMI-1640完全培养基（RPMI-1640培养基补充有10％血清，2mM谷氨酰胺和1x抗生素;为10ml /皿），并让细胞生长在37 °℃，5％CO ₂的2天。
3. 一旦THP-1细胞已经达到了8×10 ⁵细胞/ ml的密度，将培养皿转移至细胞培养物层流罩，轻轻地摇动它重新悬浮沉淀的细胞。
4. 吸取细胞悬液出来，放入15毫升无菌试管中并离心分离机以1000rpm（130×g离心）4分钟。弃上清，并暂停THP-1细胞沉淀在5ml新鲜，预热的培养基，RPMI-1640完全培养基中。
5. 列举细胞用血细胞计数器和稀的大公升悬浮至10 ⁶个细胞/ ml用预热的RPMI-1640完全培养基中的终浓度
6. 加入1μl的160毫米PMA股票（佛波醇12 - 十四烷酸酯-13 - 乙酸酯溶液制备的二甲基亚砜）至10 ml THP-1细胞悬液（终浓度为16纳米）拌匀。分配1毫升细胞悬液到24孔组织培养板的各孔中，并在保持在37℃，5％CO ₂的12小时培养箱孵育板。
7. 除去旧培养基，加入1 ml预热的RPMI-1640完全培养基中，并让细胞恢复12小时，于37℃在5％CO _2。
8. 观察在倒置显微镜下观察细胞，以确保椭圆形的THP-1单核细胞的悬浮液已分化为扁平，梭形和附着的巨噬细胞。这些分化的细胞现在已经准备好进行C。光滑念珠菌感染的研究。

2。 C.编制光滑 ＆＃160;细胞悬浮

光滑念珠菌野生型菌株BG2将被用于感染的THP-1巨噬细胞。C.光滑念珠菌细胞常规培养在液体YPD（酵母提取物（1％）-蛋白胨（2％）-葡萄糖（2％））培养基中。固体YPD培养基中，加入2％的琼脂培养基在高压灭菌前制备。

1. 为了准备C.文化光滑念珠菌 ，挑取单个菌落从琼脂平板上，用无菌的，一次性环，接种到10ml的YPD液体培养基和14-16小时，孵育在30℃下振荡（200rpm）下
2. 离心该培养（1毫升）在4,000 rpm（1,800×g离心）5分钟，在台式微量离心机，三次洗涤细胞，用无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4）中，并暂停细胞沉淀在1ml PBS中。
3. C.测量外径₆₀₀ 光滑念珠菌细胞悬浮液，并用无菌PBS中适当体积稀释到获得的2×10 ⁶个细胞/ ml的密度（OD ₆₀₀= 0.1）。或者，所需的细胞密度可以通过使用血球计数酵母细胞来实现。

3。的THP-1巨噬细胞与C感染光滑念珠菌细胞

1. 加入50微升C。光滑念珠菌细胞悬浮液以THP-1巨噬细胞（每24孔培养板的井10 ⁶个细胞接种），得到的MOI为0.1（感染复数）孵育板在37℃下用5％的CO _2。
2. 为了确定可行的酵母计数，稀释50微升C.光滑念珠菌细胞悬液100倍的无菌PBS和板100微升在YPD固体培养基。孵育板在30°C和手工清点后1-2天出现酵母菌菌落数。这些数字将，从此，被称为0小时C。光滑的CFUs（菌落形成单位）。
3. 后的THP-1细胞与C的2小时共培养通过反相24孔培养板光滑细胞，弃培养基我呐水库和轻轻地洗三次，用预热无菌PBS去除nonphagocytosed外三光滑的细胞。轻柔洗涤，用PBS是绝对必要的，以实现完全除去所有细胞外的酵母而不会造成对THP-1巨噬细胞单层的任何损坏。

4。通过集落形成单位测定吞噬率和细胞内复制的测量

1. 裂解C。光滑念珠菌感染的THP-1巨噬细胞以1毫升无菌H _{2 O}的2分钟，轻轻刮掉，除去从井的巨噬细胞碎片和在微量离心管收集细胞裂解液。的完整的巨噬细胞裂解微观验证是举足轻重的所有内在化酵母的回收​​。
2. 制备100倍稀释的溶胞产物的无菌PBS，板100微升在YPD固体培养基中孵育板在30℃下
3. 1-2天后，手动计数C的数光滑念珠菌菌落APpeared YPD培养基上，乘以稀释倍数（2小时的CFU），并计算吞噬率是指C的百分比是由THP-1巨噬细胞后2小时共同孵育使用下列公式计算摄入的光滑念珠菌细胞。
   ％吞噬= [（CFU的在2小时）/（CFU的，在0小时）]×100
4. 测量C的胞内复制的速率光滑念珠菌细胞在THP-1巨噬细胞，在不同时间点感染后，即收集细胞酵母。 4，6，8，10，12，和24小时，通过重复步骤3.3-4.3。
5. 计算C的折叠生存/复制光滑念珠菌细胞在THP-1巨噬细胞中通过将总的CFUs在任何给定时间点与那些在2小时（吞噬的酵母）。

5。细胞内复制的使用共焦拉斯监控呃扫描显微镜

1. 以下在第1节中所述的步骤，种子PMA处理的5×10 ⁵个THP-1细胞中的2 4 -孔室玻片各孔中，在37℃，5％CO ₂下12小时。
2. 更换旧培养基用预热的RPMI-1640完全培养基中和允许细胞从PMA处理恢复12小时。
3. 制备GFP（绿色荧光蛋白）标记的C.光滑念珠菌细胞悬浮液作为第2节所述，感染到的THP-1巨噬细胞为1的MOI。如果C。光滑念珠菌菌株表达GFP不可用，用FITC标记的（荧光素异硫氰酸酯）的酵母细胞，可用于监测早期事件感染后即 。吞噬率和phagolysosomal成熟时2小时。
4. 孵育玻片2小时，在37℃，5％CO _2，反转它们仔细地丢弃培养基，用无菌洗3次，预热的PBS中。
5. 加入500μl预热的RPMI-1640完全的Medi微米至1滑动的各腔室，并用5％CO ₂的22小时孵育它在37℃。
6. 要解决2小时C。光滑念珠菌感染的THP-1巨噬细胞，加入500μl的3.7％甲醛（在PBS中制备的）的其他幻灯片的各腔室和孵化它在室温下放置20分钟，在黑暗中。
7. 洗净用PBS三次滑动，加入500μl的Triton-X（0.7％），并在室温下孵育5分钟，在黑暗中。
8. 滑洗3次，用PBS，从文化的幻灯片中删除室和空气干燥在黑暗中3-5分钟。
9. 使用含DAPI的Vectashield封固剂（4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚）上滑动，避免形成气泡小心装入盖玻片。轻轻地取出多余的液体用的Kimwipe和密封盖玻片的边缘用指甲油。在黑暗中，在4°C，直到使用存储的幻灯片。
10. 重复步骤5.4和5.6-5.9处理THP-1细胞24小时后的感染。
11. 使用激光扫描confo细胞图像卡尔显微镜（60X油浸物镜，激发波长为405纳米和488纳米的DAPI和GFP染色，分别）。

结果

PMA处理的THP-1巨噬细胞C.感染分析光滑念珠菌的野生型（wt）细胞中发现， 重量细胞，巨噬细胞在2小时后共同培养的速率的55-65％，吞噬。此外，C。光滑念珠菌细胞能够由THP-1巨噬细胞的抗杀并进行了适度的5 -至与THP-1巨噬细胞的共培养⁸的24小时后的7倍增加的CFUs。野生型细胞，转化有表达GFP的质粒，在THP-1巨噬细胞内的复制，也验证了用共聚焦荧光显微镜...

讨论

先天免疫系统中起着的机会性真菌感染的控制中起重要作用。巨噬细胞促进食入​​和破坏病原真菌的抗真菌防御。因此，所需要的生存和/或对抗巨噬细胞的抗菌功能的因素，阐明将增进我们对真菌毒力的战略认识。在这方面，我们已经建立了使用来自人单核细胞系THP-1巨噬细胞以表征一个人的机会性真菌病原体C的相互作用在体外细胞培养模型系统光滑念珠菌与宿主吞噬细胞...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	Caution: Hazardous
YPD	BD-Difco	242710	For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS)			Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)			Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer			Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium	Vector Labs	H-1200	For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes	Corning	430167	To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate	Corning	3527	To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide	BD Falcon	REF354104	To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer	Rohem India		For enumeration of cells
Table top microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 18	For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge	Remi	R-8C	For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator	Labtech	Refrigerated	To grow C. glabrata cells
Shaker incubator	New Brunswick	Innova 43	To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	To culture THP-1 cells
Confocal microscope	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope	Olympus	CKX 41	To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine	BioRad	DNA Engine	To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven	Labnet	Problot 12S	For hybridization
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	For scanning hybridized membranes
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit	Alphainnontech	Alphaimager	To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels