Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

Zusammenfassung

Der aktuelle Artikel beschreibt ein Protokoll, um eine In-vitro-Zellkultur-Modellsystem, um die Interaktion einer fakultativ intrazellulären Humanfunguspathogen Candida glabrata mit menschlichen Makrophagen, die ein nützliches Werkzeug, um unser Wissen von Pilz Virulenzmechanismen voranzubringen studieren zu etablieren.

Zusammenfassung

Eine Zellkultur-Modellsystem, wenn ein enger Mimik von Host-Umweltbedingungen können als preiswerte, reproduzierbare und leicht manipulierbare Alternative zu Tiermodellsysteme für die Untersuchung von einem bestimmten Schritt der mikrobielle Erreger der Infektion dienen. Eine menschliche Monozyten-Zelllinie THP-1, welche bei Phorbolester-Behandlung wird in Makrophagen unterscheiden, wurde bereits früher verwendet, um die Virulenz Strategien vieler intrazelluläre Erreger wie Mycobacterium tuberculosis studieren. Hier ein Protokoll, ein in vitro Zellkulturmodell zu erlassen diskutieren wir System mit THP-1 Makrophagen, um die Wechselwirkung eines opportunistischen Pathogens menschlichen Hefe Candida glabrata mit Host phagozytischen Zellen abzugrenzen. Dieses Modellsystem ist einfach, schnell, offen für Hochdurchsatz-Mutante Bildschirme, und erfordert keine hoch entwickelten Geräten. Eine typische THP-1-Makrophagen-Infektionsversuch dauert ca. 24 Stunden mit einer zusätzlichen Stunde 24-48 wiederhergestellt intrazellulären ermöglichenHefe auf reichen Medium für koloniebildende Einheit-basierte Analyse Rentabilität wachsen. Wie andere in-vitro-Modellsysteme, ist eine mögliche Einschränkung dieses Ansatzes Schwierigkeiten bei Extrapolation der zu einer sehr komplexen Immunzellschaltkreis in den menschlichen Wirt vorhandenen erzielten Ergebnisse. Trotz dieser, ist jedoch die aktuelle Protokoll sehr nützlich, um die Strategien, die eine Pilzerreger verwenden kann, zu umgehen / entgegenzuwirken antimikrobielle Reaktion und zu überleben, anzupassen, und vermehren sich in den nährstoffarmen Umfeld von Wirtsimmunzellen aufzuklären.

Einleitung

Candida-Spezies sind die führende Ursache von lebensbedrohlichen invasiven Pilzinfektionen bei immunsupprimierten Patienten ^ein. Candida glabrata, einer aufstrebenden nosokomiale Erreger, ist die zweite oder dritte am häufigsten isolierten Candida-Spezies aus Intensivstation Patienten, abhängig von der geographischen Lage ^3.1. Phylogenetisch, C. glabrata, einem haploiden Hefezellen, enger mit den nicht pathogenen Modell Hefe Saccharomyces cerevisiae als pathogene Candida spp. einschließlich C. ⁴ albicans. In Übereinstimmung damit, C. glabrata fehlen einige Schlüsselpilz Virulenz inklusive Gegen, sekretierten proteolytischen Aktivität und morphologische Plastizität ^4-5.

Obwohl C. glabrata bildet keine Hyphen, es zu überleben und zu replizieren in murinen und humanen Makrophagen ^6-8 was darauf hindeutet, dass es einzigartig Pathogenese-Mechanismen entwickelt wurden, können. Nur begrenzte Informationen über die Strategien zur Verfügung, die C. glabrata beschäftigt, um zu überleben nährstoffarmen intrazellulären Makrophagen Umwelt und oxidative und nicht-oxidative entgegenzuwirken Wirtsreaktionen von Immunzellen ⁵ montiert. Ein entsprechendes Modell Makrophagen-System ist eine Voraussetzung, um die Wechselwirkung von C abgrenzen glabrata mit Wirts Phagozyten über funktionelle Genom-und Proteom-Ansätzen. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) und Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDMs) des humanen und murinen Ursprungs sind, sind früher verwendet worden, um die Wechselwirkung von C zu studieren glabrata mit Wirtsimmunzellen ^7,9. , Schwierigkeiten bei der Beschaffung von PBMCs und BMDMs, ihre begrenzte Lebensdauer und intrinsische Unterschiede zwischen den verschiedenen Säugetier Spender beschränken jedoch die Verwendung dieser Zellen als vielseitige Modellsysteme.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Etablierung eines in vitro-System, das intracellul studierenar Verhalten von C. glabrata Zellen in Makrophagen aus menschlichen Monozyten-Zelllinie THP-1 abgeleitet. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls war es, eine einfache, kostengünstige, schnelle und reproduzierbare Zellkultur-Modellsystem, die leicht manipuliert werden kann, um verschiedene Aspekte der Wirt-Pilz-Pathogen-Interaktion untersuchen zu erlassen.

THP-1-Zellen wurden bereits verwendet, um die Immunantwort gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze ^10-12 entziffern. Monozytären THP-1-Zellen sind leicht zu pflegen und kann unterschieden werden, bei Phorbolester-Behandlung, um Makrophagen, Monozyten-Makrophagen der menschlichen Mimik und Express entsprechenden Makrophagen-Marker ^13. Die wichtigsten Vorteile der THP-1-Makrophagen-Modellsystem sind die einfache Bedienbarkeit und das Fehlen von hoch entwickelten Geräten Anforderung.

Die hier vorgestellte Protokoll ist leicht anpassbar, um die Interaktion von anderen menschlichen Pilzerreger mit hos studierenT-Immunzellen. Das derzeitige Verfahren kann auch eingesetzt werden, um Virulenzfaktoren für die Krankheitserreger von Interesse mit hohem Durchsatz nach Mutanten zu identifizieren. Diese Proof-of-concept wurde durch die erfolgreiche Anwendung von THP-1-Kulturmodellsystem, um einen Satz von 56 Genen, die für das Überleben von C. glabrata in humanen Makrophagen ⁸ erforderlich sind beispielhaft zu identifizieren.

Protokoll

Es wird empfohlen, C auszuführen glabrata Infektionsversuche im Labor mit Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2).

1. Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monoschicht.
2. Vorbereitung von C. glabrata Zellsuspension.
3. Infektion von THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata-Zellen.
4. Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über koloniebildende Einheit-Assay.
5. Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie.

1. Herstellung von THP-1 Makrophagen-Monolayer

1. THP-1 ist eine menschliche Monozyten-Zelllinie aus dem peripheren Blut eines 1-jährigen männlichen Kind leidet unter akuter Monozytenleukämie ¹⁴ abgeleitet. THP-1-Zelllinie wurde eine Suspension, wird routinemäßig bei 37 ° C in befeuchteter 5% CO ₂ in RPMI-1640-Kulturmedium mit 10% FBS (fötales Rinderserum) ergänzt gehalten. Die Behandlung mit Phorbol 12-myristate 13-Acetat (PMA, ein Phorbolester) führt die terminale Differenzierung von THP-1 Monozyten zu Makrophagen. Wichtig ist, dass PMA-Behandlung keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen und differenzierten Zellen nicht teilen.
2. Samen ungefähr 1,5 x 10 ⁶ THP-1 Monozyten in 100 mm Kulturschalen in RPMI-1640-Vollmedium (RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% Serum, 2 mM Glutamin und Antibiotika 1x; 10 ml / Schale) und lassen Zellen wachsen bei 37 ° C in 5% CO ₂ für 2 Tage.
3. Sobald THP-1-Zellen haben eine Dichte von 8 x 10 ⁵ Zellen / ml erreicht, übertragen Sie die Kulturschale zu der Zellkultur Laminarströmungshaube und schwenken Sie es ständiger Zellen resuspendieren.
4. Pipettieren Sie die Zellsuspension aus, legen Sie in eine 15 ml sterilen Röhrchen und Zentrifuge bei 1000 rpm (130 xg) für 4 min. Überstand verwerfen und aussetzen THP-1-Zellpellet in 5 ml frisches, vorgewärmt, RPMI-1640-Komplettmedium.
5. Auflisten von Zellen mit einer Zählkammer und verdünnt das cell Suspension auf eine endgültige Dichte von 10 ⁶ Zellen / ml mit vorgewärmten RPMI 1640 Komplettmedium
6. 1 ul von 160 mM PMA Lager (Phorbol-12-Myristate 13-Acetat-Lösung in Dimethylsulfoxid hergestellt) in 10 ml THP-1-Zellsuspension (Endkonzentration 16 nM) und gut mischen. Verzichten 1 ml Zellsuspension in jede Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte und inkubieren Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 12 h gehalten.
7. Entfernen Sie alte Medium, 1 ml vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen für 12 Stunden bei 37 ° C in 5% CO ₂ zu erholen.
8. Beachten Zellen unter einem umgekehrten Mikroskop zu gewährleisten, dass ovale THP-1 Monozyten-Zellen in Suspension wurden in abgeflacht spindelförmige und haftende Makrophagen differenziert. Diese differenzierten Zellen sind nun bereit, C führen glabrata Infektionsstudien.

2. Vorbereitung von C. glabrata & #160; Zellsuspension

C. glabrata Wildtyp-Stamm Bg2 werden zur THP-1-Makrophagen infizieren werden. C glabrata Zellen in flüssigem YPD (Hefeextrakt (1%), Pepton (2%)-Dextrose (2%)) Medium routinemßig kultiviert. Solide YPD-Medium wird durch Zugabe von 2% Agar vor dem Autoklavieren Medium vorbereitet.

1. Um eine Kultur von C. vorbereiten glabrata, wählen Sie eine einzelne Kolonie aus dem Agar-Platte mit einer sterilen Einweg-Schleife und impfen in 10 ml YPD-Flüssigmedium und Inkubation für 14-16 h mit Schütteln (200 rpm) bei 30 ° C
2. Zentrifuge dieser Kultur (1 ml) bei 4000 Upm (1800 × g) für 5 min in einer Tischmikrozentrifuge, waschen Sie die Zellen dreimal mit sterilem PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4) und Aussetzung Zellpellet in 1 ml PBS.
3. Messung der OD ₆₀₀ C. glabrata Zellsuspension verdünnt und mit einem geeigneten Volumen an steriler PBS auf eine Dichte von 2 x 10 ⁶ Zellen / ml zu erhalten (OD ₆₀₀= 0.1). Alternativ kann die gewünschte Zelldichte durch Zählen Hefezellen mit einer Zählkammer erreicht werden.

3. Infektion von THP-1 Makrophagen mit C. glabrata Zellen

1. In 50 ul C. glabrata Zellsuspension auf THP-1-Makrophagen (10 ⁶ Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte), um ein MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,1 zu erhalten, und Inkubieren Platte bei 37 ° C mit 5% CO _2.
2. Um lebensfähig Hefe zählt zu bestimmen, verdünnte 50 ul C. glabrata Zellsuspension 100-fach in sterilem PBS und Platte 100 ul auf YPD-Festmedium. Platten bei 30 ° C und zählen die Anzahl der manuell Hefe-Kolonien nach 1-2 Tagen erscheinen. Diese Zahlen werden von nun an, wie hr 0 C bezeichnet werden glabrata KBE (koloniebildende Einheiten).
3. Nach 2 h Co-Kultivierung von THP-1-Zellen mit C. glabrata Zellen, Ablagekulturmedium durch Umkehren 24-Loch-Gewebekulturplatte ina Reservoir und vorsichtig waschen dreimal mit sterilem PBS auf vorgewärmten nonphagocytosed extrazellulären C entfernen glabrata-Zellen. Schonwaschschritten mit PBS sind absolut notwendig, um eine vollständige Entfernung aller extrazellulären Hefe, ohne dass Schäden an der THP-1-Makrophagen-Monolage zu erreichen.

4. Messung der Phagozytose und intrazelluläre Replikationsrate über Kolonie bildende Einheit Assay

1. Lyse C. glabrata THP-1-infizierten Makrophagen in 1 ml sterilem H ₂ O 2 min, kratzen sanft auf die Makrophagen-Ablagerungen aus dem Bohrloch zu entfernen und sammeln Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Mikroskopische Prüfung von kompletten Makrophagen-Lyse ist entscheidend für die Wiederherstellung aller verinnerlicht Hefe.
2. Bereiten Sie eine 100-fache Verdünnung des Lysats in sterilem PBS, Platte 100 ul auf YPD-Festmedium Platten und Inkubation bei 30 ° C
3. Nach 1-2 Tagen rechnen manuell die Anzahl der C glabrata Kolonien, aperschien auf YPD-Medium, multiplizieren mit Verdünnungsfaktor (2 Std. KBE) und berechnen Phagozytose Geschwindigkeit, die der Prozent der C bezieht sich glabrata Zellen, THP-1 durch Makrophagen nach 2 h Koinkubation aufgenommen unter Verwendung der folgenden Formel.
   % Phagozytose = [(KBE bei 2 h) / (CFU bei 0 h)] x 100
4. Um die Rate der intrazellulären Replikation von C messen glabrata Zellen in THP-1-Makrophagen, sammeln intrazellulären Hefe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion, dh. 4, 6, 8, 10, 12 und 24 h, durch Wiederholen der Schritte von 3,3 bis 4,3.
5. Berechnen fach Überleben / Replikation von C. glabrata Zellen THP-1 in Makrophagen durch Division der Gesamtzahl CFUs zu einem bestimmten Zeitpunkt mit den in 2 h (phagozytiert Hefe).

5. Überwachung von intrazellulären Replikation mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie

1. Nach den in Abschnitt 1 beschriebenen Schritte, Saatgut PMA-behandelten 5 x 10 ⁵ THP-1-Zellen in jeder Vertiefung von zwei vier-und Kammer-Objektträgern und bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 12 Stunden.
2. Ersetzen Sie alte Medium mit vorgewärmten RPMI-1640-Komplettmedium und lassen Zellen aus PMA-Behandlung für 12 Stunden zu erholen.
3. Bereiten GFP (green fluorescent protein)-markierten C glabrata Zellsuspension, wie in Abschnitt 2 beschrieben, und infizieren zu THP-1-Makrophagen zu einer MOI von 1. Wenn C. glabrata GFP-exprimierenden Stämme sind nicht verfügbar, Hefe-Zellen mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat) markiert ist, kann verwendet werden, um zu überwachen frühen Ereignisse nach der Infektion nämlich. Phagozytose Rate und phagolysosomale Reifung bei 2 Stunden.
4. Folien für 2 Stunden bei 37 ° C mit 5% CO _2, invertieren sie sorgfältig zu waschen Medium verwerfen und 3x mit sterilem, vorgewärmtes PBS.
5. Add 500 ul vorgewärmten RPMI-1640-Komplett mediUM zu jeder Kammer von einer Folie und inkubieren sie bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für 22 Stunden.
6. Um dies zu beheben 2 h C glabrata-THP-1-infizierten Makrophagen, 500 ul 3,7% Formaldehyd (in PBS) zu jeder Kammer des anderen Schlitten und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten im Dunkeln.
7. Wash schieben dreimal mit PBS, 500 ul Triton-X (0,7%), und bei Raumtemperatur für 5 min im Dunkeln.
8. Wash Rutsche 3x mit PBS, entfernen Kammer von Kulturträger und Luft trocknen Sie es für 3-5 min im Dunkeln.
9. Vorsichtig aufsetzen eines Deckglases mit Vectashield Montage-Medium mit DAPI (4 ',6-Diamino-2-phenylindol) auf Folie Blasenbildung zu vermeiden. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit mit Kimwipe und dichten Deck Ränder mit Nagellack. Schiebespeicher im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Verwendung.
10. Wiederholen Sie die Schritte 5,4 und von 5,6 bis 5,9 zu verarbeiten THP-1-Zellen 24 Stunden nach der Infektion.
11. Bildzellen unter Verwendung eines Laser-Scanning-confoMikroskope (60X Ölimmersionsobjektiv, Anregung bei 405 nm und 488 nm für DAPI und GFP-Färbung, beziehungsweise).

Ergebnisse

Infektion Analysen von PMA-behandelten THP-1 Makrophagen, die mit C. glabrata Wildtyp (wt)-Zellen ergab, dass Gew. Zellen durch Makrophagen mit einer Rate von 55-65% nach 2 h Koinkubation phagozytiert. Weitere, C. glabrata Zellen konnten Tötung von THP-1-Makrophagen wider und unterzog sich einer moderaten 5 - bis 7-fachen Anstieg der KBE nach 24 h Kokultur mit THP-1-Makrophagen ^8. Intrazelluläre Replikation von Wildtyp-Zellen, transformiert mit GFP-exprimierenden Plasmid,...

Diskussion

Angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von opportunistischen Pilzinfektionen. Makrophagen tragen zur Verteidigung durch die Einnahme und Zerstörung der Pilzerreger Antimykotika. Somit wird Aufklärung von Faktoren, die für das Überleben und / oder Bekämpfung der antimikrobiellen Funktionen erforderlich sind Makrophagen unser Verständnis von Pilz Virulenz Strategien voraus. In diesem Zusammenhang haben wir ein in-vitro-Zellkultur-Modellsystem unter Verwendung von Makrophagen aus...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	Caution: Hazardous
YPD	BD-Difco	242710	For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS)			Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)			Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer			Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium	Vector Labs	H-1200	For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes	Corning	430167	To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate	Corning	3527	To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide	BD Falcon	REF354104	To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer	Rohem India		For enumeration of cells
Table top microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 18	For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge	Remi	R-8C	For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator	Labtech	Refrigerated	To grow C. glabrata cells
Shaker incubator	New Brunswick	Innova 43	To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	To culture THP-1 cells
Confocal microscope	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope	Olympus	CKX 41	To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine	BioRad	DNA Engine	To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven	Labnet	Problot 12S	For hybridization
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	For scanning hybridized membranes
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit	Alphainnontech	Alphaimager	To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels