Создание<em&gt; В пробирке</em&gt; Система по изучению внутриклеточных Поведение<em&gt; Candida glabrata</em&gt; В человека ТНР-1 макрофагов

Резюме

В данной статье описываются протокол о создании в пробирке модель культуры клеток системы для изучения взаимодействия факультативного внутриклеточного человека грибкового патогена Candida glabrata с человеческих макрофагах, которые будут полезным инструментом для продвижения наших знаний о грибковых механизмов вирулентности.

Аннотация

Модель культуры клеток системы, если близкий имитировать принимающих условий окружающей среды, может служить в качестве недорогого, воспроизводимым и легко можно манипулировать альтернативы животных модельных систем для изучения конкретного шага микробного возбудителя инфекции. Моноцитарный линия клеток человека ТНР-1, которая после лечения эфира форболовым, дифференцируется в макрофаги, ранее был использован для изучения вирулентности стратегии многих внутриклеточных патогенов, включая микобактерий туберкулеза. Здесь мы рассмотрим протокол ввести в действие в пробирке модель культуры в клетки Система, использующая ТНР-1 макрофагов, чтобы очертить взаимодействие оппортунистической человека дрожжей возбудителя Candida glabrata с хост фагоцитов. Эта модель системы является простым, быстрым, поддаются высокой пропускной экранов мутантных, и не требует сложного оборудования. Типичный ТНР-1 макрофагов инфекция эксперимент занимает около 24 час с дополнительным 24-48 часов, чтобы позволить восстановленный внутриклеточныхдрожжей расти на богатой среде для колониеобразующих единиц на основе анализа жизнеспособности. Как и другие в пробирке модельных систем, возможное ограничение этого подхода является трудность при экстраполяции результатов, полученных в очень сложной схемы иммунных клеток, существующих в человеческого организма. Тем не менее, несмотря на это, в настоящее время протокол является очень полезным для выяснения стратегии, которые грибковая возбудитель может использовать, чтобы избежать / противодействовать антимикробной ответ и выжить, приспособиться, и размножаются в бедных питательными веществами среде принимающих иммунных клеток.

Введение

Виды Candida являются ведущей причиной угрожающих жизни инвазивных грибковых инфекций у пациентов с иммунодефицитом ^1. Candida glabrata, возникающие внутрибольничные патоген, является вторым или третьим наиболее часто изолированы видов Candida от пациентов отделения интенсивной терапии в зависимости от географического положения ^1-3. Филогенетически С. glabrata, гаплоидны бутонизации дрожжи, более тесно связаны с непатогенными модель дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE чем патогенного Candida SPP. включая C. Albicans ^4. В соответствии с этим, C. glabrata не хватает некоторых ключевых грибковых вирулентности черты в том числе спаривания, выделяемый протеолитической активности и морфологической пластичности ^4-5.

Хотя С. glabrata не образует гифы, она может выжить и размножаться в мышиных и человеческих макрофагах ^6-8 предполагая, что она разработала уникальные механизмы патогенез. Общество с ограниченной информация доступна о стратегиях, что C. glabrata работают, чтобы выжить бедных питательными веществами внутриклеточный макрофагов среды и противодействия окислению и неокислительного ответов хоста, установленные принимающими иммунных клеток ^5. Уместно макрофагов модель системы является необходимым условием, чтобы очертить взаимодействие C. glabrata с фагоцитирующих клеток-хозяев с помощью функциональных геномики и протеомики подходов. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и мозга, полученных макрофаги костей (BMDMs) человеческого и мышиного происхождения, соответственно, раньше использовались для изучения взаимодействия C. glabrata с принимающими иммунных клеток ^7,9. Тем не менее, трудности в получении МНПК и BMDMs, их ограниченная продолжительность жизни и внутренняя изменчивость между различными донорами млекопитающих ограничить использование этих клеток, как универсальные модели системы.

Здесь мы опишем метод для создания системы в пробирке для изучения intracellulар поведение С. glabrata клетки макрофагов, полученных из клеточной линии моноцитов человека ТНР-1. Общая цель этого протокола было принять простой, недорогой, быстрый и воспроизводимый культуры клеток модельную систему, которая может быть легко манипулировать для изучения различных аспектов принимающей-грибкового патогена взаимодействия.

Клетки ТНР-1 ранее использовались, чтобы расшифровать иммунного ответа против широкого спектра патогенных микроорганизмов, включая бактерии, вирусы и грибки ^10-12. Моноцитарные клетки ТНР-1 просты в обслуживании и могут быть дифференцированы, при обработке форбол эфира, с макрофагами, которые имитируют моноцитарных макрофаги людских и выражают соответствующие маркеры макрофагов ^13. Основные преимущества ТНР-1 макрофагов модельной системы являются простота в использовании и отсутствие сложных требований оборудования.

Протокол, представленные здесь легко адаптируется для изучения взаимодействия других человека грибковых патогенов с шлюшкат иммунные клетки. Нынешний процедура также может быть использован для идентификации факторов вирулентности для возбудителя интереса, используя высокую пропускную способность экранов мутантные. Это доказательство правильности концепции был примером чего является успешное использование ТНР-1 модели культуры системы выявления набор 56 генов, которые необходимы для выживания С. glabrata в человеческих макрофагах ^8.

протокол

Рекомендуется выполнять C. glabrata инфекции эксперименты в лаборатории с защитной биобезопасности уровня 2 (BSL-2).

1. Подготовка ТНР-1 макрофагов монослое.
2. Подготовка C. glabrata клеточной суспензии.
3. Заражение ТНР-1 макрофагов с С. glabrata клетки.
4. Измерение скорости фагоцитоза и внутриклеточного репликации через колониеобразующие единицы анализа.
5. Мониторинг внутриклеточного репликации с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

1. Подготовка ТНР-1 макрофагов монослоя

1. ТНР-1 представляет собой линию человеческих моноцитов клеток, полученную из периферической крови в 1-летнего ребенка мужского пола, страдающих от острого моноцитарного лейкоза ^14. THP-1, суспензию клеточной линии, рутинно поддерживали при 37 ° С в увлажненной атмосфере 5% CO ₂ в среде RPMI-1640 культуральной среде, содержащей 10% FBS (фетальной бычьей сывороткой). Лечение форбол 12-myristaт. е. 13-ацетата (РМА, форболовым эфиром) приводит к терминальной дифференцировки ТНР-1 моноцитами в макрофаги. Важно отметить, что лечение PMA не влияет на жизнеспособность клеток и дифференцированные клетки не делятся.
2. Семя примерно 1,5 х 10 ⁶ ТНР-1 моноцитов в 100 мм чашки для культивирования в среде RPMI-1640 полную среду (среда RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки, 2 мМ глутамина и 1х антибиотиков; 10 мл / чашку), и пусть клетки растут на 37 ° С в 5% CO ₂ в течение 2 дней.
3. После того, как клетки ТНР-1, достигли плотность 8 х 10 ⁵ клеток / мл, передача культуры блюдо в клеточной культуральной ламинарном боксе и нежно вихревой его осажденные клетки ресуспендируют.
4. Внесите клеточной суспензии из поместите в 15 мл стерильной пробирке и центрифуге при 1000 оборотов в минуту (130 мкг) в течение 4 мин. Удалите супернатант и приостановить ТНР-1 осадок клеток в 5 мл свежей, предварительно нагретые, RPMI-1640 полной среды.
5. Перечислять клетки с гемоцитометре и разбавить CELл суспензии до конечной концентрации 10 ⁶ клеток / мл с предварительно нагретой среде RPMI-1640 полной среды
6. Добавить 1 мкл 160 мМ PMA складе (форбол-12-миристат раствор 13-ацетата в диметилсульфоксиде) в 10 мл ТНР-1 клеточной суспензии (конечная концентрация 16 нМ) и хорошо перемешать. Разлить 1 мл клеточной суспензии в каждую лунку планшета для культуры ткани 24-луночный и инкубировать пластины в инкубатор, поддерживаемой при 37 ° С с 5% CO ₂ в течение 12 часов.
7. Удалить старые среду, добавить 1 мл предварительно нагретой среде RPMI-1640 полной среды и позволяют клеткам восстановить в течение 12 часов при температуре 37 ° С в 5% СО _2.
8. Соблюдайте клетки под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться, что овальные ТНР-1 моноцитов клеток в суспензии были дифференцированы в уплощенных, веретенообразных и прилипшие макрофагов. Эти дифференцированные клетки теперь готовы провести C. glabrata инфекции исследования.

2. Подготовка C. glabrata & #160; клеточной суспензии

C. glabrata штамма дикого типа Bg2 будут использованы для инфицирования ТНР-1 макрофагов. C. glabrata клетки обычно культивируют в жидкой YPD (дрожжевой экстракт (1%)-пептон (2%), декстроза (2%)) среды. Твердый носитель YPD получают добавлением 2% агара до среднего автоклавированием.

1. Для подготовки культуры С. glabrata, выбрать одну колонию вверх от агаром стерильной, одноразовой петлей и переливая ее 10 мл YPD жидкой среде и выдержать в течение 14-16 часов при встряхивании (200 оборотов в минуту) при 30 ° С
2. Центрифуга эту культуру (1 мл) при 4000 оборотов в минуту (1800 мкг) в течение 5 мин в настольной микроцентрифуге, мыть клетки трижды стерильной PBS (фосфатно-солевой буфер, рН 7,4) и приостановить осадок клеток в 1 мл PBS.
3. Измерьте OD ₆₀₀ из С. glabrata клеточной суспензии и разбавляют соответствующем объеме стерильной PBS, чтобы получить плотность 2 х 10 ⁶ клеток / мл (ОП ₆₀₀= 0,1). С другой стороны, желаемой плотности клеток может быть достигнуто путем подсчета дрожжевых клеток с помощью гемоцитометра.

3. Заражение ТНР-1 макрофагов с С. glabrata Клетки

1. Добавить 50 мкл C. glabrata клеточной суспензии в ТНР-1 макрофагов (10 ⁶ клеток высевали на лунку культуральной пластины 24-луночный), чтобы получить MOI (множественности заражения) 0,1 и инкубируют планшет при 37 ° С с 5% CO _2.
2. Для определения жизнеспособных микроорганизмов дрожжи, разбавленные 50 мкл C. glabrata суспензию клеток в 100 раз в стерильном PBS и пластины 100 мкл на YPD твердой среде. Инкубируют планшеты при 30 ° С и вручную рассчитывать количество дрожжевых колоний, возникающих после 1-2 дней. Эти цифры будут отныне быть отнесены как 0 час C. glabrata КОЕ (колониеобразующих единиц).
3. Через 2 ч сокультивировани из THP-1 клеток с C. glabrata клетки, отменить культуральной среды путем обращения 24-а планшета для культуры ткани япа водохранилище и мыть осторожно трижды нагретого стерильного PBS для удаления nonphagocytosed внеклеточный C. glabrata клетки. Нежные промывок PBS являются абсолютно необходимыми для достижения полного удаления всех внеклеточной дрожжей, не причинив никакого ущерба ТНР-1 макрофагов монослоя.

4. Измерение фагоцитоза Оценить и внутриклеточного репликации через колониеобразующие единицы Пробирной

1. Lyse С. glabrata заражены ТНР-1 макрофагов в 1 мл стерильной H ₂ O в течение 2 мин, очистить осторожно, чтобы удалить макрофагальную мусор из скважины и собирать клеточный лизат в микроцентрифужных трубки. Микроскопическое проверка полного макрофагов лизиса имеет решающее значение для восстановления всех интернализованной дрожжей.
2. Подготовьте 100-кратного разведения лизата в стерильной PBS, плиты 100 мкл на YPD твердой среде и инкубировать пластин при 30 ° С
3. Через 1-2 дней, рассчитывать вручную количество С. glabrata колонии, что арpeared на YPD среде, размножаются с коэффициентом разбавления (2 часа КОЕ) и рассчитать фагоцитоз тариф, который ссылается на процентов С. glabrata клетки, которые внутрь по ТНР-1 макрофагами после 2 ч coincubation по следующей формуле.
   % Фагоцитоз = [(КОЕ на 2 ч) / (КОЕ при 0 ч)] х 100
4. Для измерения скорости внутриклеточного размножения C. glabrata клетки в ТНР-1 макрофагов, собирать внутриклеточный дрожжи в разное время точек после заражения IE. 4, 6, 8, 10, 12 и 24 часа в сутки, повторяя этапы 3.3-4.3.
5. Рассчитать раза выживания / репликацию С. glabrata клетки ТНР-1 макрофагов путем деления общей КОЕ в любой данный момент времени с тем, на 2 ч (фагоцитированы дрожжей).

5. Мониторинг внутриклеточного репликации с помощью конфокальной Lasэ сканирующей микроскопии

1. После действия, описанные в разделе 1, семян PMA-обработанных 5 х 10 ⁵ клеток ТНР-1 в каждую лунку двух четырехэтажных а слайды камеры и инкубировать при 37 ° С с 5% CO ₂ в течение 12 часов.
2. Замените старый субстрат с нагретого RPMI-1640 полной среде и позволяют клеткам восстановиться после лечения PMA в течение 12 часов.
3. Подготовка GFP (зеленый флуоресцентный белок) с метками C. glabrata клеточной суспензии, как описано в разделе 2 и заразить чтобы ТНР-1 макрофагов к МВД 1. Если С. glabrata напрягает выражая GFP отсутствуют, дрожжевые клетки, меченные FITC (флуоресцеинизотиоцианатом) может быть использован для мониторинга ранние события после заражения именно. Скорость фагоцитоз и phagolysosomal созревания на 2 часа.
4. Инкубируйте слайды в течение 2 часов при 37 ° С с 5% CO _2, тщательно инвертировать их отбросить среды и промыть 3 раза стерильным, предварительно нагретого PBS.
5. Добавить 500 мкл предварительно нагретой среде RPMI-1640 полный Mediит в каждой камере одного слайда и инкубировать при 37 ° С с 5% CO ₂ в течение 22 часов.
6. Чтобы исправить 2 часов C. glabrata-инфицированных ТНР-1 макрофагов, добавьте 500 мкл 3,7% формальдегида (полученного в PBS) в каждую камеру другого слайда и инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин в темноте.
7. Вымойте слайд трижды PBS, добавить 500 мкл Тритон-X (0,7%), и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин в темноте.
8. Вымойте слайд 3x с PBS, удалить камеру из культуральной горкой и воздуха высушить его в течение 3-5 мин в темноте.
9. Осторожно установите покровное использованием Vectashield монтажную среду, содержащую DAPI (4 ',6-диамидино-2-фенилиндола) на слайде избегая образования пузырьков. Удалить мягко лишнюю жидкость с Kimwipe и печать покровное края с лака для ногтей. Магазин слайд в темноте при температуре 4 ° С до использования.
10. Повторите шаги 5,4 и 5,6-5,9 для обработки клеток ТНР-1 24 ч после инфицирования.
11. Клетки изображений с помощью лазерного сканирования confoкал микроскоп (60X масло-иммерсионный объектив, возбуждение при 405 нм и 488 нм для DAPI и GFP пятна, соответственно).

Результаты

Заражение анализ обработанных РМА-THP-1 макрофагов с C. glabrata дикого типа (WT) клетки показали, что клетки были мас фагоцитированы макрофагами в размере 55-65% Через 2 ч coincubation. Кроме того, С. glabrata клетки были способны противостоять убийство по ТНР-1 макрофагами и прошли умерен...

Обсуждение

Врожденной иммунной системы играет важную роль в контроле патогенных грибковых инфекций. Макрофаги способствовать противогрибковым защиту при приеме внутрь и разрушения грибкового патогена. Таким образом, выяснение факторов, которые необходимы для выживания и / или противодействия ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	Caution: Hazardous
YPD	BD-Difco	242710	For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS)			Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)			Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer			Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium	Vector Labs	H-1200	For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes	Corning	430167	To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate	Corning	3527	To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide	BD Falcon	REF354104	To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer	Rohem India		For enumeration of cells
Table top microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 18	For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge	Remi	R-8C	For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator	Labtech	Refrigerated	To grow C. glabrata cells
Shaker incubator	New Brunswick	Innova 43	To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	To culture THP-1 cells
Confocal microscope	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope	Olympus	CKX 41	To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine	BioRad	DNA Engine	To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven	Labnet	Problot 12S	For hybridization
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	For scanning hybridized membranes
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit	Alphainnontech	Alphaimager	To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels