Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

Resumen

El presente artículo describe un protocolo para establecer un sistema modelo de cultivo celular in vitro para estudiar la interacción de un hongo patógeno intracelular facultativo humano Candida glabrata con macrófagos humanos que será una herramienta útil para avanzar en el conocimiento de los mecanismos de virulencia de hongos.

Resumen

Un sistema de modelo de cultivo celular, si un cierre sinóptico de las condiciones ambientales de acogida, puede servir como una alternativa económica, reproducible y fácilmente manipulable para sistemas de modelos animales para el estudio de un paso específico de la infección por patógenos microbianos. Una línea celular de monocitos humanos THP-1 que, tras el tratamiento del éster de forbol, se diferencia en macrófagos, que anteriormente se ha utilizado para estudiar las estrategias de virulencia de muchos patógenos intracelulares, incluyendo Mycobacterium tuberculosis. Caso, hablamos de un protocolo para promulgar un modelo in vitro de cultivo celular en sistema utilizando macrófagos THP-1 para delinear la interacción de un patógeno oportunista humano levadura Candida glabrata con células fagocíticas anfitrión. Este modelo de sistema es simple, rápido, susceptible de mutante pantallas de alto rendimiento, y no requiere de equipo sofisticado. Un típico THP-1 macrófagos infección experimento tarda aproximadamente 24 horas con un 24 a 48 horas más para permitir intracelular recuperadolevadura para crecer en medio rico para formación de colonias análisis de viabilidad basado en unidades. Al igual que otros sistemas de modelos in vitro en, una posible limitación de este enfoque es la dificultad en la extrapolación de los resultados obtenidos a un complejo altamente circuitos de célula inmune existente en el huésped humano. Sin embargo, a pesar de esto, el protocolo actual es muy útil para dilucidar las estrategias que un hongo patógeno puede emplear para evadir / anula la respuesta a los antimicrobianos y sobrevivir, adaptarse y proliferar en el ambiente pobre en nutrientes de las células inmunitarias del huésped.

Introducción

Las especies de Candida son la causa principal de las infecciones fúngicas invasivas potencialmente mortales en pacientes inmunodeprimidos ^1. Candida glabrata, un patógeno nosocomial emergente, es la segunda o tercera especie más frecuentemente aislada de Candida procedentes de pacientes de la Unidad de Cuidado Intensivo, dependiendo de la ubicación geográfica ^1-3. Filogenéticamente, C. glabrata, una incipiente levadura haploides, está más estrechamente relacionado con los Saccharomyces no modelo de la levadura patógena cerevisiae que al patógeno Candida spp. incluyendo C. albicans ^4. Consistente con esto, C. glabrata carece de algunos rasgos de virulencia fúngicas clave, incluyendo el apareamiento, la actividad proteolítica secretada y plasticidad morfológica ^4-5.

Aunque C. glabrata no forma hifas, puede sobrevivir y replicarse en macrófagos murinos y humanos ^6-8 lo que sugiere que se ha desarrollado mecanismos de la patogénesis únicas. Hay poca información acerca de las estrategias que C. glabrata emplea para sobrevivir intracelular entorno macrófagos pobre en nutrientes y contrarrestar oxidativo y respuestas de acogida no oxidativos montados por las células inmunes del huésped ^5. Un modelo de sistema de macrófagos pertinente es un requisito previo para delimitar la interacción de C. glabrata con células fagocíticas de acogida a través de enfoques de genómica y proteómica funcionales. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y los macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) de origen humano y murino, respectivamente, han sido utilizados anteriormente para estudiar la interacción de C. glabrata con las células inmunitarias del huésped ^7,9. Sin embargo, la dificultad en la obtención de PBMC y BMDMs, su tiempo de vida limitado y la variación intrínseca entre las diferentes donantes de mamíferos restringen la utilización de estas células como sistemas de modelos versátiles.

Aquí se describe un método para la creación de un sistema in vitro para estudiar el intracellulcomportamiento ar de C. células glabrata en los macrófagos derivados de monocitos humanos línea celular THP-1. El objetivo general de este protocolo fue promulgar un sistema modelo de cultivo celular simple, barata, rápida y reproducible que puede ser fácilmente manipulado para estudiar diferentes aspectos de la interacción patógeno-huésped fúngica.

Las células THP-1 se han utilizado previamente para descifrar la respuesta inmune del huésped contra una amplia gama de patógenos, incluyendo bacterias, virus, y hongos ^10-12. Células monocitos THP-1 son fáciles de mantener y pueden ser diferenciados, tratamiento previo de éster de forbol, a los macrófagos que imitan los macrófagos derivados de los monocitos de humano y expresan marcadores de macrófagos apropiados ^13. Las principales ventajas de la THP-1 sistema de modelo de macrófagos son la facilidad de uso y la falta de equipo sofisticado requisito.

El protocolo que se presenta aquí es fácilmente adaptable para estudiar la interacción de otros hongos patógenos humanos con hoscélulas T inmunes. El procedimiento actual también se puede emplear para identificar los factores de virulencia para el patógeno de interés utilizando pantallas de mutantes de alto rendimiento. Esta prueba de concepto fue ejemplificado por el uso exitoso de THP-1 sistema de modelo de cultivo para identificar un conjunto de 56 genes que son necesarios para la supervivencia de C. glabrata en los macrófagos humanos ^8.

Protocolo

Se recomienda llevar a cabo C. glabrata infección experimentos en un laboratorio con nivel de contención de bioseguridad 2 (BSL-2).

1. Preparación de células THP-1 macrófagos monocapa.
2. Preparación de C. suspensión de células glabrata.
3. La infección de las células THP-1 macrófagos con C. células glabrata.
4. Medición de la tasa de fagocitosis y la replicación intracelular a través de la formación de colonias de ensayo unidad.
5. Monitoreo de la replicación intracelular usando microscopía confocal de barrido láser.

1. Preparación de células THP-1 de macrófagos de la capa monomolecular

1. THP-1 es una línea celular de monocitos humanos derivados de la sangre periférica de un hijo varón de 1 año de edad, que sufre de leucemia monocítica aguda ^14. THP-1, una línea de células en suspensión, se mantiene habitualmente a 37 ° C en humidificado 5% de CO ₂ en medio de cultivo RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS (suero fetal bovino). El tratamiento con forbol 12-myristaTE 13-acetato (PMA, un éster de forbol) resulta en la diferenciación terminal de células THP-1 células monocíticas en macrófagos. Es importante destacar que, PMA tratamiento no afecta a la viabilidad celular y las células diferenciadas no se dividen.
2. Semilla de aproximadamente 1,5 x 10 ⁶ monocitos THP-1 en placas de 100 mm de cultivo en medio RPMI-1640 medio completo (medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero, glutamina 2 mM y 1x antibióticos; 10 ml / placa) y dejar que las células crezcan a 37 ° C en 5% de CO ₂ durante 2 días.
3. Una vez que las células THP-1 han alcanzado una densidad de 8 x 10 ⁵ células / ml, transvasar la placa de cultivo a la campana de flujo laminar cultivo celular y mezcle suavemente para resuspender las células asentadas.
4. Pipetear la suspensión celular, coloque en un tubo estéril de 15 ml y centrifugar a 1000 rpm (130 xg) durante 4 min. Desechar el sobrenadante y suspender THP-1 pellet de células en 5 ml precalentado, medio completo fresco, RPMI-1640.
5. Enumerar las células con un hemocitómetro y se diluye la cell de suspensión a una densidad final de 10 ⁶ células / ml con medio RPMI completo precalentado-1640
6. Añadir 1 l de 160 mM de stock de PMA (forbol solución de 13-acetato de 12-miristato preparado en sulfóxido de dimetilo) a 10 ml de THP-1 suspensión de células (concentración final 16 nM) y mezclar bien. Dispensar 1 ml de suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos y se incuba la placa en la incubadora se mantiene a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 12 horas.
7. Retire el medio viejo, añadir 1 ml precalentado RPMI-1640 completo y permiten que las células se recuperen durante 12 horas a 37 ° C en 5% de CO _2.
8. Observar las células bajo un microscopio invertido para asegurar que las células THP-1 monocitos de forma ovalada en suspensión se han diferenciado en aplanados, macrófagos en forma de huso y adherentes. Estas células diferenciadas están ahora listos para llevar a cabo C. estudios de infección glabrata.

2. Preparación de C. glabrata & #Suspensión celular; 160

C. glabrata cepa de tipo salvaje Bg2 será utilizado para infectar macrófagos THP-1. C. glabrata células son cultivadas rutinariamente en líquido YPD (extracto de levadura (1%)-peptona (2%)-dextrosa (2%)) medio. Medio YPD sólido se prepara mediante la adición de 2% de agar antes de medio de tratamiento en autoclave.

1. Para preparar un cultivo de C. glabrata, escoja una sola colonia a partir de la placa de agar con un asa estéril, desechable e inocular en medio líquido 10 ml de YPD e incubar durante 14-16 horas con agitación (200 rpm) a 30 ° C.
2. Centrífuga de esta cultura (1 ml) a 4000 rpm (1800 xg) durante 5 minutos en una microcentrífuga de mesa, lavar las células tres veces con PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7.4) estéril y suspender sedimento celular en 1 ml de PBS.
3. Mida OD ₆₀₀ de C. suspensión de células glabrata y diluir con un volumen apropiado de PBS estéril para obtener una densidad de 2 x 10 ⁶ células / ml (OD ₆₀₀= 0,1). Alternativamente, la densidad celular deseada se puede lograr mediante el recuento de células de levadura usando un hemocitómetro.

3. La infección de las células THP-1 macrófagos con C. Las células glabrata

1. Añadir 50 l C. glabrata suspensión de células de macrófagos THP-1 (10 ⁶ células sembradas por pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos) para obtener una MOI (multiplicidad de infección) de 0,1 y se incuba la placa a 37 ° C con 5% de CO _2.
2. Para determinar el recuento de levaduras viables, diluir 50 l C. glabrata de células en suspensión de 100 veces en PBS estéril y la placa 100 l en medio sólido YPD. Incubar las placas a 30 ° C y contar manualmente el número de colonias de levadura que aparecen después de 1-2 días. Estos números, en adelante, se denominarán como 0 hr C. glabrata UFC (unidades formadoras de colonia).
3. Después de 2 horas de cocultivo THP-1 células con C. células glabrata, medio de cultivo de los descartes mediante la inversión de 24 pocillos placa de cultivo de tejidos ina depósito y lavar suavemente tres veces con PBS estéril precalentada para eliminar nonphagocytosed extracelular C. células glabrata. Lavados suaves con PBS son absolutamente esenciales para lograr la eliminación completa de toda la levadura extracelular sin causar ningún daño a la THP-1 macrófagos monocapa.

4. Medición de la fagocitosis tarifas y replicación intracelular a través de formación de colonias de ensayo Unidad

1. Lyse C. glabrata infecta macrófagos THP-1 en 1 ml de H ₂ O estéril durante 2 minutos, raspar suavemente para eliminar los restos de los macrófagos del pozo y recoger lisado celular en un tubo de microcentrífuga. Verificación microscópica de la lisis de los macrófagos completa es fundamental para la recuperación de toda la levadura interiorizado.
2. Prepare una dilución de 100 veces de lisado en PBS estéril, placa 100 l en medio sólido YPD y se incuban las placas a 30 ° C.
3. Después de 1-2 días, contar manualmente el número de C. glabrata colonias que appeared en medio YPD, se multiplican con factor de dilución (2 hr UFC) y calcular la tasa de fagocitosis, que se refiere al porcentaje de C. células glabrata que son ingeridos por THP-1 macrófagos después de la coincubación 2 h utilizando la siguiente fórmula.
   % De fagocitosis = [(CFU a las 2 h) / (UFC en 0 h)] X 100
4. Para medir la tasa de replicación intracelular de C. células glabrata en THP-1 macrófagos, recogen levaduras intracelulares en diferentes puntos de tiempo después de la infección, es decir. 4, 6, 8, 10, 12, y 24 horas, por pasos 3.3 a 4.3 repetir.
5. Calcular veces la supervivencia / replicación de C. células glabrata en THP-1 macrófagos dividiendo las UFC totales en cualquier punto de tiempo dado con los de 2 horas (levadura fagocitados).

5. Seguimiento de intracelular replicación mediante confocal LasER Scanning Microscopy

1. Si sigue los pasos descritos en la sección 1, las semillas tratadas con PMA 5 x 10 ⁵ células THP-1 en cada pocillo de dos portaobjetos de cámara de cuatro pocillos y se incuba a 37 ° C con 5% de CO ₂ durante 12 horas.
2. Sustituya el medio viejo con RPMI-1640 completo precalentado y permiten que las células se recuperen de PMA tratamiento durante 12 horas.
3. Preparar GFP (proteína fluorescente verde)-etiquetados C. suspensión celular glabrata como se describe en la Sección 2 e infectar a los macrófagos THP-1 a una MOI de 1. Si C. glabrata cepas que expresan GFP no están disponibles, células de levadura etiquetadas con FITC (isotiocianato de fluoresceína) se pueden utilizar para supervisar los eventos tempranos después de la infección a saber. tasa de fagocitosis y la maduración fagolisosómico a las 2 horas.
4. Incubar los portaobjetos durante 2 horas a 37 ° C con 5% de CO _2, invierta cuidadosamente para descartar medio y lavar 3 veces con estéril precalentado PBS.
5. Añadir 500 l precalentado RPMI-1640 medi completaum a cada cámara de un porta y se incuba que a 37 º C con _CO2 al 5% durante 22 horas.
6. Para solucionar 2 hr C. infectados por glabrata THP-1 macrófagos, añadir 500 l de 3,7% de formaldehído (preparado en PBS) a cada cámara del otro porta y se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad.
7. Lave deslice tres veces con PBS, añadir 500 l de Triton-X (0,7%), y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min en la oscuridad.
8. Lave 3x diapositivas con PBS, retire la cámara de diapositivas cultura y el aire seco durante 3-5 minutos en la oscuridad.
9. Monte cuidadosamente un cubreobjetos utilizando medio de montaje Vectashield que contiene DAPI (4 ',6-diamino-2-fenilindol) en la diapositiva evitando la formación de burbujas. Retire suavemente el exceso de líquido con Kimwipe y sellar los bordes cubreobjetos con esmalte de uñas. Diapositiva tienda en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso.
10. Repita los pasos 5.4 y 5.6 a 5.9 para procesar las células THP-1 24 horas después de la infección.
11. Células de imagen mediante una confo escaneo láserCal microscopio (60X objetivo de inmersión en aceite, excitación a 405 nm y 488 nm para DAPI y las manchas de GFP, respectivamente).

Resultados

Analiza Infección del PMA tratados THP-1 macrófagos con C. células de tipo salvaje glabrata (en peso) revelaron que las células wt fueron fagocitados por los macrófagos a una velocidad de 55-65% después de 2 horas coincubación. Además, C. células glabrata podían resistir a la destrucción por macrófagos THP-1 y se les realizó un moderado 5 - al aumento de 7 veces en el UFC después de 24 h de cocultivo con macrófagos THP-1 ^8. La replicación intracelul...

Discusión

Sistema inmune innato desempeña un papel importante en el control de las infecciones fúngicas oportunistas. Los macrófagos contribuyen a antifúngica defensa por ingestión y destrucción del hongo patógeno. Por lo tanto, la elucidación de los factores que se requieren para la supervivencia y / o contrarrestar las funciones antimicrobianas de macrófagos avanzará nuestra comprensión de las estrategias de virulencia de hongos. En este contexto, hemos establecido un sistema in vitro modelo de cultivo celul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	Caution: Hazardous
YPD	BD-Difco	242710	For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS)			Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)			Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer			Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium	Vector Labs	H-1200	For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes	Corning	430167	To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate	Corning	3527	To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide	BD Falcon	REF354104	To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer	Rohem India		For enumeration of cells
Table top microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 18	For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge	Remi	R-8C	For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator	Labtech	Refrigerated	To grow C. glabrata cells
Shaker incubator	New Brunswick	Innova 43	To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	To culture THP-1 cells
Confocal microscope	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope	Olympus	CKX 41	To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine	BioRad	DNA Engine	To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven	Labnet	Problot 12S	For hybridization
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	For scanning hybridized membranes
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit	Alphainnontech	Alphaimager	To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels