Istituzione di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema per studiare intracellulare Comportamento<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In umani THP-1 macrofagi

Riepilogo

L'attuale articolo descrive un protocollo per stabilire un sistema cellulare modello di coltura in vitro per studiare l'interazione di una facoltativo intracellulare patogeno fungino umano Candida glabrata con i macrofagi umani che saranno un utile strumento per far progredire la nostra conoscenza dei meccanismi di virulenza fungine.

Abstract

Un sistema cellulare modello di coltura, se un vicino mimo di condizioni ambientali ospitanti, può servire come un'alternativa economica, riproducibile e facilmente manipolabile per sistemi modello animale per lo studio di una fase specifica di infezione microbica patogeno. Una linea cellulare monocitica umana THP-1 che, al momento phorbol trattamento estere, è differenziato in macrofagi, è già stata utilizzata per studiare le strategie di virulenza di molti patogeni intracellulari, tra cui Mycobacterium tuberculosis. Qui, discutiamo un protocollo di emanare una cellula in vitro modello di cultura sistema che utilizza THP-1 macrofagi per delineare l'interazione di un opportunista lievito Candida glabrata agente patogeno umano con fagociti host. Questo sistema modello è semplice, veloce, suscettibili di schermi mutanti high-throughput, e non richiede attrezzature sofisticate. Un tipico esperimento THP-1 infezione dei macrofagi richiede circa 24 ore con un ulteriore 24-48 ore per permettere intracellulare recuperatolievito di crescere su terreno ricco di formanti colonia analisi fattibilità basato su unità. Come altri sistemi modello in vitro, un possibile limite di questo approccio è la difficoltà di estrapolare i risultati ottenuti da una circuiteria cellule immunitarie altamente complesso esistente nell'ospite umano. Tuttavia, nonostante questo, l'attuale protocollo è molto utile per chiarire le strategie che un patogeno fungino può utilizzare per eludere / contrastare risposta antimicrobica e sopravvivere, adattarsi e proliferare in un ambiente povero di nutrienti delle cellule immunitarie dell'ospite.

Introduzione

Specie di Candida sono la principale causa di infezioni fungine invasive potenzialmente letali nei pazienti immunocompromessi ^1. Candida glabrata, un patogeno nosocomiale emergente, è il secondo o il terzo più frequentemente isolati specie di Candida da pazienti nell'unità di terapia intensiva a seconda della posizione geografica ^1-3. Filogeneticamente, C. glabrata, un lievito in erba aploidi, è più strettamente legato alle Saccharomyces non lievito modello patogeno cerevisiae che a patogeni Candida spp. tra cui C. albicans ^4. Coerentemente con questo, C. glabrata manca di alcune caratteristiche di virulenza fungine chiave, tra cui l'accoppiamento, attività proteolitica secreto e la plasticità morfologica ^4-5.

Sebbene C. glabrata non forma ife, può sopravvivere e riprodursi nei macrofagi murini ed umani ^6-8 suggerendo che essa ha sviluppato meccanismi di patogenesi unici. Sono disponibili informazioni limitate circa le strategie che C. glabrata impiega per sopravvivere nell'ambiente intracellulare dei macrofagi poveri di nutrienti e contrastare ossidativo e risposte dell'ospite nonoxidative montati da ospite cellule immunitarie ^5. Un pertinente modello di sistema dei macrofagi è un prerequisito per delineare l'interazione di C. glabrata con fagociti host tramite approcci di genomica e proteomica funzionale. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) e macrofagi derivate dal midollo osseo (BMDMs) di origine umana e murina, rispettivamente, sono prima stati utilizzati per studiare l'interazione di C. glabrata con ospite cellule immunitarie ^7,9. Tuttavia, la difficoltà nell'ottenere PBMC e BMDMs, la loro durata di vita limitata e la variazione intrinseca tra i diversi donatori mammiferi limitano l'utilizzo di queste cellule sistemi modello come versatili.

Qui, descriviamo un metodo per la creazione di un sistema in vitro per studiare la intracellulcomportamento ar di C. cellule glabrata in macrofagi derivati ​​dalla linea cellulare monocitica umana THP-1. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un modello di sistema di coltura cellulare semplice, poco costoso, veloce e riproducibile che può essere facilmente manipolato per studiare diversi aspetti di interazione ospite-patogeno fungino.

Cellule THP-1 sono stati precedentemente utilizzati per decifrare la risposta immunitaria contro una vasta gamma di agenti patogeni quali batteri, virus e funghi ^10-12. Monocitaria THP-1 le cellule sono di facile manutenzione e possono essere differenziati, previo trattamento esteri phorbol, ai macrofagi che imitano i macrofagi derivate da monociti di risorse umane ed esprimono adeguatamente i marcatori macrofagi ^13. I principali vantaggi di THP-1 sistema modello macrofagi sono la facilità d'uso e la mancanza di sofisticate apparecchiature requisito.

Il protocollo qui presentato è facilmente adattabile a studiare l'interazione di altri patogeni fungini umani con host cellule immunitarie. L'attuale procedura può anche essere impiegato per identificare i fattori di virulenza per l'agente patogeno di interesse utilizzando schermi mutanti alto rendimento. Questa prova di concetto è stato esemplificato dal successo nell'uso di THP-1 sistema modello di coltura per identificare un insieme di 56 geni che sono necessari per la sopravvivenza di C. glabrata in macrofagi umani ^8.

Protocollo

Si consiglia di eseguire C. glabrata esperimenti di infezione in un laboratorio con livello di biosicurezza di contenimento 2 (BSL-2).

1. Preparazione di THP-1 macrofago monostrato.
2. Preparazione di C. sospensione cellulare glabrata.
3. Infezione di cellule THP-1 macrofagi con C. cellule glabrata.
4. Misurazione della frequenza fagocitosi e replicazione intracellulare tramite unità formanti colonie saggio.
5. Monitoraggio della replica intracellulare mediante microscopio confocale a scansione laser.

1. Preparazione di THP-1 macrofagi Monolayer

1. THP-1 è una linea cellulare monocitica umana derivata dal sangue periferico di un 1 anni figlio maschio affetto da leucemia monocitica ^14. THP-1, una linea cellulare di sospensione, viene normalmente mantenuta a 37 ° C in umidificata al 5% di CO ₂ nel terreno di coltura RPMI-1640 supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino). Il trattamento con phorbol 12-myristaTE 13-acetato (PMA, un estere del forbolo) provoca differenziazione terminale di cellule THP-1 monociti in macrofagi. È importante sottolineare che il trattamento PMA non pregiudica la vitalità cellulare e le cellule differenziate non si dividono.
2. Seme circa 1,5 x 10 ⁶ THP-1 monociti in 100 piatti mm cultura in RPMI-1640 completa (medio RPMI-1640 integrato con il 10% di siero, glutammina 2 mM e 1x antibiotici, 10 ml / piatto) e lasciare le cellule crescono a 37 ° C in 5% CO ₂ per 2 giorni.
3. Una volta THP-1 le cellule hanno raggiunto una densità di 8 x 10 ⁵ cellule / ml, trasferire il piatto cultura alla cappa di coltura cellulare a flusso laminare e agitare delicatamente per risospendere le cellule insediate.
4. Pipettare la sospensione cellulare, posizionate in una provetta sterile 15 ml e centrifugare a 1000 rpm (130 xg) per 4 min. Gettare il surnatante e sospendere THP-1 pellet di cellule in 5 ml fresco, preriscaldata, medie completo RPMI-1640.
5. Enumerare le celle con un emocitometro e diluire il celsospensione l per una densità finale di 10 ⁶ cellule / ml con mezzo completo RPMI preriscaldata-1640
6. Aggiungere 1 ml di 160 mM PMA magazzino (phorbol soluzione di 13-acetato 12-myristate preparato in dimetilsolfossido) a 10 ml THP-1 sospensione cellulare (concentrazione finale 16 nM) e mescolare bene. Pipettare 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti ed incubare piastra in incubatore mantenuto a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 12 ore.
7. Rimuovere il vecchio mezzo, aggiungere 1 ml preriscaldata RPMI-1640 completa e consentono alle cellule di recuperare per 12 ore a 37 ° C in 5% di CO _2.
8. Osservare le cellule sotto un microscopio invertito per garantire che forma ovale cellule THP-1 monocitiche in sospensione sono stati differenziati in appiattite, macrofagi mandrino a forma e aderenti. Queste cellule differenziate sono ora pronti a condurre C. Gli studi di infezione glabrata.

2. Preparazione di C. glabrata & #Sospensione cellulare; 160

C. glabrata ceppo selvatico Bg2 verrà utilizzato per infettare THP-1 macrofagi. C. cellule glabrata sono ordinariamente coltivate in YPD liquido (estratto di lievito (1%)-Peptone (2%)-destrosio (2%)) medio. Mezzo YPD solido viene preparata aggiungendo 2% agar prima media autoclave.

1. Per preparare una coltura di C. glabrata, scegliere una singola colonia su dalla piastra di agar con una sterile, monouso ciclo e inoculare in 10 ml di mezzo YPD liquido e incubare per 14-16 ore con agitazione (200 rpm) a 30 ° C.
2. Centrifugare questa cultura (1 ml) a 4.000 giri (1.800 xg) per 5 minuti in una microcentrifuga da tavolo superiore, lavare le cellule tre volte con PBS sterile (PBS, pH 7,4) e sospendere pellet di cellule in 1 ml di PBS.
3. Misurare OD ₆₀₀ di C. sospensione cellulare glabrata e diluire con un volume adeguato di PBS sterile per ottenere una densità di 2 x 10 ⁶ cellule / ml (OD ₆₀₀= 0.1). In alternativa, la densità cellulare desiderata può essere ottenuta contando le cellule di lievito con un emocitometro.

3. Infezione di cellule THP-1 Macrofagi con C. Celle glabrata

1. Aggiungere 50 microlitri C. sospensione cellulare glabrata di THP-1 macrofagi (10 ⁶ cellule seminate in ogni pozzetto di una piastra di coltura a 24 pozzetti) per ottenere un MOI (molteplicità di infezione) di 0,1 e Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO _2.
2. Per determinare i conteggi vitali di lievito, diluire 50 ml C. glabrata cell sospensione 100 volte in PBS sterile e piatto 100 microlitri su terreno solido YPD. Incubare le piastre a 30 ° C e contare manualmente il numero di colonie di lievito che compaiono dopo 1-2 giorni. Questi numeri, d'ora in poi, essere indicate come 0 hr C. glabrata CFU (unità formanti colonie).
3. Dopo 2 ore coculturing di cellule THP-1 con C. cellule glabrata, terreno di coltura di rigetto invertendo 24-pozzetti di coltura tissutale ina serbatoio e lavare delicatamente tre volte con PBS sterile preriscaldata per rimuovere nonphagocytosed extracellulare C. cellule glabrata. Lavaggi delicati con PBS sono assolutamente essenziali per realizzare la completa rimozione di tutti lievito extracellulare senza causare alcun danno al THP-1 macrofagi monostrato.

4. Misurazione della fagocitosi Rate e intracellulare replica tramite Colony Forming saggio Unità

1. Lyse C. glabrata infettato THP-1 macrofagi in 1 ml sterile H ₂ O per 2 min, raschiare delicatamente per rimuovere i detriti macrofago dal pozzo e raccogliere lisato cellulare in una provetta da microcentrifuga. Verifica microscopica di completa lisi dei macrofagi è fondamentale per il recupero di tutti lievito interiorizzato.
2. Preparare una diluizione 100 volte di lisato in PBS sterile, piatto 100 microlitri su terreno solido YPD e incubare le piastre a 30 ° C.
3. Dopo 1-2 giorni, contare manualmente il numero di C. glabrata colonie che appeared su terreno YPD, si moltiplicano con fattore di diluizione (2 ore CFU) e calcolare tasso di fagocitosi che si riferisce alla percentuale di C. cellule glabrata che vengono ingerite da THP-1 macrofagi dopo 2 ore coincubation utilizzando la seguente formula.
   % Fagocitosi = [(CFU a 2 h) / (CFU a 0 h)] X 100
4. Per misurare la velocità di replicazione intracellulare di C. cellule glabrata in THP-1 macrofagi, raccolgono lievito intracellulare in tempi diversi punti dall'infezione esempio. 4, 6, 8, 10, 12 e 24 ore, ripetendo i passaggi 3,3-4,3.
5. Calcola piega sopravvivenza / replica di C. cellule glabrata in THP-1 macrofagi dividendo CFU totali in qualsiasi punto del tempo con quelli di 2 ore (lievito fagocitati).

5. Monitoraggio della replica intracellulare Uso confocale Laser Microscopia a Scansione

1. Seguendo i passi descritti nella Sezione 1, sementi PMA-trattati 5 x 10 ⁵ cellule THP-1 in ciascun pozzetto di due diapositive da camera a quattro pozzetti e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 12 ore.
2. Sostituire il vecchio mezzo con preriscaldata RPMI-1640 completa e consentono alle cellule di recuperare dal trattamento PMA per 12 ore.
3. Preparare GFP (green fluorescent protein)-tagged C. sospensione cellulare glabrata come descritto nella Sezione 2 e infettare di THP-1 macrofagi ad una MOI di 1. Se C. glabrata ceppi che esprimono GFP non sono disponibili, le cellule di lievito marcate con FITC (fluoresceina isotiocianato) possono essere utilizzati per monitorare eventi precoci dall'infezione vale a dire. tasso di fagocitosi e fagolisosomale maturazione a 2 ore.
4. Incubare i vetrini per 2 ore a 37 ° C con 5% di CO _2, capovolgere con attenzione a scartare medie e lavare 3x con sterile, preriscaldata PBS.
5. Aggiungere 500 ml preriscaldata RPMI-1640 medi completoum a ciascuna camera di uno scivolo e incubare a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 22 hr.
6. Per risolvere 2 hr C. glabrata-infettati THP-1 macrofagi, aggiungere 500 ml di 3,7% di formaldeide (preparato in PBS) per ciascuna camera dell'altro vetrino ed incubare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
7. Lavare il vetrino tre volte con PBS, aggiungere 500 microlitri Triton-X (0,7%), e incubare a temperatura ambiente per 5 min in scuro.
8. 3x diapositive Lavare con PBS, rimuovere camera dalla cultura vetrino e asciugare all'aria per 3-5 minuti al buio.
9. Montare con cura un vetrino con mezzo Vectashield di montaggio contenente DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindole) sulla trasparenza evitando la formazione di bolle. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso con Kimwipe e sigillare i bordi coprioggetto con smalto per unghie. Conservare scivolo al buio a 4 ° C fino al momento dell'uso.
10. Ripetere i punti 5.4 e 5,6-5,9 per elaborare cellule THP-1 24 ore dopo l'infezione.
11. Celle di immagine utilizzando un confo scansione lasermicroscopio cal (60X obiettivo ad immersione in olio, eccitazione a 405 nm e 488 nm per DAPI e macchia GFP, rispettivamente).

Risultati

Infezione analisi di PMA trattati THP-1 macrofagi con C. tipo selvatico glabrata (wt), le cellule hanno rivelato che le cellule wt stati fagocitati dai macrofagi ad un tasso del 55-65% dopo 2 ore coincubation. Inoltre, C. glabrata cellule erano in grado di resistere uccisione da parte THP-1 macrofagi ed hanno subito un moderato 5 - a 7 volte maggiore CFU dopo 24 ore di coculturing con THP-1 macrofagi ^8. Replica intracellulare di cellule di tipo selvatico, trasformate con GF...

Discussione

Sistema immune innato svolge un ruolo importante nel controllo delle infezioni fungine opportunistiche. I macrofagi contribuiscono alla difesa antimicotici per ingestione e la distruzione del patogeno fungino. Così, delucidazione di fattori che sono necessari per la sopravvivenza e / o contrastare le funzioni antimicrobiche di macrofagi avanzerà la nostra comprensione delle strategie di virulenza fungine. In questo contesto, abbiamo stabilito un sistema cellulare modello vitro in coltura utilizzando macrofagi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	For maintaining THP-1 cells
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	Caution: Hazardous
YPD	BD-Difco	242710	For growing Candida glabrata cells
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Phosphate buffered saline (PBS)			Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,  pH 7.4) for washes
Saline-sodium citrate (SSC)			Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes
Prehybridization buffer			Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization
VECTASHIELD mounting medium	Vector Labs	H-1200	For mounting slides for confocal microscopy
32P-labeled α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	For radiolabeling of signature tags
100 mm tissue culture dishes	Corning	430167	To culture THP-1 cells
24-well tissue culture plate	Corning	3527	To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages
4-chamber tissue culture-treated glass slide	BD Falcon	REF354104	To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Hemocytometer	Rohem India		For enumeration of cells
Table top microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 18	For spinning down cells in microtubes
Table top centrifuge	Remi	R-8C	For spinning down cells in 15 ml tubes
Spectrophotometer	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	To monitor absorbance of yeast cells
Plate incubator	Labtech	Refrigerated	To grow C. glabrata cells
Shaker incubator	New Brunswick	Innova 43	To grow C. glabrata cells
Water jacketed CO2  incubator	Thermo Electron Corporation	Forma series 2	To culture THP-1 cells
Confocal microscope	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages
Compound microscope	Olympus	CKX 41	To observe C. glabrata and THP-1 macrophages
PCR machine	BioRad	DNA Engine	To amplify unique tags from input and output genomic DNA
Hybridization oven	Labnet	Problot 12S	For hybridization
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	For scanning hybridized membranes
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	For denaturation of radiolabeled signature tags
Gel documentation unit	Alphainnontech	Alphaimager	To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels