培养和维护<em&gt;难辨梭状芽孢杆菌</em&gt;在厌氧环境

摘要

艰难梭菌是一种致病细菌是严格厌氧并导致抗生素相关性腹泻（AAD）。这里，用于分离，培养和维持C.方法艰难梭菌营养细胞和孢子的描述。这些技术的必要厌氧室，这就需要定期保养，以确保最佳的C。适当的条件难辨栽培。

摘要

艰难梭菌是一种革兰氏阳性，厌氧，产孢子的细菌，主要负责抗生素相关性腹泻（AAD）和一个显著院内病原体。C.艰难是出了名的难以分离和培养，并是即使是低氧气的环境水平极为敏感。这里，对于隔离C.方法从难辨粪便样品，随后C.培养难辨用于制备甘油股票长期贮存介绍。编制和列举孢子股票在实验室用于各种下游应用，包括显微镜和动物实验技术也有所说明。这些技术的必要厌氧室，它保持一致的厌氧环境，以确保最佳的C。适当的条件艰难成长。我们提供的协议在室的进出转印材料未经CA使用显著氧污染以及用于维持适当的厌氧环境，高效的和一致的要求下定期保养建议难辨栽培。

引言

艰难梭菌是一种革兰氏阳性，形成孢子的细菌是专性厌氧菌以及人类和动物的一种潜在的致命胃肠道病原体。在1935年最初描述为粪便样本中发现从新生儿^1，C的共生有机体难辨后来被证明是伪膜性肠炎的病原体使用抗生素治疗²有关。C.艰难梭菌感染（CDI），通常先通过抗生素治疗而导致的正常结肠菌群的破坏，形成一个利基C。难辨茁壮成长^2。C.难辨传输为通过粪-口途径休眠孢子，并随后在胃肠道内发芽，生产营养细胞能够产生多种毒素，引起严重的疾病，结肠炎^3。 CDI往往是难治常规治疗而这些fections经常经常性的^4。因此，课程发展处负责可达至48十亿在医疗保健费用在美国^5-7。

艰难梭菌是即使低氧气的环境中的电平非常敏感。对于C。难辨坚持环境和有效地从主机到主机的传输，一个代谢不活跃孢子的形成是至关重要的^8。因为C的实验室维护和操作难辨需要控制，无氧的环境中，这些技术需要使用在厌氧室。利用厌氧室已导致增加的回收和专性厌氧菌^9-11的隔离，并允许一些要在厌氧气氛中进行的分子技术。

除了​​C。难辨 ，厌氧室使用和维护这里描述适用其它专性厌氧菌如其他梭菌物种（ 如产气荚膜梭菌 ），其它胃肠物种（ 如拟杆菌属种^12）和牙周病原体（ 如消化链球菌属 ¹³种）。

研究方案

注：C。艰难梭菌是一种人类和动物病原体，可引起胃肠道疾病。涉及C.实验难辨必须以适当的生物安全防范措施（BSL-2）进行。

1。厌氧室使用与维护

艰难梭菌是一种严格厌氧菌和是即使是低浓度的氧的大气中极为敏感。因此，受控的，厌氧环境是必要的，它的成功操作。利用厌氧室中（ 图1A）的提供了最稳定的环境，理想的条件下进行有效的栽培C的艰难梭菌等厌氧菌^14。这里，含有气体混合物（5％CO _{2，10％H 2，85％N 2）}的气氛中，可以稳定地维持。

引入任何物品进入室内无显著氧污染，气闸必须使用（ 图1B）。该装置作为气体交换和自动工作，半手动或手动。气闸有两个门：1提供进入气密室的厌氧室的内部的其他提供访问外部和。取决于模型中，气闸可具有一个附加的门，它可提供访问到一个相邻的厌氧室中，从而节省了单独的气锁的成本。除积极朝着腔或缩小项目，这两个门应保持关闭在任何时间，以避免氧气污染。气闸具有在前面的通/断开关和含有四个按钮面板。气体管道和真空泵软管连接在气闸，面板，其中为单位的全手动操作的开关被靠近的后部。 建议2吹扫周期，使用氮气（N _2），用于与气体混合物（5％CO ₂的填充交换之前，10％H _{2，85％N 2），}以减少氧气的引入室的数量。同样重要的是要永远离开要么门打开，而不是移动项目进出交换的和所需要的量较长时间仔细计划的实验，以减少移动项目在室进出的频率。乙烯基厌氧室的不同操作步骤概述如下。以下这些协议之前，确保这些是与提供与腔室的制造商的说明兼容。

1. 自动模式
   这是一个可编程和可定制的模式和完全由气锁进行。编程的气闸，请参阅制造商的说明。对于典型的进入腔推荐的方案涉及用氮气吹洗2次后，再次填充的气闸用混合气体，该湛中保持了密切的氛围相匹配BER。在每个真空循环，标准厂房的程序建议抽真空至20英寸汞柱和清洗，以1英寸汞柱。
   1. 确保内气密室门完全关闭。
   2. 打开外气密室门。
   3. 将物品放入密封舱，关闭气闸外门。如果引入液体，拧开瓶盖一半，以确保有效的气体交换。密封包装和容器前，应开始循环打开;不会这样做的可弯曲和损坏塑料制品及容器。保持无菌，打开足够的，只允许有效的气体交换包。
   4. 按下开始按钮。
   5. 等到气闸已通过程序循环，将显示“厌氧”。
   6. 打开内气密室门。
   7. 移动物品进入室内。
   8. 关闭内门。
2. 半手动模式
   移动在腔室中或放物品时，这种模式下，可以使用与需要当c在腔室中ycling气体是必需的。
   1. 确保内气密室门完全关闭。
   2. 打开外气密室门。
   3. 将物品放入密封舱，关闭气闸外门。如果引入液体，拧开瓶盖一半，以确保有效的气体交换。密封的包装，如接种环和96孔板，必须在开始之前的周期打开。
   4. 按功能键。
   5. 按开始键。气闸将显示每个按钮的功能，不会响应，直到完成这一操作：
      • 向上箭头：启动真空泵。
      • 向下箭头键：启动氮气（吹扫）气流。
      • 启动：启动混合气体流量。
      • 菜单：返回到默认的显示。
   6. 按“向上”，从气闸去除气体，直到屏幕显示20英寸汞柱。
   7. 按“向下”，用氮气填充的气密室，直到显示小于1英寸汞柱。不要OVershoot，因为这将创建正压气密室之内，这可能会影响它的完整性。
   8. 重复步骤6和7，执行额外的清除周期。
   9. 按“Up”直到屏幕显示20英寸汞柱。
   10. 按下“开始”，用混合气体填充交汇处，直到显示小于1英寸汞柱。
   11. 打开内气密室门。
   12. 移动物品进入室内。
   13. 关闭内门。
3. 手动模式
   当自动或半手动模式不工作或没有电源的气闸此模式也可使用。这种模式下不工作时的气闸是上，因此，它是难以确定的气密室内部的压力。由于真空拉和气体吹扫时间取决于真空和气体流速，分别交换中使用压力表需要监控的压力，减少人身伤害和损坏的气闸的风险。
   1. 确保内气密室门完全关闭。
   2. 打开外气密室门。
   3. 放置物品，包括压力表，进气闸舱，关闭气闸外门。如果引入液体，拧开瓶盖一半，以确保有效的气体交换。密封的包装，如接种环和96孔板，必须在开始之前的周期打开。
   4. 找到三个开关上标有气闸后面的“手动控制开关。”这些单独标记为：
      • 真空
      • 氮
      • 混合气
   5. 翻转真空切换开关，直到压力表读数约为20英寸汞柱。
   6. 翻转氮拨动开关，直到压力表读数约为1英寸汞柱。
   7. 翻转真空切换开关，直到压力表读数约为20英寸汞柱。
   8. 翻转氮拨动开关，直到压力表读数约为1英寸汞柱。
   9. 翻转真空切换开关，直到压力表读数约为20英寸汞柱。
   10. 翻转气体混合拨动开关，直到压力表读数约为1英寸汞柱。
   11. 打开内气密室门。
   12. 移动物品进入室内。
   13. 关闭内门。

2。培养，枚举和存储C。从难辨粪便样本

这个程序的目的是恢复C。从难辨粪便样品含有孢子，随后保持分离菌落在长期储存的营养细胞或孢子甘油股票。可替换地，该过程可被用于枚举C的数目目前难辨粪便样本（ 例如从动物研究）中。要选择和鉴别富集C。艰难梭菌 ，牛磺胆酸盐，头孢西丁-环丝氨酸果糖琼脂（TCCFA）用于抑制正常粪便菌群生长^15-16。环丝氨酸是抑菌对于革兰氏阴性菌，而头孢西丁更广泛地抑制革兰氏阴性和阳性细菌的生长，除C的艰难和最输入球菌菌株。 pH指示剂，中性红，可以被包括在介质中，由于果糖的发酵将导致pH值下降，并从红色/橙色随后的颜色变化到黄色。为了有效地恢复C.孢子作为难辨营养细菌，胆盐牛磺胆酸钠是用于诱导发芽^17-18。因为C。难辨形成孢子，醇或样品的热处理可以用来减少或消除营养细胞，限制污染的植物的生长，这可能会增加C的效率艰难复苏^19。如上面所提到的，关键是要预先减少使用，以确保除去残余氧事先在厌氧室中的所有板为至少1-2小时。空气dryi纳克在室在使用前板可以减少冷凝。液体培养基中，可能需要高达24小时，以减少视在体积和所用的容器的表面 - 空气比率上。

在开始之前，下列物品应放入厌氧室：

• 粪便样本
• 无菌棉签
• 无菌接种环
• 1X PBS（见材料）
• TCCFA板（见材料）
• BHIS（脑心浸液培养基酵母抽提物）板和肉汤（见材料）
• 50％甘油（灭菌）
• 10％的L-半胱氨酸（灭菌）
• 低温储存瓶

*可替换地，分离的菌落可蔓延到BHIS琼脂平板上，随后刮下并重新悬浮于BHIS液体介质，用15％的甘油用于长期贮存于-80℃。 *要注意的是革兰氏染色是不是一种有效的策略，以确定下这是很重要直接从粪便标本²³ 难辨 ; C。难辨必须首先从粪便中的其他植物中分离。

1. 重悬在1×PBS中（这可能在有氧条件下进行）的粪便样品，并确保该粪便样品被完全重新悬浮于1×PBS中通过涡旋。如果枚举C.从难辨大便，权衡粪便之前，除了1X PBS中。
2. 使在1×PBS中再悬浮的粪便样品进行的集落形成单位（CFU）每克粪便的适当隔离或列举的连续稀释。
3. 使用无菌技术，应用100微升每个连续稀释至TCCFA板。
4. 采用一系列无菌接种环，条痕为孤立的殖民地或均匀分布的应用文化TCCFA板表面上的菌落计数的应用文化。
5. 厌氧孵育板48小时，在37°C。它可以检测并识别C。在24小时内难辨殖民地的基础上扁平，不规则，毛玻璃殖民地¹⁵的外观，虽然更准确的识别和枚举48小时后达到。
6. 用无菌接种环，传代，似乎是下任殖民地难辨到预还原BHIS琼脂平板上，补充有0.03％的L-半胱氨酸^20。挑一个单独的殖民地，和条纹上板象限，采用了新的无菌接种环的每一个象限，以获得单菌落。另外，算上C。每个稀释度的菌落难辨 （这可以在有氧条件下进行），并计算菌落形成每克粪便样品的单位数。
7. C.确认经革兰氏染色鉴定难辨 。经过革兰氏染色，C。难辨将显示为紫色杆和一些细胞可能包含终端孢子。聚合酶链反应（PCR）鉴定编码毒素B的基因可以提供进一步的确认C的产毒菌株²¹ 艰难而多位点序列分型（MLST）是成功的识别和未知和产毒的菌株C的准确分型难辨 ^22。
8. 为了保持C的股票艰难梭菌在-80℃下，选择一个个体，孤立菌落从用无菌接种环的BHIS琼脂平板上，重悬菌落在10ml预还原BHIS液体培养基中添加0.03％的L-半胱氨酸。*
9. 孵育过夜厌氧，在37℃，或直到文化变得混浊。
10. 添加333微升50％的甘油和666微升的C的难辨文化的1.8毫升低温管来创建分离株的15％甘油。
11. 盖紧瓶盖低温管，拌匀并立即从厌氧室和地点除去股票在-80℃冷冻长期保存。

3。 C.培养难辨 从冷冻甘油股票

这个程序提供了C的恢复难辨从保存于-80℃。甘油原液因为反复冻融可能会杀死营养细胞，保持冻结在任何时候都甘油股票是很重要的。我们不建议使用干冰在干冰蒸发可以在室内改变环境室的进出转移株。相反，我们建议使用冷冻冷却架上，以保持运输过程中冷冻甘油股票。对于不同的选择性和鉴别的目的，通常用于培养C.三种媒体难辨 。 TCCFA，如上面所讨论的，是选择性为C。难辨并含有牛磺胆酸钠，一个开端。脑，心脏浸剂补充有酵母提取物（BHIS）是一种常用的，富集的，非选择性培养基中，允许对多种生物体的（ 图^2A）24的生长。通常情况下，L-半胱氨酸e的加入BHIS作为还原剂^20。最后，将另外的血液向培养基中（ 图2B）可以更有效地形成孢子比TCCFA，并提供检测的独特绿色或黄绿色荧光由C.表现出根据难辨长波紫外线（UV）光^15（ 图2C）。当C.培养从孢子种群难辨 ，重要的是要记住，牛磺胆酸钠，必须向培养基中加入以保证发芽。

在开始之前，下列物品应放入厌氧室：

• 冷冻甘油股票（冷却机架）
• 无菌接种环
• TCCFA或BHIS板（见材料）
• BHIS肉汤（见材料）
• 50％甘油（灭菌）
• 低温储存瓶

1. 将C的冷冻甘油股票艰难梭菌在已被存储在-80℃PR，一个散热架IOR用来防止解冻。
2. 把干冰冷冻甘油股票进入厌氧室。
3. 使用无菌技术和无菌接种环，放置少量库存到整个板的一个象限中的板和条纹。
4. 旋转板90°，并使用一个新的无菌接种环，继续穿过第二象限条纹。
5. 重复第三和第四象限内，以确保单个菌落的分离。
6. 立即从厌氧室中取出冷冻甘油贮存，并返回到-80℃。
7. 孵育板厌氧过夜，在37℃下单个孤立菌落过夜生长后进行观察。

4。从C净化孢子难辨

由于产孢需要生存在富氧环境和疾病⁸的高效传输，孢子股票的准备是ofteÑ​​必要的下游应用，不限于显微镜和动物试验。要注意的是列举孢子需要重复，以确保计数的再现性是非常重要的。稀释度之间上下吹打几次也减少了损失，因为孢子附着的塑料好。

C.孢子化难辨是不是快速或同质其他产孢子的物种。为了优化产孢和恢复，无论是产孢培养基^{（SMC）17,25}或70:30媒体²⁶推荐。其它常用的介质是BHIS，这需要4-5天增长前高效率的孢子被认为是^27，和Clospore，产生孢子的高滴度的液体介质- 72小时增长后（10 ⁷每毫升10 ⁸孢子）。其它协议使用冰冷的水，而不是1×PBS ^20，但是，使用的等渗溶液可从相互粘连和塑料表面减少孢子。另外，一些研究者进一步用蔗糖梯度，以完全消除营养细胞和碎片²⁹净化他们的孢子。

在开始之前，下列物品应放入厌氧室：

• 无菌接种环
• BHIS，SMC和/或70:30板（见材料）
• BHIS肉汤（见材料）
• 1X PBS，过滤灭菌（见材料）

1. 从冷冻甘油储用培养菌株到预还原BHIS板孵育厌氧过夜，在37℃下
2. 重新划到几个预先降低SMC或70:30板和厌氧培养，在37℃下24-48小时。孢子的形成可以通过相衬显微镜遵循。孢子会出现明亮的阶段，而营养和母细胞会出现黑暗期。 *作为替代方案，孢子可从70:30液体培养基进行纯化后24-48小时，产生每毫升10 ⁵ -10 ⁶个孢子，这取决于TG1的用于n。
3. 用无菌接种环，刮片和重悬细胞于10ml无菌的1×PBS。
4. 丢弃板和从厌氧室中取出孢子悬浮液。沉淀细胞在3000×g离心15分钟。在1×PBS中洗涤细胞两次，每次完全重悬细胞沉淀。
5. 孵育过夜，在4℃在营养和母细胞的溶解，以帮助。
6. 孵育在70℃下20分钟以杀死任何残余营养细胞。
7. 以确定形成单位每毫升（CFU）菌落，连续稀释各孢子制剂在1x PBS及盘上BHIS +0.1％牛磺胆酸钠。列举菌落之前孵育板为至少24小时。
8. 孢子可以存储在1×PBS中于室温或4℃下长期贮存。如果储存在4℃下，它可能是有用的再热的孢子制剂在55℃下15分钟，以恢复有效的发芽。

结果

C.示例艰难梭菌生长在BHIS和哥伦比亚厌氧绵羊血琼脂培养基上可以看出，在图2中 。C.难辨形成不规则的菌落是平的，拥有一个毛玻璃的外观，这是显而易见的两种培养基上。这里，C的红霉素敏感型临床分离难辨 ，630E ^30，生长在BHIS琼脂，一个富集，非选择性培养基中，放置24小时，在37℃（ 图2A）。哥伦比亚厌氧羊血琼脂上菌落...

讨论

这里描述的方法允许简单和快速C的恢复从各种粪便样品，包括人类，小鼠和仓鼠，以及在长期贮存下的难辨难辨甘油或孢子的股票。C.难辨可以是一个困难的有机体培养，但细心保养的厌氧环境和无菌技术的应用可以提供强劲的增长和污染的减少。

厌氧室：注意事项和维护

有两种类型的厌氧室：刚性室或乙烯基室。刚性腔通常由?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
á´…-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
á´…-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.