El cultivo y mantenimiento<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En un ambiente anaeróbico

Resumen

Clostridium difficile es una bacteria patógena que es un anaerobio estricto y causa diarrea asociada a antibióticos (DAA). Aquí, métodos para aislar, cultivar y mantener C. se describen las células vegetativas y esporas difficile. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que requiere un mantenimiento regular para garantizar las condiciones adecuadas para una óptima C. cultivo difficile.

Resumen

Clostridium difficile es un anaerobio, bacteria Gram-positiva, esporogénica que es el principal responsable de la diarrea asociada a antibióticos (DAA) y es un patógeno nosocomial significativo. C. difficile es notoriamente difícil de aislar y cultivar y es extremadamente sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Aquí, métodos para aislar C. difficile a partir de muestras fecales y, posteriormente, el cultivo de C. difficile para la preparación de los stocks de glicerol para el almacenamiento a largo plazo se presentan. También se describen técnicas para la preparación y la enumeración de las existencias de esporas en el laboratorio para una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo estudios de microscopía y animales. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que mantiene un ambiente anaeróbico coherente para garantizar condiciones adecuadas para óptima C. crecimiento difficile. Proporcionamos protocolos para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara sin Cautilizando una contaminación significativa de oxígeno, junto con sugerencias para el mantenimiento regular necesario para mantener el medio ambiente anaeróbico apropiado para una eficiente y consistente C. cultivo difficile.

Introducción

Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas Gram-positivo que es un anaerobio obligado y un patógeno gastrointestinal potencialmente fatal de los seres humanos y animales. Inicialmente descrito en 1935 como un organismo comensal encuentra en las muestras de heces de los recién nacidos ^1, C. difficile más tarde se demostró que era el agente causante de la colitis pseudomembranosa asociada con el tratamiento antibiótico ^2. C. infecciones difficile (CDI) son típicamente precedidas de un tratamiento con antibióticos que resulta en la alteración de la flora normal del colon, creando un nicho para C. difficile prospere ^2. C. difficile se transmite como una espora latente a través de la vía fecal-oral y posteriormente germina dentro del tracto gastrointestinal, produciendo células vegetativas capaz de generar varias toxinas y causando la enfermedad grave y la colitis ^3. CDI suelen ser refractarios a los tratamientos convencionales y estos eninfecciones son frecuentemente recurrente ^4. Como resultado, los CDI son responsables de hasta $ 4.8 mil millones en costos de atención de la salud en los Estados Unidos ^5-7.

C. difficile es muy sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Para C. difficile de persistir en el medio ambiente y se transmite de manera eficiente de un huésped a otro, la formación de una espora metabólicamente inactiva es crítica ^8. Debido a que el mantenimiento de laboratorio y la manipulación de C. difficile requiere un ambiente anaeróbico controlado, estas técnicas requieren el uso de una cámara anaeróbica. El uso de cámaras anaeróbicas se ha traducido en un aumento de la recuperación y el aislamiento de anaerobios obligados ^9-11, y ha permitido una serie de técnicas moleculares que se deben realizar en un ambiente anaeróbico.

Además de C. difficile, el uso cámara anaeróbica y mantenimiento descritos aquí son aplicablesa otros anaerobios obligados, como otras especies clostridiales (por ejemplo, C. perfringens), otras especies gastrointestinales (por ejemplo, especies de Bacteroides ¹²⁾ y patógenos periodontales (por ejemplo, especies de Peptostreptococcus ^13).

Protocolo

Nota: C. difficile es un patógeno humano y animal que puede causar enfermedad gastrointestinal. Los experimentos con C. difficile debe realizarse con las precauciones de bioseguridad apropiadas (BSL-2).

1. Cámara anaeróbica de uso y mantenimiento

C. difficile es un anaerobio estricto y es extremadamente sensibles incluso a concentraciones bajas de oxígeno en la atmósfera. Por lo tanto, se necesita un ambiente anaeróbico controlada para su manipulación con éxito. El uso de una cámara anaeróbica (Figura 1A) proporciona el entorno más estable y las condiciones ideales para el cultivo efectivo de C. difficile y otras bacterias anaerobias ^14. Aquí, una atmósfera que contiene una mezcla de gases (5% de CO _2, 10% de H _2, 85% de N ₂₎ se puede mantener de forma estable.

Para introducir ningún artículo dentro de la cámara sin contaminación significativa de oxígeno,una esclusa de aire debe ser utilizado (Figura 1B). Este dispositivo funciona como un intercambio de gases y funciona de forma automática, semi-manualmente o de forma manual. La esclusa de aire tiene dos puertas: una que proporciona acceso a la parte exterior de la esclusa de aire y la otra que proporciona acceso al interior de la cámara anaeróbica. Dependiendo del modelo, la esclusa de aire puede tener una puerta adicional, que puede ofrecer acceso a una cámara anaeróbica contigua, ahorrando así el costo de una esclusa de aire separada. A no ser que se mueve activamente elementos dentro o fuera de la cámara, las dos puertas deben permanecer cerradas en todo momento para evitar la contaminación de oxígeno. La esclusa de aire posee un interruptor de encendido / apagado en la parte frontal y un panel que contiene cuatro botones. Las líneas de gas y manguera de la bomba de vacío se conectan en la parte posterior de la cámara de aire, cerca del panel donde se encuentran los interruptores de operación manual completa de la unidad. Se recomienda que dos ciclos de purga, utilizando gas nitrógeno (N _2), se utilizan antes de llenar el intercambio con la mezcla de gases _(CO2 al 5%, 10% de H _2, 85% de N ₂₎ para reducir la cantidad de oxígeno introducido en la cámara. También es importante no dejar ya sea puerta abierta durante más tiempo que el tiempo de la cantidad requerida para mover los elementos en y fuera de el intercambio y para planificar cuidadosamente experimentos para reducir la frecuencia de los elementos en movimiento dentro y fuera de la cámara. Los diferentes procedimientos de funcionamiento de cámaras anaeróbicas vinilo se describen a continuación. Antes de seguir estos protocolos, asegúrese de que sean compatibles con las instrucciones del fabricante suministradas con la cámara.

1. Modo Automático
   Este es un modo programable y personalizable y se lleva a cabo en su totalidad por la esclusa de aire. Para programar la esclusa de aire, refiérase a las instrucciones del fabricante. Un programa recomendado para la entrada típica en la cámara incluye dos ciclos de purga con gas nitrógeno, seguido de recarga de la esclusa de aire con una mezcla de gases que se ajusta a la atmósfera mantenida dentro de la cámaraber. Durante cada ciclo de vacío, los procedimientos estándar de fábrica sugieren un vacío de 20 pulgadas Hg y purgar a 1 inHg.
   1. Asegúrese de que la compuerta interior está totalmente cerrada.
   2. Abra la compuerta exterior.
   3. Coloque los artículos en la esclusa de aire y cerrar la compuerta exterior. Si la introducción de líquidos, desenroscar las tapas hasta la mitad para asegurar el intercambio de gases eficiente. Envases y recipientes sellados se deben abrir antes de comenzar el ciclo; abstenerse de hacerlo puede deformar y plástico daños y contenedores. Para mantener la esterilidad, abra los paquetes suficientes sólo para permitir el intercambio de gases eficiente.
   4. Pulse el botón Inicio.
   5. Espere hasta que la cámara de aire se ha completado un ciclo a través del programa y en la pantalla se lee "anaeróbico".
   6. Abrir compuerta interior.
   7. Mover elementos dentro de la cámara.
   8. Cierre la puerta interior.
2. Modo Semimanual
   Este modo se puede utilizar cuando se mueve artículos en o fuera de la cámara y es cuando sea necesario CSe requiere ycling el gas dentro de la cámara.
   1. Asegúrese de que la compuerta interior está totalmente cerrada.
   2. Abra la compuerta exterior.
   3. Coloque los artículos en la esclusa de aire y cerrar la compuerta exterior. Si la introducción de líquidos, desenroscar las tapas hasta la mitad para asegurar el intercambio de gases eficiente. Paquetes sellados, tales como asas de inoculación y placas de 96 pocillos, se deben abrir antes de comenzar el ciclo.
   4. Pulse Menú.
   5. Pulse Inicio. La esclusa de aire mostrará la función de cada botón y no responderá hasta que se termine esto:
      • Flecha arriba: activa la bomba de vacío.
      • Flecha abajo: inicia el nitrógeno (purga) de flujo de gas.
      • Iniciar: inicia el flujo de la mezcla de gas.
      • Menú: volver a la pantalla predeterminada.
   6. Pulse el botón "Up", la eliminación de gas de la cámara de aire, hasta que la pantalla muestre 20 pulgadas Hg.
   7. Pulse el botón "Down", el llenado de la esclusa con nitrógeno, hasta que la pantalla muestre menos de 1 inHg. No overshoot, ya que esto va a crear una presión positiva dentro de la bolsa de aire, lo que puede afectar su integridad.
   8. Repita los pasos 6 y 7 para realizar un ciclo de purga adicional.
   9. Pulse el botón "Up" hasta que la pantalla muestre 20 pulgadas Hg.
   10. Pulse el botón "Inicio", llenando el intercambio con la mezcla de gas, hasta que la pantalla muestre menos de 1 inHg.
   11. Abrir compuerta interior.
   12. Mover elementos dentro de la cámara.
   13. Cierre la puerta interior.
3. Modo Manual
   Este modo se puede utilizar siempre que los modos automático o semi-manuales no funcionan o no hay alimentación a la esclusa de aire. Este modo no funciona cuando la cámara de aire está encendido, por lo tanto, es difícil determinar la presión dentro de la cámara de aire. Debido a que el vacío tire y tiempos de purga de gas depende de las tasas de vacío y de flujo de gas, respectivamente, se requiere el uso de un medidor de presión dentro del intercambio para controlar la presión y reducir el riesgo de lesiones personales y daños a la esclusa de aire.
   1. Asegúrese de que la compuerta interior está totalmente cerrada.
   2. Abra la compuerta exterior.
   3. Coloque los artículos, incluyendo el medidor de presión, en la cámara de aire y cerrar la compuerta exterior. Si la introducción de líquidos, desenroscar las tapas hasta la mitad para asegurar el intercambio de gases eficiente. Paquetes sellados, tales como asas de inoculación y placas de 96 pocillos, se deben abrir antes de comenzar el ciclo.
   4. Localice los tres interruptores en la parte trasera de la cámara de descompresión etiquetada "Interruptores de control manual." Estos están etiquetados individualmente como:
      • Para Vacuum
      • Nitrógeno
      • Mezcla de gas
   5. Activa el interruptor al vacío de palanca hasta que el manómetro lee aproximadamente 20 pulgadas Hg.
   6. Activa el interruptor de palanca de nitrógeno hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.
   7. Activa el interruptor al vacío de palanca hasta que el manómetro lee aproximadamente 20 pulgadas Hg.
   8. Activa el interruptor de palanca de nitrógeno hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.
   9. Activa el interruptor al vacío de palanca hasta que el manómetro lee aproximadamente 20 pulgadas Hg.
   10. Activa el interruptor de palanca Gas Mezcla hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.
   11. Abrir compuerta interior.
   12. Mover elementos dentro de la cámara.
   13. Cierre la puerta interior.

2. El cultivo, la enumeración y Almacenamiento C. difficile en muestras de heces

Este procedimiento está diseñado para recuperar C. difficile en muestras fecales que contiene esporas y mantendrá después, las colonias aisladas como las células vegetativas o esporas en el almacenamiento a largo plazo como stocks de glicerol. Alternativamente, este procedimiento se puede utilizar para enumerar el número de C. presente difficile en muestras de heces (por ejemplo, de estudios en animales). Para enriquecer selectivamente y diferencialmente para C. difficile, taurocolato de agar-cefoxitina-cicloserina-fructosa (TCCFA) se utiliza para inhibir el crecimiento de la flora fecal normales ^15-16. Cicloserina es bacteriostática para las bacterias Gram-negativas, mientras que cefoxitina inhibe de manera más amplia el crecimiento de bacterias tanto Gram-negativos y positivos, con la excepción de C. difficile y más entran cepas cocos. Un indicador de pH, rojo neutro, se puede incluir en el medio, como la fermentación de fructosa dará lugar a una disminución en el pH y un cambio de color posterior de rojo / naranja a amarillo. Para recuperar de manera eficiente las esporas de C. difficile como bacterias vegetativas, el taurocolato de sodio sal biliar se utiliza para inducir la germinación ^17-18. Debido C. difficile forma esporas, el alcohol o el tratamiento térmico de las muestras se puede utilizar para reducir o eliminar las células vegetativas, limitando el crecimiento de la flora contaminante, lo que puede aumentar la eficiencia de C. recuperación difficile ^19. Como se mencionó anteriormente, es crítico para pre-reducir todas las placas durante al menos 1-2 horas en la cámara anaeróbica antes de su uso para asegurar la eliminación de oxígeno residual. Dryi Aireng las placas antes de su uso en la cámara pueden reducir la condensación. Medio líquido puede necesitar hasta 24 horas para reducir en función del volumen y la relación superficie-aire del recipiente utilizado.

Antes de comenzar, los siguientes elementos deben ser colocados en la cámara anaeróbica:

• Muestra de heces fecales
• Hisopos estériles
• Bucles de inoculación estéril
• 1x PBS (ver Materiales)
• Placas TCCFA (ver Materiales)
• BHIS (Brain Heart Infusion medio con extracto de levadura) y placas de caldo (ver Materiales)
• 50% de glicerol (esterilizada)
• 10% de L-cisteína (esterilizada)
• Viales criogénicas

* Alternativamente, las colonias aisladas se pueden propagar sobre placas de agar BHIS, y posteriormente se rasparon y se resuspendieron en medio líquido BHIS con 15% de glicerol para su almacenamiento a largo plazo a -80 ° C. ** Es importante notar que la tinción de Gram no es una estrategia efectiva para identificar C. difficile directamente a partir de muestras de heces ²³ ; C. difficile primero debe estar aislada de las otras especies de flora presentes en la materia fecal.

1. Resuspender la muestra de heces en 1x PBS (esto puede llevarse a cabo en condiciones aeróbicas), y asegurar que la muestra de materia fecal está totalmente resuspendió en PBS 1x por agitación. Si la enumeración de C. difficile a partir de las heces, pesar la muestra de heces antes de la adición de PBS 1x.
2. Hacer diluciones seriadas de la muestra de heces resuspendido en PBS 1X para el aislamiento o la enumeración adecuada de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de heces.
3. Utilizando una técnica aséptica, se aplican 100 l de cada dilución en serie a placas de TCCFA.
4. El uso de una serie de bucles de inoculación estéril, racha de la cultura aplicada para colonias aisladas o difundir la cultura aplicado en la superficie de la placa de TCCFA para la enumeración de colonias de manera uniforme.
5. Incubar la placa anaeróbicamente durante 48 horas a 37 ° C. Es posible detectar e identificar C. colonias difficile en 24 hr basan enla apariencia plana, irregular de vidrio esmerilado de las colonias ^15, aunque se logra una identificación más precisa y enumeración después de 48 hr.
6. El uso de loops de inoculación estéril, subcultivar las colonias que parecen ser C. difficile en pre-reducción de las placas de agar BHIS, complementado con 0,03% de L-cisteína ^20. Elige una colonia individual, y consecutivas sobre la placa en cuadrantes, utilizando un nuevo bucle de inoculación estéril para cada cuadrante, para obtener colonias aisladas. Alternativamente, cuente el C. colonias difficile de cada dilución (esto puede llevarse a cabo en condiciones aeróbicas), y calcular el número de unidades formadoras de colonias por gramo de muestra de heces formando.
7. Confirmar C. identificación difficile mediante la tinción de Gram. Después de la tinción de Gram, C. difficile aparecerá como barras de color púrpura y algunas células puede contener endosporas terminales. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la identificación de los genes que codifican la toxina B puede proporcionar una confirmación adicional decepas toxigénicas de C. difficile ^21, mientras que la secuencia de multilocus escribiendo (MLST) tiene éxito para la identificación y tipificación precisa de cepas desconocidas y no toxigénicas de C. difficile ^22.
8. Para mantener un stock de C. difficile a -80 ° C, recoger un individuo, colonia aislada de la placa de agar BHIS usando un asa de inoculación estéril y resuspender la colonia en 10 ml de BHIS de pre-reducción de medio líquido suplementado con 0,03% de L-cisteína. *
9. Incubar toda la noche en condiciones anaerobias a 37 ° C, o hasta que el cultivo se vuelve turbia.
10. Añadir 333 l de 50% de glicerol y 666 l de la C. cultura difficile a un tubo criogénico ml 1.8 para crear un stock de glicerol de la cepa aislada del 15%.
11. Estrechamente tapar el tubo criogénico, mezclar bien y retirar de inmediato la acción de la cámara anaeróbica y colocar en un congelador -80 ° para el almacenamiento a largo plazo.

3. El cultivo de C. difficile de existencias congeladas Glicerol

Este procedimiento proporciona para la recuperación de C. difficile de las existencias almacenadas de glicerol a -80 ° C. Debido a que los ciclos de congelación-descongelación pueden destruir las células vegetativas, es importante mantener los stocks de glicerol congelado en todo momento. No se recomienda el uso de hielo seco para la transferencia de cepas dentro y fuera de la cámara como la evaporación del hielo seco puede cambiar el ambiente dentro de la cámara. En su lugar, se recomienda el uso de bastidores de refrigeración congelado para mantener las reservas de glicerol congelados durante el transporte. Para diversos fines selectivos y diferenciales, tres medios de comunicación se utilizan comúnmente para el cultivo de C. difficile. TCCFA, como se discutió anteriormente, es selectiva para C. difficile y contiene taurocolato de sodio, un germinantes. Infusión de corazón cerebro suplementado con extracto de levadura (BHIS) es un medio enriquecido comúnmente utilizado,, no selectivo que permite el crecimiento de una amplia variedad de organismos (Figura 2A) ^24. Frecuentes, L-cisteínae se añade a BHIS como agente reductor ^20. Finalmente, la adición de la sangre al medio (Figura 2B) permite para la esporulación más eficiente que en TCCFA y proporciona para la detección de la única fluorescencia verdosa o verde pálido exhibido por C. difficile en virtud de onda larga ultravioleta (UV) ¹⁵ (Figura 2 C). Cuando el cultivo de C. difficile de las existencias de esporas, es fundamental recordar que taurocolato de sodio debe ser añadido al medio para asegurar la germinación.

Antes de comenzar, los siguientes elementos deben ser colocados en la cámara anaeróbica:

• Glicerol congelado Stock (en rejilla de refrigeración)
• Bucles de inoculación estéril
• Placas TCCFA o BHIS (ver Materiales)
• BHIS caldo (ver Materiales)
• 50% de glicerol (esterilizada)
• Viales criogénicas

1. Coloque el glicerol congelada de C. difficile en una rejilla de refrigeración que se ha almacenado a -80 ° C PRIOR utilizar para evitar la descongelación.
2. Llevar el glicerol congelado en hielo seco en la cámara anaeróbica.
3. Utilizando una técnica aséptica y un asa de inoculación estéril, coloque una pequeña cantidad de la población sobre la placa y rayos de luz sobre un cuadrante de la placa.
4. Gire la placa de 90 ° y, con un nuevo bucle de inoculación estéril, siguen en racha el segundo cuadrante.
5. Repetir para los tercero y cuarto cuadrantes para asegurar el aislamiento de colonias individuales.
6. Quitarse de inmediato la acción del glicerol congelada de la cámara anaeróbica y volver a la -80 ° C.
7. Incubar la placa anaeróbicamente durante la noche a 37 ° C. Individuales colonias aisladas deben ser observados después del crecimiento durante la noche.

4. Purificar Las esporas de C. difficile

Como se requiere la esporulación para la supervivencia en ambientes ricos en oxígeno y para la transmisión eficiente de la enfermedad ^8, la preparación de las existencias de esporas es often necesaria para las aplicaciones posteriores, no se limita a los estudios de microscopía y animales. Es importante señalar que la enumeración de las esporas requiere la repetición para asegurar la reproducibilidad de los recuentos. Medir con una pipeta hacia arriba y abajo varias veces entre diluciones también reduce la pérdida desde esporas se adhieren al plástico también.

La esporulación de C. difficile no es tan rápida o tan homogénea otras especies esporogénicas. Para optimizar la producción y la recuperación de esporas, se recomienda, ya sea medio de esporulación (SMC) ^17,25 o 70:30 medio ^26. Otros medios utilizados son BHIS, que requiere 4-5 días de crecimiento antes de la esporulación eficiente se ve ²⁷ y Clospore, un medio líquido que produce altos títulos de esporas (julio ¹⁰ a agosto 10 esporas por mililitro) después de 72 h de crecimiento. Otros protocolos utilizan agua enfriada con hielo en lugar de PBS 1X ^20, sin embargo, el uso de una solución isotónica puede reducir esporas se peguen entre sí y superficies de plástico. Alternativamente,algunos investigadores purifican aún más sus esporas usando un gradiente de sacarosa para eliminar completamente las células vegetativas y los desechos ^29.

Antes de comenzar, los siguientes elementos deben ser colocados en la cámara anaeróbica:

• Bucles de inoculación estéril
• BHIS, SMC y / o 70:30 placas (ver Materiales)
• BHIS caldo (ver Materiales)
• Esterilizada con filtro 1x PBS, (ver Materiales)

1. Cultura cepas a partir de glicerol congelado Stock en placas BHIS pre-reducido y se incuba en condiciones anaerobias durante la noche a 37 ° C.
2. Restreak en varios pre-reducido SMC o 70:30 placas e incubar anaeróbicamente a 37 ° C durante 24-48 horas. La formación de esporas se puede seguir a través de microscopía de contraste de fase. Las esporas aparecerán fase vegetativa brillante, mientras que las células madre y aparecerá oscura fase. * Como alternativa, las esporas se pueden purificar a partir del medio líquido de 70:30 después de 24-48 horas, lo que da 10 ⁵ -10 ⁶ esporas por mililitro, dependiendo de la strain utilizado.
3. El uso de un asa de inoculación estéril, raspar las placas y resuspender las células en 10 ml de 1x PBS estéril.
4. Deseche las placas y retire la suspensión de esporas de la cámara anaeróbica. Sedimentar las células a 3000 xg durante 15 minutos. Lavar las células dos veces en PBS 1x, resuspender completamente el sedimento de células cada vez.
5. Incubar durante la noche a 4 º C para ayudar en la lisis de las células madre y vegetativo.
6. Se incuba a 70 ° C durante 20 min para eliminar las células vegetativas residuales.
7. Para determinar unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro de formación, en serie diluir cada preparación de esporas en 1 x PBS y la placa sobre BHIS + 0,1% taurocolato de sodio. Incubar las placas durante un mínimo de 24 horas antes de la enumeración de colonias.
8. Las esporas pueden ser almacenados en 1x PBS a temperatura ambiente oa 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Si se almacena a 4 ° C, puede ser útil para recalentar la preparación de esporas a 55 ° C durante 15 min para restaurar la germinación eficiente.

Resultados

Un ejemplo de C. difficile crecido en BHIS y Columbia anaeróbica ovejas medios de agar sangre puede ser visto en la Figura 2. C. difficile forma colonias irregulares que son planas y poseen una apariencia de vidrio esmerilado que es evidente en ambos medios. Aquí, un aislado clínico-eritromicina sensible de C. difficile, 630E ^30, se cultiva en BHIS de agar, un medio enriquecido, no selectivo, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). Las colonias s...

Discusión

Los métodos descritos aquí permiten una recuperación rápida y sencilla de C. difficile a partir de una variedad de muestras fecales, incluyendo seres humanos, ratones y hámsteres, así como el almacenamiento a largo plazo de C. difficile como stocks de glicerol o de esporas. C. difficile puede ser un organismo difícil de cultivar, pero cuidado mantenimiento de un ambiente anaerobio y la aplicación de técnicas asépticas puede proporcionar para un crecimiento vigoroso y una reducción e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
á´…-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
á´…-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.