Culturing ושמירה<em&gt; Difficile Clostridium</em&gt; בסביבת אנאירובית

Summary

difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי טיפוח difficile.

Abstract

difficile Clostridium הוא אנאירובי, חיידק גראם חיובי, sporogenic שאחראי בעיקר לשלשולי אנטיביוטיקה משויכים (AAD), והוא הפתוגן nosocomial משמעותי. ג difficile קשה לשמצה לבודד ולטפח והוא מאוד רגיש אפילו רמות נמוכות של חמצן בסביבה. כאן, שיטות לבידוד ג difficile מדגימות צואה ולאחר מכן culturing ג difficile להכנה של מניות גליצרול עבור אחסון לטווח ארוך מוצגים. טכניקות להכנה וספירת מניות נבג במעבדה עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים מחקרי מיקרוסקופיה ובעלי החיים גם מתוארות. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר שומר על סביבת אנאירובי עקבית על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי צמיחת difficile. אנו מספקים פרוטוקולים להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר בלי caבאמצעות זיהום חמצן משמעותי יחד עם הצעות לתחזוקה שוטפת הנדרשת כדי לקיים את סביבת אנאירובי המתאימה לג יעיל ועקבי טיפוח difficile.

Introduction

difficile Clostridium הוא, חיידק יוצר נבג גראם חיובי שהוא anaerobe לחייב והפתוגן במערכת העיכול שעלול להיות קטלני לבני אדם ובעלי חיים. תאר בשנת 1935 תחילה כאורגניזם commensal נמצא בדגימות צואה מיילודים ^1, ג difficile מאוחר יותר הוכיח להיות הסוכן סיבתי של קוליטיס pseudomembranous הקשורים לטיפול אנטיביוטי ^2. ג זיהומי difficile (CDI) הם קדמו בדרך כלל על ידי טיפול אנטיביוטי שתוצאת שיבוש הפלורה הנורמלית במעי הגס, יצירת נישה לג difficile לשגשג ^2. ג difficile מועבר כנבג רדום דרך מסלול הצואה, אוראלי ולאחר מכן נובט בתוך מערכת העיכול, בייצור תאים של צמח מסוגל לייצר כמה רעלים וגורמים למחלת קוליטיס ³ חמורות. CDI הוא לעתים קרובות עקשן לטיפולים קונבנציונליים והן באלהfections לעתים קרובות חוזרים על עצמם ^4. כתוצאה מכך, CDI אחראי לעד 4.8 מליארד דולרים בעלויות טיפול רפואי בארצות הברית ^5-7.

ג difficile רגיש מאוד אפילו לרמות נמוכות של חמצן בסביבה. לג difficile להתמיד בסביבה ולהיות מועבר ביעילות ממארח ​​למארח, היווצרות נבג מטבולית פעיל היא ⁸ קריטיים. בגלל תחזוקת המעבדה ומניפולציה של ג difficile דורש סביבה מבוקרת, אנאירובי, טכניקות אלה מחייבות שימוש בתא אנאירובי. שימוש בתאים אנאירוביים הביאה התאוששות ובידוד של אנאירוביים לחייב ^9-11 מוגבר, ואפשר מספר הטכניקות מולקולריות שיש לבצע באווירה אנאירובית.

בנוסף לג difficile, שימוש אנאירובי קאמרי והתחזוקה המתוארת כאן חליםלאנאירוביים לחייב אחרים, כגון מינים אחרים קלוסטרידיאל (למשל perfringens ג), מינים אחרים במערכת העיכול (מינים למשל Bacteroides ¹²⁾ ופתוגנים חניכיים (למשל מיני Peptostreptococcus ^13).

Protocol

שים לב: ג difficile הוא פתוגן אדם ובעלי החיים שיכולים לגרום למחלות במערכת העיכול. ניסויים מעורבים ג difficile חייבת להתבצע עם אמצעי זהירות מתאים בטיחות ביולוגית (BSL-2).

1. אנאירובי קאמרי שימוש ותחזוקה

ג difficile הוא anaerobe קפדן והוא מאוד רגיש אפילו ריכוזים נמוכים של חמצן באטמוספרה. לכן, יש צורך בסביבה מבוקרת, אנאירובי למניפולציה המוצלחת שלה. השימוש בתא אנאירובי (איור 1 א) מספק סביבה היציבה ביותר ואת התנאים אידיאליים לגידול יעיל של ג difficile וחיידקים אנאירוביים אחרים ^14. כאן, אווירה המכילה תערובת גז (5% CO _2, 10% H _2, 85% N ₂₎ יכולה להישמר ביציבות.

כדי להציג את כל פריטים לתוך התא בלי זיהום חמצן משמעותי,מנעל אוויר חייב להיות בשימוש (איור 1). פונקציות מכשיר זה כמחלף גז ופועל באופן אוטומטי, באופן ידני למחצה או ידני. יש מנעל האוויר שתי דלתות: אחת המספק גישה לצד החיצוני של מנעל האוויר והגישה לספק אחרת כדי הפנים של חדר אנאירובי. בהתאם לדגם, מנעל האוויר עשוי להיות דלת נוספת, אשר יכולה להציע גישה לתא אנאירובי סמוך, ובכך לחסוך את העלות של מנעל אוויר נפרד. אלא אם כן ההעברה באופן פעיל פריטים באו מתוך החדר, שתי הדלתות צריכה להישאר סגורות בכל העת, כדי למנוע זיהום חמצן. מנעל האוויר בעל מתג הפעלה / כיבוי בחזית ולוח המכיל ארבעה כפתורים. קווי הגז וצינור משאבת ואקום מחוברים בחלקו האחורי של מנעל האוויר, בסמוך לפנל שבו המתגים להפעלה ידנית מלאה של היחידה נמצאים. מומלץ ששני מחזורי טיהור, שימוש בגז חנקן (N _2), נמצאים בשימוש לפני המילוי למחלף בתערובת גז (5% CO ₂, 10% H _2, 85% N ₂₎ כדי להפחית את כמות החמצן שהוכנסה לתא. כמו כן, חשוב לא לעזוב גם דלת פתוחה לזמן רב יותר מהזמן הסכום הנדרש כדי להיכנס ולצאת מהמחלף ופריטים לתכנן ניסויים כדי להפחית את התדירות של נע פנימה והחוצה מתא פריטים. נהלי ההפעלה השונות לתאים אנאירוביים ויניל המפורטות להלן. לפני ביצוע פרוטוקולים אלה, להבטיח כי אלה תואמים את הוראות היצרן המצורפות לקאמרי.

1. מצב אוטומטי
   זהו מצב הניתן לתכנות והתאמה האישי ומבוצע כולו על ידי מנעל האוויר. כדי לתכנת את מנעל האוויר, עיין בהוראות היצרן. תכנית מומלצת לכניסה טיפוסית לחדר כוללת שני מחזורי טיהור באמצעות גז חנקן אחרי מילוי מנעל האוויר בתערובת גזים שמתאימה לאווירה נשמרה בתוך צ'אם מקרובבער. במהלך כל מחזור ואקום, נהלי המפעל הרגילים מציעים משיכת ואקום ל20 inHg וטיהור ל1 inHg.
   1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
   2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
   3. הנח פריטים למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות ואריזות סגורות יש לפתוח לפני תחילת המחזור; הימנעות מלעשות זאת עלולה לעוות וplasticware נזק ומכולות. כדי לשמור על סטריליות, פתח את החבילות מספיק כדי לאפשר חילוף גזים יעיל בלבד.
   4. לחץ על הכפתור 'התחל'.
   5. חכה עד מנעל האוויר שרכב על אופניו במסגרת התכנית והתצוגה קוראת "אנאירובית".
   6. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
   7. להעביר פריטים אל תוך החדר.
   8. סגור את הדלת פנימית.
2. מצב חצי ידני
   מצב זה עשוי להיות בשימוש בעת העברת פריטים באו מחוץ לחדר והוא הכרחי כאשר גycling הגז בתוך התא הנדרש.
   1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
   2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
   3. הנח פריטים למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות אטום, כגון לולאות יחסינו וצלחות 96 היטב, יש לפתוח לפני תחילת המחזור.
   4. לחץ על תפריט.
   5. לחץ על Start. מנעל האוויר יציג את תפקידו של כל לחצן ולא יגיב עד שזה יסתיים:
      • חץ למעלה: מפעיל את משאבת הוואקום.
      • חץ למטה: יוזם את זרימת החנקן (טיהור) גז.
      • התחל: יוזם את זרימת תערובת גז.
      • תפריט: לחזור לתצוגת ברירת המחדל.
   6. לחץ על "Up", הסרת גז ממנעל האוויר, עד שהתצוגה קוראת 20 inHg.
   7. הקש "Down", ממלא את מנעל האוויר עם חנקן, עד שהתצוגה קוראת פחות מ 1 inHg. אל overshoot, כמו זו ייצור לחץ חיובי בתוך מנעל האוויר, אשר עשוי להשפיע על שלמותה.
   8. חזור על שלבים 6 ו -7 לביצוע מחזור טיהור נוסף.
   9. לחץ על "Up" עד שהתצוגה קורא 20 inHg.
   10. לחץ על "התחל", ממלא את המחלף עם תערובת גז, עד שהתצוגה קוראת פחות מ 1 inHg.
   11. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
   12. להעביר פריטים אל תוך החדר.
   13. סגור את הדלת פנימית.
3. מצב ידני
   במצב זה ניתן להשתמש בכל פעם שהמצבים האוטומטיים או חצי ידני לא עובדים או שאין כוח למנעל האוויר. מצב זה אינו פועל כאשר מנעל האוויר הוא על, ולכן קשה לקבוע את הלחץ בתוך מנעל האוויר. בגלל הוואקום למשוך ופעמים טיהור גז תלויה בשיעורי ואקום וזרימת גז, בהתאמה, את השימוש במד לחץ במחלף נדרש לפקח על הלחץ ולהפחית את הסיכון לפציעה ונזק למנעל האוויר אישיים.
   1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
   2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
   3. הנח פריטים, כולל מד הלחץ, למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות אטום, כגון לולאות יחסינו וצלחות 96 היטב, יש לפתוח לפני תחילת המחזור.
   4. אתר שלושה המתגים בצד האחורי של מנעל האוויר שכותרתו "מתגי שליטה ידניים". אלה שכותרתו בנפרד כ:
      • ואקום
      • חנקן
      • מיקס גז
   5. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
   6. להעיף את המתג למתג חנקן עד מד הלחץ קורא כ 1 inHg.
   7. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
   8. להעיף את המתג למתג חנקן עד מד הלחץ קורא כ 1 inHg.
   9. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
   10. להעיף את המתג למתג גז מערבבים עד שמד הלחץ קורא כ 1 inHg.
   11. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
   12. להעביר פריטים אל תוך החדר.
   13. סגור את הדלת פנימית.

2. Culturing, ספירת והאחסון ג difficile מדגימות הצואה

הליך זה נועד לשחזר ג difficile מדגימות צואה המכיל נבגים ולאחר מכן לשמור על מושבות מבודדות תאים או נבגים של צמח באחסון לטווח ארוך כמו מניות גליצרול. לחלופין, הליך זה יכול לשמש כדי למנות את מספר ג הווה difficile בדגימות צואה (למשל ממחקרים בבעלי חיים). באופן סלקטיבי ואופן דיפרנציאלי כדי להעשיר לג difficile, אגר taurocholate-cefoxitin-cycloserine פרוקטוז (TCCFA) משמש כדי לעכב את הצמיחה של חי צואה נורמלי ^15-16. Cycloserine הוא bacteriostatic לחיידקים גראם שליליים, ואילו cefoxitin באופן רחב יותר מעכב את הצמיחה של חיידקים הן גראם שליליים וחיוביים, למעט ג difficile ורוב להיכנס זני cocci. אינדיקטור pH, אדום ניטראלי, יכול להיכלל בטווח הבינוני, כמו התסיסה של פרוקטוז תגרום לירידה ברמת חומציות ושינוי בצבע הבא מאדומים / כתום לצהוב. כדי לשחזר ביעילות נבגים של C. difficile כמו חיידקים וגטטיבי, taurocholate נתרן מלח המרה משמש כדי לגרום לנביטה ^17-18. בגלל ג difficile יוצר נבגים, אלכוהול או טיפול בחום של דגימות ניתן להשתמש כדי להפחית או לחסל תאי צמח, מגביל את הצמיחה של חי מזהם, שעשוי להגביר את היעילות של ג התאוששות difficile ^19. כפי שהוזכר לעיל, הוא קריטי מראש לצמצם את כל הצלחות לפחות 1-2 שעות בתא אנאירובי לפני שימוש כדי להבטיח את הסרתן של חמצן שיורית. ייבוש אווירng הצלחות לפני השימוש בתא יכולות להפחית את העיבוי. מדיום נוזלי עשוי לחלוף 24 שעות כדי להפחית בהתאם לכמות ויחס שטח אל האוויר של המכל בשימוש.

לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

• דגימת צואה
• מטליות סטרילי
• לולאות inoculating סטרילי
• 1x PBS (ראה חומרים)
• צלחות TCCFA (ראה חומרים)
• צלחות BHIS (מוח לב עירוי בינוני עם תמצית שמרים) ומרק (ראה חומרים)
• גליצרול 50% (מעוקר)
• 10% L-ציסטאין (מעוקר)
• בקבוקוני אחסון קריוגני

* לחלופין, ניתן להפיץ מושבות מבודדות על גבי צלחות אגר BHIS, ולאחר מכן לגרד וresuspended במדיום נוזלי BHIS עם גליצרול 15% עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ° C. ** חשוב לציין כי גראם מכתים אינה אסטרטגיה יעילה לזהות ג difficile ישירות מדגימות צואת ²³ ; ג difficile חייב להיות ראשון מבודד מהצמחייה אחרת הנמצאת בצואה.

1. Resuspend דגימת הצואה ב1x PBS (עשוי להתבצע בתנאים אירוביים), ולהבטיח שדגימת הצואה היא resuspended באופן מלא ב 1x PBS על ידי vortexing. אם ספירת ג difficile מהצואה, לשקול את דגימת הצואה לפני התוספת של 1x PBS.
2. לעשות דילולים סידוריים של דגימת צואה המושעית זה ב1x PBS לבידוד או ספירה מתאים של יחידות מושבה להרכיב (CFU) לגרם של צואה.
3. באמצעות טכניקת aseptic, להחיל על כל דילול סדרתי לצלחות TCCFA 100 μl.
4. באמצעות סדרה של לולאות inoculating סטרילי, פס התרבות הגישה בקשה למושבות מבודדות או באופן שווה להפיץ את התרבות מוחלת על פני השטח של צלחת TCCFA לספירה של מושבות.
5. דגירה את הצלחת אנאירובי ל48 שעות על 37 ° C. ניתן לאתר ולזהות ג מושבות difficile בתוך 24 שעות המבוססות עלהמראה השטוח, לא סדיר, קרקע כוס המושבות ^15, אם כי זיהוי וספירה מדויקים יותר מושגת אחרי 48 שעות.
6. באמצעות לולאות inoculating סטרילי, תת כל מושבות הנחזות להיות ג difficile על צלחות מופחתות מראש BHIS אגר, בתוספת L-ציסטאין 0.03% ^20. פיק מושבה בודדת, ופס לצלחת ברביעים, באמצעות לולאת inoculating סטרילי חדשה לכל רבע, כדי לקבל מושבות מבודדות. לחלופין, לספור את ג מושבות difficile של כל דילול (עשוי להתבצע בתנאים אירוביים), ולחשב את מספר יחידות המושבה להרכיב לגרם של דגימת צואה.
7. אשר ג זיהוי difficile באמצעות גראם מכתים. לאחר גראם מכתים, ג difficile יופיע כמוטות סגולות וכמה תאים עשויים להכיל endospores מסוף. תגובת שרשרת של פולימראז זיהוי (PCR) של גנים המקודדים רעלן B עשוי לספק אישור נוסף שלזני toxigenic של ג difficile ²¹ תוך הקלדת multilocus רצף (MLST) היא מוצלחת לזיהוי והקלדה מדויקת של זנים ידועים וnontoxigenic של ג difficile ^22.
8. כדי לשמור על מלאי של ג difficile ב -80 ° C, לאסוף פרט, מושבה מבודדת מהצלחת אגר BHIS באמצעות inoculating לולאת סטרילי וresuspend המושבה ב10 מיליליטר של BHIS המופחת מראש מדיום נוזלי בתוספת 0.03% L-ציסטאין. *
9. דגירה הלילה אנאירובי על 37 מעלות צלזיוס, או עד שהתרבות הופכת להיות עכורה.
10. הוספת 333 μl של גליצרול 50% ו666 μl של ג תרבות difficile לצינור קירור מיליליטר 1.8 ליצור 15% מניית גליצרול של הזן המבודד.
11. חוזקה מכסה את צינור הקירור, לערבב היטב ולהסיר את המניות באופן מיידי מהאולם ומקום אנאירובי במקפיא -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.

3. Culturing ג difficile ממניות קפואות גליצרול

הליך זה מספק להתאוששות של ג difficile ממניות גליצרול מאוחסנות ב -80 ° C. בגלל להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים עשויים להרוג תאים של צמח, חשוב לשמור על מניות גליצרול קפוא בכל העת. אנו לא ממליצים על השימוש בקרח יבש להעברת זנים ובמתוך החדר כמו האידוי של קרח יבש יכול לשנות את הסביבה בתוך התא. במקום זאת, אנו ממליצים על שימוש במדפי קירור קפוא כדי לשמור על מניות גליצרול קפוא במהלך הובלה. למטרות סלקטיבית והפרש שונים, שלוש תקשורת משמשות בדרך כלל לculturing ג difficile. TCCFA, כפי שפורט לעיל, הוא סלקטיבי לג difficile ומכיל taurocholate נתרן, germinant. עירוי לב המוח בתוספת תמצית שמרים (BHIS) הוא מדיום נפוץ, מועשר, הלא סלקטיבי המאפשר לצמיחה של מגוון רחב של אורגניזמים (איור 2 א) ^24. לעתים קרובות, L-cysteinדואר מתווסף לBHIS כסוכן צמצום ^20. לבסוף, התוספת של דם לבינוני (איור 2) מאפשרת לנביגה יעילים יותר מאשר על TCCFA ומספקת לצורך זיהוי של הקרינה ירקרקה או ירקרקה הייחודית הוצגה על ידי ג difficile תחת אולטרה סגול ארוך גל (UV) אור ¹⁵ (איור 2 ג). כאשר culturing ג difficile ממניות נבג, זה קריטי לזכור שtaurocholate נתרן יש להוסיף למדיום כדי להבטיח נביטה.

לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

• מניית גליצרול קפואה (בקירור מדף)
• לולאות inoculating סטרילי
• צלחות TCCFA או BHIS (ראה חומרים)
• BHIS מרק (ראה חומרים)
• גליצרול 50% (מעוקר)
• בקבוקוני אחסון קריוגני

1. הנח את מניית גליצרול הקפואה של ג difficile במדף קירור שכבר מאוחסן ב -80 יחסי ציבור C °IOR להשתמש כדי למנוע הפשרה.
2. להביא את מניית גליצרול הקפואה בקרח יבש לתוך תא אנאירובי.
3. באמצעות טכניקת aseptic וinoculating לולאת סטרילי, הנח כמות קטנה של המניות לצלחת ומאיר ברבע אחד של הצלחת.
4. סובב את צלחת ° 90 ו, באמצעות לולאת inoculating סטרילי חדשה, תמשיך בעירום פני רבע השני.
5. חזור לרביעים שלישיים והרביעי כדי להבטיח את הבידוד של מושבות בודדות.
6. מייד להסיר את מניית גליצרול הקפואה מתא אנאירובי ולחזור ל° -80 ג
7. דגירה את צלחת אנאירובי הלילה בשעה 37 ° C. יש לשים לב מושבות מבודדות בודדות לאחר צמיחה בן לילה.

4. נבגי טיהור מג difficile

כפי שנדרש נביגה להישרדות בסביבות עשירה בחמצן ולהעברה יעילה של מחלת ^8, ההכנה של מניות נבג היא often נחוץ ליישומים במורד הזרם, אינו מוגבלים למחקרי מיקרוסקופיה ובעלי חיים. חשוב לציין כי ספירת נבגים דורשת חזרות כדי להבטיח שחזור של ספירה. Pipetting מעלה ומטה מספר פעמים בין דילולים גם מפחיתה את האובדן מאז נבגים לדבוק פלסטיק היטב.

נביגה של ג difficile הוא לא מהיר כמו או הומוגנית כמו מיני sporogenic אחרים. כדי לייעל את ייצור נבג והתאוששות, או בינוני נביגה (SMC) ^17,25 או 70:30 בינוני ²⁶ מומלץ. מדיה אחרת הנפוצה הן BHIS, המחייב 4-5 ימים של צמיחה לפני נביגה יעיל נתפסת ^27, וClospore, מדיום נוזלי שמייצר כותרות גבוהות של נבגים (אוקטובר ⁷ - אוקטובר ⁸ נבגים למיליליטר) לאחר 72 שעות של צמיחה. פרוטוקולים אחרים להשתמש במים קרים כקרח ולא 1X PBS ^20, עם זאת, השימוש בתמיסה איזוטונית יכול להפחית את הנבגים מלהידבק זה לזה משטחים אחרים ופלסטיק. לחלופין,כמה חוקרים לטהר נוספים הנבגים שלהם באמצעות שיפוע סוכרוז כדי להסיר באופן מלא תאים ופסולת ²⁹ וגטטיבי.

לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

• לולאות inoculating סטרילי
• BHIS, SMC ו / או 70:30 צלחות (ראו חומרים)
• BHIS מרק (ראה חומרים)
• עיקור-מסנן 1x PBS, (ראה חומרים)

1. תרבות זנים ממניות גליצרול קפוא לצלחות BHIS מופחתות מראש ודגירת אנאירובי הלילה בשעה 37 ° C.
2. Restreak על כמה SMC המופחת מראש או 70:30 צלחות דגירה אנאירובי ב37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות. יצירת נבגים ניתן בעקבות באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. נבגים יופיעו גטטיבי בהיר ואילו שלב ותאי אם יופיעו כהה שלב. * כחלופה, יכולים להיות מטוהרים נבגים מ70:30 מדיום נוזלי לאחר 24-48 שעות, אשר מניב 10 ⁵ -10 ⁶ נבגים למיליליטר, תלוי בstraiמשמש n.
3. שימוש inoculating לולאת סטרילי, לגרד צלחות וresuspend התאים 10 מיליליטר סטרילי 1X PBS.
4. בטל צלחות ולהסיר השעיה נבג מתא אנאירובי. גלולה התאים ב 3,000 XG במשך 15 דקות. לשטוף את התאים פעמיים ב 1x PBS, resuspending באופן מלא את התא גלולה בכל פעם.
5. דגירה הלילה ב 4 ° C כדי לסייע בתמוגה של גטטיבי ותאים האם.
6. לדגור על 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להרוג את כל תאים של צמח שיורית.
7. כדי לקבוע יחידות מושבה להרכיב (CFU) למיליליטר, סדרנו לדלל כל הכנת נבג ב 1x PBS וצלחת על BHIS + 0.1% taurocholate נתרן. דגירה צלחות למינימום של 24 שעות לפני ספירת מושבות.
8. ניתן לאחסן את הנבגים ב 1x PBS בטמפרטורת חדר או או 4 ° C לאחסון ארוך טווח. אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, זה עשוי להיות שימושי כדי לחמם הכנת הנבג ב-C ° 55 במשך 15 דקות כדי לשחזר את הנביטה יעילה.

תוצאות

דוגמא של ג difficile גדל על BHIS ותקשורת כבשים אנאירובי קולומביה אגר דם שניתן לראות באיור 2. ג difficile יוצר מושבות סדירות שהם שטוחים ובעלי מראה קרקע זכוכית אשר באו לידי ביטוי בשני אמצעי התקשורת. הנה, לבודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E ^30, הוא...

Discussion

השיטות שתוארו כאן לאפשר התאוששות פשוטה ומהירה של ג difficile ממגוון רחב של דגימות צואה, כולל בני אדם, עכברים ואוגרים, כמו גם האחסון לטווח הארוך של ג difficile כמו מניות גליצרול או נבג. ג difficile יכול להיות אורגניזם קשה לעיבוד, אך הקפדה על סביבת אנאירובי והיישום של ט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
á´…-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
á´…-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.