배양 및 유지<em&gt; 클로 스트 리듐 디피</em&gt; 혐기성 환경에서

요약

클로 스트 리듐 디피는 엄격한 혐기성 미생물과 항생제 관련 설사 (AAD)를 일으키는 원인이되는 병원성 세균입니다. 여기서, 분리 배양 및 C를 유지하기위한 방법 어울리지 않는 식물 세포 및 포자가 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 정기적 인 유지 보수를 필요로하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 재배.

초록

클로 스트 리듐 디피 항생제 관련 설사 (AAD)의 주된 책임이며 중요한 병원 내 병원체 그람 양성, 혐기성, sporogenic 세균이다. C. 남과 어울리지 분리 및 배양하는 악명 어려운 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. 여기에, C.를 분리하는 방법 대변 ​​샘플에서 어울리지 이후에 배양 C. 장기 저장을위한 글리세롤 주식의 준비를위한 어울리지이되게됩니다. 현미경과 동물 연구 등의 다운 스트림 응용 프로그램의 다양한 실험실에서 포자 주식을 준비하고 열거하는 기술도 설명되어 있습니다. 이 기술은 최적의 C에 대한 적절한 조건을 보장하기 위해 일관성있는 혐기성 환경을 유지하는 혐기성 챔버를 필요로 남과 어울리지 성장. 우리는 CA없이 챔버 안팎으로 물질을 전달하기위한 프로토콜을 제공한다효율적이고 일관성있는 C.에 해당하는 혐기성 환경을 유지하기 위해 필요한 정기적 인 유지 보수에 대한 제안과 함께 중요한 산소 오염을 사용하여 남과 어울리지 재배.

서문

클로 스트 리듐 디피는 의무를 혐기성 미생물과 인간과 동물의 잠재적으로 치명적인 위장 병원체 그람 양성, 포자를 형성하는 박테리아입니다. 처음에는 신생아 ^1, C.에서 배설물 샘플에서 발견 공생 생물로 1935 년에 설명 어울리지는 나중에 항생제 치료 ^2와 관련된 위 막성 대장염의 원인 물질로 증명되었다. C.에게 남과 어울리지 않는 감염 (CDI)는 일반적으로 C에 대한 틈새 시장을 창조하는 정상 결장 식물의 중단 결과 항생제 치료가옵니다 어울리지 ² 번창한다. C. 어울리지는 분변 - 경구 경로를 통해 휴면 포자로 전송 이후에 여러 가지 독소를 생성하고 심각한 질병 및 대장염 ^3을 일으킬 수있는 식물 세포를 생산, 위장 내에서 발아한다. CDI는 종종 기존의 치료와 이들의에 불응fections 자주 ^4를 반복합니다. 그 결과, CDI는 미국 ^5-7 의료 비용의 최대 48억달러에 대한 책임이 있습니다.

C. 남과 어울리지 않는 환경에있는 산소도 낮은 수준에 매우 민감하다. C.에 대한 어울리지 않는 환경에서 지속하고 효율적으로 호스트에 호스트로부터 전송, 대사 적으로 비활성 포자의 형성이 중요 ^8입니다. 때문에 C.의 실험실 유지 및 조작 어울리지 이러한 기술은 혐기성 챔버의 사용을 필요로, 제어, 혐기성 환경이 필요합니다. 혐기성 챔버의 사용은 증가 된 회복 의무를 혐기성 ^9-11 단리 초래하였으며, 혐기성 분위기에서 수행 될 분자 기술의 수가 허용했다.

C. 외에도 어울리지는 여기에 설명 된 혐기성 챔버의 사용 및 유지 보수가 적용됩니다같은 다른 클로스 트리 디움 종 (예를 들면 C. 퍼프 린 젠스), 다른 위장 종 (예를 들어 테로이 ¹² 종) 및 치주 병원균 (예 Peptostreptococcus 종 ¹³⁾ 등의 의무를 혐기성 균에.

프로토콜

참고 : C. 어울리지 위장 질환을 일으킬 수있는 인간과 동물의 병원체이다. C. 관련된 실험 어울리지 적절한 바이오 안전성주의 사항 (BSL-2)으로 수행해야합니다.

1. 혐기성 실 사용 및 유지 보수

C. 남과 어울리지 않는 엄격한 혐기성 미생물과 대기 중의 산소도 낮은 농도에 매우 민감하다. 따라서, 제어, 혐기성 환경은 성공적인 조작에 필요하다. 혐기성 챔버 (도 1a)의 사용은 C. 효과적인 재배 가장 안정적인 환경과 이상적인 조건을 제공한다 남과 다른 혐기성 세균 ^14. 여기서, 혼합 가스 (5 % CO _2, 10 % H _2, 85 % N _2)를 함유하는 분위기가 안정적으로 유지 될 수있다.

중요한 산소 오염없이 실에 어떤 항목을 소개하고,에어 록 (그림 1B)를 사용해야합니다. 이 장치의 가스 교환 등의 기능과는 반 수동으로 또는 수동으로, 자동으로 작동합니다. 에어 록의 외부와 혐기성 챔버의 내부에 다른 액세스를 제공에 대한 액세스를 제공 하나 출입구는 두 개의 문이있다. 모델에 따라, 에어 락 따라서 별도의 출입구의 비용을 절감, 인접 혐기성 챔버에 대한 액세스를 제공 할 수있는 추가로 문을 가질 수있다. 적극적으로 챔버 또는 축소 항목을 이동하지 않는 한, 두 문은 산소의 오염을 방지하기 위해 항상 닫혀 있어야됩니다. 출입구는 전면에 ON / OFF 스위치와 네 개의 버튼이 포함 된 패널을 보유하고있다. 가스 라인과 진공 펌프의 호스 유닛의 완전 수동 조작 스위치가있는 패널 가까운 출입구의 후면에 접속된다. 그것은이 퍼지 사이클은 질소 가스를 사용하여 (N _2)를 사용하는 것을 권장 가스 혼합 (5 % CO _2와 교환을 작성하기 전에, 10 % H _2, 챔버에 도입 산소의 양을 줄이기 위해 85 % N _2). 그것은 또한과 교류 밖으로 항목을 이동하는 데 필요한 양의 시간보다 더 오래 열려있는 하나의 문을 떠나지 않을 것이 중요합니다 정중 챔버 안팎 항목을 이동의 빈도를 감소시키는 실험을 계획한다. 비닐 혐기성 챔버의 다른 운영 절차는 아래에 설명되어 있습니다. 이러한 프로토콜을 수행하기 전에 이러한 챔버와 함께 제공되는 제조업체의 지침에 호환되는지 확인합니다.

1. 자동 모드
   이 프로그램과 사용자 정의 모드이며 출입구가 완전히 수행됩니다. 에어 락을 프로그래밍하려면, 제조업체의 지침을 참조하십시오. 챔버 내로 전형적인 엔트리 추천 프로그램 밀접 참 내에 유지 분위기 일치 가스 혼합 기밀실 리필 이어 질소 가스를 이용하여이 퍼지 사이클을 포함BER. 각 진공 사이클 동안, 표준 공장 절차는 20 inHg에 진공을 잡아 당기는 제안하고 1 inHg에 퍼지.
   1. 내부 출입구의 문이 완전히 닫혀 있는지 확인합니다.
   2. 외부 출입구의 문을 엽니 다.
   3. 에어 록에 항목을 배치하고 외부 출입구의 문을 닫습니다. 액체를 도입하는 경우, 효율적인 가스 교환을 보장하기 위해 중간 캡을 풉니 다. 밀봉 포장 및 용기 전에주기를 시작으로 열 수 있습니다, 그래서 일을 자제는 워프와 손상 plasticware에 컨테이너 수 있습니다. 무균 유지를 위해 유일한 효율적인 가스 교환을 허용하도록 충분한 패키지를 연다.
   4. 시작 버튼을 누릅니다.
   5. 에어 록이 프로그램을 통해 순환하고 표시가 될 때까지 대기 "혐기성를."
   6. 내부 출입구의 문을 엽니 다.
   7. 챔버로 항목을 이동합니다.
   8. 내부 문을 닫습니다.
2. 반 수동 모드
   이 모드는 챔버 또는 축소 항목을 이동할 때 사용하고, 필요한 경우는 C 될 수있다챔버 내에 가스를 ycling하는 것은 필요합니다.
   1. 내부 출입구의 문이 완전히 닫혀 있는지 확인합니다.
   2. 외부 출입구의 문을 엽니 다.
   3. 에어 록에 항목을 배치하고 외부 출입구의 문을 닫습니다. 액체를 도입하는 경우, 효율적인 가스 교환을 보장하기 위해 중간 캡을 풉니 다. 이러한 접종 루프와 96 - 웰 플레이트로 밀봉 된 패키지는, 이전에 사이클을 시작하기 열어야합니다.
   4. 메뉴를 누릅니다.
   5. 시작을 누릅니다. 에어 락은 각 버튼의 기능을 표시하고이 작업이 완료 될 때까지 응답하지 않습니다 :
      • 위쪽 화살표 : 진공 펌프를 활성화합니다.
      • 아래쪽 화살표 : 질소 (퍼지) 가스의 흐름을 시작합니다.
      • 시작 가스 혼합 흐름을 시작합니다.
      • 메뉴 : 기본 디스플레이로 돌아갑니다.
   6. 디스플레이가 20 inHg가 표시 될 때까지 키를 눌러 "업", 출입구에서 가스를 제거.
   7. 보도 자료 "아래,"디스플레이가 1보다 inHg 표시 될 때까지 질소 에어 록을 작성합니다. OV하지 마십시오ershoot,이 같은 무결성에 영향을 미칠 수있는, 에어 락에서 긍정적 인 압력을 작성합니다.
   8. 추가 퍼지 사이클을 수행하는 6 단계와 7 단계를 반복합니다.
   9. 표시 될 때까지 키를 눌러 "업"20 inHg를 읽습니다.
   10. 누르십시오 "시작", 가스 혼합과의 교류를 충전 디스플레이가 1보다 작 inHg가 표시 될 때까지.
   11. 내부 출입구의 문을 엽니 다.
   12. 챔버로 항목을 이동합니다.
   13. 내부 문을 닫습니다.
3. 수동 모드
   자동 또는 반 수동 모드가 작동하지 않거나 출입구에 전원이 없을 때마다이 모드를 사용할 수있다. 출입구가 켜져있을 때이 모드에서는 작동하지 않으며, 따라서, 기밀실 내의 압력을 결정하는 것은 곤란하다. 진공 당겨 가스 퍼지 시간은 진공 및 가스 유동 속도에 의존하고 있기 때문에, 각각 교환 내의 압력 게이지의 사용은 압력을 모니터링하고 상해 및 출입구에 대한 손상의 위험을 줄일 필요가있다.
   1. 내부 출입구의 문이 완전히 닫혀 있는지 확인합니다.
   2. 외부 출입구의 문을 엽니 다.
   3. 에어 록으로 압력 게이지 등의 항목을, 배치하고 외부 출입구의 문을 닫습니다. 액체를 도입하는 경우, 효율적인 가스 교환을 보장하기 위해 중간 캡을 풉니 다. 이러한 접종 루프와 96 - 웰 플레이트로 밀봉 된 패키지는, 이전에 사이클을 시작하기 열어야합니다.
   4. 표시된 에어 록의 뒷면에있는 3 개의 스위치 찾습니다 "수동 제어 스위치를." 각각 다르게 표시되어 같은 :
      • 진공
      • 질소
      • 가스 혼합
   5. 압력 게이지가 약 20 inHg가 표시 될 때까지 토글을 진공 스위치를 플립.
   6. 압력 게이지가 약 1 inHg가 표시 될 때까지 질소 토글 스위치를 플립.
   7. 압력 게이지가 약 20 inHg가 표시 될 때까지 토글을 진공 스위치를 플립.
   8. 압력 게이지가 약 1 inHg가 표시 될 때까지 질소 토글 스위치를 플립.
   9. 압력 게이지가 약 20 inHg가 표시 될 때까지 토글을 진공 스위치를 플립.
   10. 압력 게이지가 약 1 inHg가 표시 될 때까지 가스 혼합 토글 스위치를 플립.
   11. 내부 출입구의 문을 엽니 다.
   12. 챔버로 항목을 이동합니다.
   13. 내부 문을 닫습니다.

2. 배양, 열거 및 보관 C. 대변 ​​샘플에서 어울리지

이 절차는 C.를 복구하기 위해 설계되었습니다 어울리지 배설물 샘플에서 포자를 포함하고 이후 글리세롤 주식으로 장기 저장에 식물 세포 또는 포자와 같은 고립 된 식민지를 유지한다. 대안 적으로,이 절차는 C.의 개수를 열거하는데 사용될 수있다 (예를 들어, 동물 연구에서) 대변 샘플에 어울리지 않는 존재. 선택적 차등 C.에 풍부하게 어울리지는, 타우로 콜산 - 폭시 틴-사이클로 세린 과당 한천 (TCCFA)는 정상 배설물 식물 ^{15 ~ 16의} 성장을 억제하는 데 사용됩니다. 폭시 틴이보다 광범위 C. 제외하고, 그람 음성 및 양성 세균 모두의 성장을 억제하면서 세린은 그람 음성 세균에 대한 정균이며 어울리지 대부분이 구균 균주를 입력합니다. 과당의 발효는 pH의 감소와 노란색에 레드 / 오렌지에서 연속적인 색상 변화가 발생하므로 산도 표시기, 중립 빨간색, 중간에 포함 할 수 있습니다. 효율적 C.의 포자를 복구하려면 어울리지는 식물 박테리아로, 담즙 염 나트륨 타우로 콜레이트는 발아 ^{17 ~ 18을} 유도하는 데 사용됩니다. 때문에 C. 디피는 C.의 효율을 증가시킬 수있는 오염 식물의 성장을 제한하는, 식물 세포를 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수있다 포자, 알코올 또는 샘플의 열처리를 형성 어울리지 복구 ^19. 상술 한 바와 같이, 잔류 산소의 제거를 보장하기 위해 사용 전에 혐기 챔버에서의 적어도 1-2 시간 동안 모든 플레이트를 미리 줄이는 것이 중요하다. 공기 dryiNG 챔버 내에 사용하기 전에 플레이트를 응축을 감소시킬 수있다. 액체 매체는 볼륨과 사용 된 용기의 표면에 공기 비율에 따라 감소하기까지 24 시간이 필요할 수 있습니다.

시작하기 전에 다음과 같은 항목은 혐기성 챔버에 배치해야합니다 :

• 대변​​ 샘플
• 멸균 면봉
• 멸균 접종 루프
• 1X PBS (자료 참조)
• TCCFA 판 (자료 참조)
• BHIS (뇌 심장 주입 효모 추출물 중간) 접시와 국물 (자료 참조)
• 50 % 글리세롤 (살균)
• 10 %의 L-시스테인 (살균)
• 극저온 저장 작은 유리 병

* 대안으로, 절연 콜로니를 -80 ℃에서의 장기 저장을 위해 15 % 글리세롤 BHIS 아가 플레이트 상에 확산하고,이어서 긁어 및 BHIS 액체 배지에 재현 탁 될 수있다 **은 그람 염색법은 C.를 식별하는 효과적인 전략이 아니라는 것을주의하는 것이 중요하다 대변 ​​샘플 ^{(23)로부터} 직접 어울리지 , C. 어울리지 먼저 의자에 존재하는 다른 식물에서 분리해야합니다.

1. 1X PBS (이것은 호기성 조건에서 수행 될 수있다)의 대변 샘플을 재현 탁하고, 대변 샘플이 완전히 소용돌이로 교반하여 1X PBS에 재현 탁되어 있는지 확인합니다. 만약 C.를 열거 의자에서 어울리지는 이전 1X PBS를 추가로 대변 샘플을 단다.
2. 대변​​ g 당 콜로니 형성 단위 (CFU)의 적절한 분리 또는 열거 1X PBS에 재 부유 대변 샘플의 시리얼 희석합니다.
3. 무균 기술을 사용하여, TCCFA 판에 각 시리얼 희석 100 μl를 적용합니다.
4. 멸균 접종 루프의 일련의 연속 격리 된 식민지 또는 균등 식민지의 열거에 대한 TCCFA 판의 표면에 도포 문화 확산을위한 적용 문화권을 사용하여.
5. 37 ℃에서 48 시간 동안 혐기성 접시를 품어 그것은 C.를 감지하고 식별 할 수있다 24 시간 이내 어울리지 식민지에 기반식민지 ^(15)의 평면, 불규칙한, 지상 유리 외관,보다 정확한 식별 및 열거 형이 48 시간 후에 이루어집니다 있지만.
6. 멸균 접종 루프를 사용하여, C.로 나타나는 식민지를 배양 0.03 %의 L-시스테인 ⁽²⁰⁾ 보충 사전 감소 BHIS 한천 플레이트 상에 어울리지. 격리 된 식민지를 얻기 위해, 각 사분면에 대한 새로운 멸균 접종 루프를 사용, 사분면에있는 접시에 개별 식민지, 그리고 행진을 선택합니다. 대안 적으로, C. 카운트 각 희석액 디피 콜로니 (이 호기성 조건에서 수행 될 수있다), 및 대변 시료 g 당 콜로니 형성 단위의 수를 계산한다.
7. C.에게 확인 그람 염색을 통해 어울리지 식별. 후 그람 염색, C. 어울리지 보라색 막대로 표시됩니다 일부 세포는 터미널 내생 포자를 포함 할 수 있습니다. 독소 B를 인코딩하는 유전자의 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 식별은 추가의 확인을 제공 할 수있다C.의 독소 균주 어울리지 ²¹ multilocus 순서 입력 (MLST)를 식별 및 C의 알 수없는 및 nontoxigenic 균주의 정확한 입력을위한 성공하면서 ²² 어울리지.
8. C.의 재고를 유지하려면 -80 ° C에서 어울리지는 멸균 접종 루프를 사용 BHIS 한천 플레이트에서 개인, 고립 된 식민지를 선택하고 액체 배지는 0.03 %의 L-시스테인 보충 사전 감소 BHIS 10 ㎖에 식민지를 재현 탁. *
9. 하룻밤 혐기성 문화가 혼탁이되어 37 ° C에서, 또는 때까지 배양한다.
10. 50 % 글리세롤의 333 μL와 C. 666 μl를 추가합니다 분리 균주의 15 % 글리세롤 주식을 만들 수있는 1.8 ml의 저온 관에 어울리지 문화.
11. 단단히 극저온 튜브 캡, 잘 섞어 바로 장기 저장을 위해 -80 ° C의 냉동고에 혐기성 챔버와 장소에서 주식을 제거합니다.

3. C.를 배양 남과 어울리지 않는 냉동 글리세롤 주식에서

이 절차는 C의 복구를 위해 제공 어울리지 -80 ° C.에 저장 글리세롤 주식에서 반복 된 동결 - 해동 사이클은 식물 세포를 죽일 수 있으므로, 항상 냉동 글리세롤 축적량을 유지하는 것이 중요하다. 우리는 드라이 아이스의 증발 챔버 내 환경을 변경할 수있는 챔버의 안팎으로 긴장을 전송하기위한 드​​라이 아이스의 사용을 권장하지 않습니다. 대신, 우리는 수송 도중 냉동 글리세롤 주식을 유지하기 위해 냉동 냉각 랙을 사용하는 것이 좋습니다. 다양한 선택적 및 차동 위해, 세 가지 미디어 일반적 C. ​​배양에 사용 남과 어울리지. TCCFA는, 전술 한 바와 같이, C의 선택이다 어울리지 나트륨 타우로 콜레이트를 포함, germinant. 효모 추출물 (BHIS)로 보충 뇌 심장 주입 유기체의 다양한 (도 2A) ^(24)의 성장을 허용하는 일반적으로 사용되는, 농축 비 선택적 매체이다. 자주, L-시스테인전자는 환원제 ^(20)로 BHIS에 추가됩니다. 마지막으로, 매체 (그림 2B)에 혈액의 추가 TCCFA에보다 효율적 포자 형성이 가능하며 C.에 의해 전시 된 고유 한 녹색 또는 연두색 형광 검출을 제공한다 남과 어울리지 장파 자외선 (UV) 빛 ⁽¹⁵⁾ (그림 2C)에서. C를 배양 할 때 포자 주식에서 어울리지는, 그 타우로 콜산 나트륨 발아을 보장하기 위해 중간에 추가해야 기억하는 것이 중요합니다.

시작하기 전에 다음과 같은 항목은 혐기성 챔버에 배치해야합니다 :

• 냉동 글리세롤 (랙 냉각에)
• 멸균 접종 루프
• TCCFA 또는 BHIS 판 (자료 참조)
• BHIS 국물은 (자료 참조)
• 50 % 글리세롤 (살균)
• 극저온 저장 작은 유리 병

1. C.의 냉동 글리세롤 주식을 배치 -80 ° C 홍보에 저장되어있는 냉각 선반에 어울리지해동을 방지하기 위해 사용하는 IOR.
2. 혐기성 챔버에 드라이 아이스에 냉동 글리세롤 주식을 가져와.
3. 무균 기술 및 멸균 접종 루프를 사용하여 판의 사분면에 걸쳐 접시와 행진에 주식의 작은 금액을 놓습니다.
4. 플레이트를 90 ° 회전하고, 새로운 멸균 접종 루프를 사용하여, 두 번째 사분면에 걸쳐 행진을 계속합니다.
5. 개별 식민지의 분리를 보장하기 위해 세 번째와 네 번째 사분면에 대해 반복합니다.
6. 즉시 혐기성 챔버에서 냉동 글리세롤 주식을 제거하고 -80 ° C.로 돌아
7. 37 ℃에서 혐기성 하룻밤 접시를 품어 개별 격리 된 식민지 하룻밤 성장 후 관찰해야한다.

4. C.에서 정화 포자 남과 어울리지 않는

포자는 산소가 풍부한 환경에서 생존을 위해 질병 ^(8)의 효율적인 전송을 위해 필요한 경우에, 포자 주식의 준비 ofte입니다현미경과 동물 연구에 국한되지 다운 스트림 애플리케이션에 N 필요. 이 포자를 열거하는 카운트의 재현성을 보장하기 위해 반복을 필요로하는 것이 중요합니다. 포자는 물론 플라스틱을 준수하기 때문에 희석 사이에 피펫 아래로 여러 번하면 손실을 줄일 수 있습니다.

C.의 포자 형성 남과는 다른 sporogenic 종만큼 빠른 또는 균일하지 않습니다. , 포자 및 복구를 최적화하기 위해 포자 형성 매체 (SMC) ^17,25 또는 70:30 매체 ⁽²⁶⁾ 중 하나를 사용하는 것이 좋습니다. 성장의 72 시간 후 - (밀리리터 당 10 ⁸ 포자 10 ⁷⁾ 일반적으로 사용되는 다른 미디어를 효율적으로 포자는 ^27를 볼 수 있습니다 전에 성장의 4 ~ 5 일이 필요 BHIS, 및 Clospore, 포자의 높은 역가를 생산하는 액체 배지입니다. 다른 프로토콜 오히려 PBS ²⁰ 1x는보다 빙 냉수를 사용하지만, 등장 성 용액의 사용은 서로에 및 성형 표면에 붙지 포자를 감소시킬 수있다. 또한,일부 연구자들은 또한 완전히 식물 세포와 파편 ^29을 제거하는 자당 기울기를 사용하여 포자를 정화.

시작하기 전에 다음과 같은 항목은 혐기성 챔버에 배치해야합니다 :

• 멸균 접종 루프
• BHIS, SMC 및 / 또는 70:30 플레이트 (자료 참조)
• BHIS 국물은 (자료 참조)
• 1X PBS, 필터 살균 (자료 참조)

1. 문화 사전 감소 BHIS 판에 냉동 글리세롤 주식에서 변종 및 37 ℃에서 하룻밤 혐기성 배양
2. 여러 사전 감소 SMC 또는 70:30 판에 Restreak 24-48 시간 동안 37 ° C에서 혐기성 배양. 포자 형성은 위상차 현미경을 통해 이어 할 수있다. 포자 단계 밝은 동안의 식물과 어머니 세포 단계 어둡게 나타납니다 나타납니다. * 다른 방법으로, 포자 strai에 따라 밀리리터 당 10 ⁵ -10 ⁶ 포자를 생성하는 24-48 시간 후 70:30 액체 매체에서 정제 할 수있다N 사용됩니다.
3. 무균 접종 루프를 사용하여, 플레이트를 긁어 10 ㎖ 멸균 1X PBS에 세포를 재현 탁.
4. 번호판을 취소하고 혐기성 챔버에서 포자 현탁액을 제거합니다. 15 분 동안 3,000 XG에서 세포 펠렛. 완전히 세포 펠렛 매​​번 재현 탁, 1X PBS로 두 번 세포를 씻어.
5. 식물과 어머니 세포의 용해에 도움 4 ° C에서 하룻밤을 품어.
6. 남아있는 식물 세포를 죽이는 20 분 동안 70 ° C에서 알을 품다.
7. 밀리리터 당 단위 (CFU)를 형성 식민지를 확인하려면 직렬 + 0.1 % 나트륨 타우로 콜레이트 BHIS 각 포자 1X PBS의 준비와 플레이트를 희석. 식민지를 열거하기 전에 24 시간의 최소 번호판을 품어.
8. 포자는 장기간 저장을 위해 실내 온도 4 ° C의 하나에 1X PBS에 저장할 수 있습니다. 4 ° C에 저장하면 효율적으로 발아를 복원하기 위해 15 분 동안 55 ° C에서 포자 준비를 재가열하는 데 유용 할 수 있습니다.

결과

C.의 예 BHIS 컬럼비아 혐기성 양의 혈액 한천 매체에 성장 어울리지는 그림 2에서 볼 수 있습니다. C. 어울리지는 평면이며 모두 미디어에 분명하다 지상 유리 외관을 가지고 불규칙한 식민지를 형성한다. 여기에, C.의 에리스로 마이신에 민감한 임상 분리 남과 어울리지 않는, 630E ^(30)는 37 ° C (그림 2A)에서 24 시간 동안, BHIS 한천, ?...

토론

여기에서 설명하는 방법은 C의 간단하고 신속하게 복구 할 수 인간, 마우스, 햄스터, C. 등의 장기 저장을 포함한 분변 시료의 다양한에서 디피 글리세롤 또는 포자 주식으로 어울리지. C. 어울리지 경작하기 어려운 유기체가 될 수 있지만주의 혐기성 환경의 유지 보수 및 무균 기술의 응용 프로그램은 강력한 성장과 오염의 감소를 제공 할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Proteose Peptone no. 2	BD	212120
Na2HPO4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO4 (anhydrous)	Fisher	M65
á´…-Fructose	Fisher	L96
Sodium taurocholate	Sigma	T4009
á´…-cycloserine	Sigma	C6880
Cefoxitin	Fluka	C4786
Brain heart infusion medium	BD	237300
Proteose Peptone	BD	211684
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris base	Fisher	BP152
Agar	BD	214010
L-cysteine	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
Columbian sheep blood agar	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
Glycerol	Fisher	BP2291
Sterile inoculating loops	Fisher	22363596
Sterile swabs	Fisher	1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories	Coy Laboratory Products, Inc	Customer Specified	These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (anhydrous) 0.1 g Fructose 6 g Agar 20 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add: 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%) 25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml) 1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml) BHIS Medium Brain heart infusion 37 g Yeast extract 5 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%) SMC Sporulation Medium BactoPeptone 90 g Protease peptone 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris base 1.5 g Agar 15 g Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. Optional (add after autoclaving): 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g Protease peptone 3.5 g Brain heart infusion 11.1 g Yeast extract 1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%). Blood agar The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended. 1X Phosphate buffered saline (PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.