使用点击化学测量的影响，病毒感染宿主细胞RNA合成

摘要

这个方法描述了使用的点击化学感染裂谷热病毒（RVFV）MP-12菌株后，在宿主细胞的转录变化来衡量。结果可以可视化，通过荧光显微镜定性或定量地获得通过流式细胞仪。此方法是适应性强，用于与其他病毒。

摘要

许多RNA病毒已经进化作为一种​​手段来规避细胞防御能力，抑制宿主细胞的转录。如果在这些病毒的研究中，因此，它是重要的是要有一种快速和可靠的方式测量在感染的细胞中的转录活性。传统上，转录测量可以通过掺入放射性核苷如³ H-尿嘧啶核苷其次是检测通过放射自显影或液闪计数或卤代尿嘧啶核苷类似物，如5 -溴尿苷（BRU），其次是通过免疫染色检测掺入。但是，使用放射性同位素，需要专门的设备，在一些实验室的设置是不可行的，，而BRU检测可能会很麻烦，并可能遭受低灵敏度。

最近开发的点击化学反应，其中涉及铜催化的叠氮化物和炔三唑形成，现在提供了一个快速，highlÝ敏感替代这两种方法。点击化学反应是一个两步骤的过程中，首先通过掺入标记的5 - 乙炔基尿嘧啶核苷模拟（欧盟），然后检测荧光叠氮化物中的标签新生RNA。这些叠氮化物可作为几个不同的荧光团，允许用于可视化的选择，适用范围广。

本协议描述的方法来衡量细胞中的转录抑制感染裂谷热病毒（RVFV）MP-12菌株利用点击化学。同时，在这些细胞中的病毒蛋白表达由古典细胞免疫测定。步骤1到步骤4详细的方法，通过荧光显微镜可视化抑制转录，而步骤5至8详细的方法通过流式细胞仪量化转录抑制。此协议是用于与其他病毒很容易适应。

引言

传统上，转录活性已通过设立或放射性^{（3 H-}尿嘧啶^）1测量或卤化^（BRU）2核苷新生RNA。这些尿嘧啶核苷类似物被细胞，通过核苷的补救途径转换成尿苷三磷酸（UTP），并随后并入新合成的^RNA，3 H-尿嘧啶核苷，可以通过放射自显影，这可能是耗时的，或闪烁检测计数，需要专门的设备。此外，使用放射性同位素可能不实用，在一些实验室设置，包括高遏制生物安全实验室。 BRU可以被检测到，通过与抗-BRU抗体，这可能需要苛刻的通透性，以确保进入到细胞核或部分变性的RNA，RNA二级结构可能是一个空间位阻的抗体结合的抗体的免疫染色。

_content“>这里描述的协议利用最近开发的点击化学³来衡量RVFV MP-12菌株感染的细胞中的转录活性。点击化学依赖于一个具有高度选择性和高效的铜（I）催化炔和环加成反应叠氮基部分^4,5，在该协议中，在感染的细胞的新生RNA首先通过掺入标记的尿苷模拟欧盟注册成立的欧盟在第二步骤中，通过用荧光叠氮化物反应检测，该方法的主要优点是（1），它不要求使用放射性同位素和（2），它并没有要求苛刻的通透性或变性的RNA不妨碍随着分子量小于50沓，获得的叠氮化物荧光不足透化或RNA二级结构。此外，研究人员正在并不限于在他们所选择的初级抗体结合的RNA的检测时，用类的iCal免疫病毒蛋白。

在这个协议中描述的两种不同的方法：一个用于可视化通过荧光显微镜（步骤1-4），并通过流式细胞仪（步骤5-8）用于定量转录的转录。这两种方法结合标记的新生RNA与细胞内的病毒蛋白的免疫染色，允许转录活性之间的相关性和病毒感染的细胞通过细胞的基础上。

作者已经成功地使用这里描述的协议，以确定RVFV MP-12菌株^6，与不同的MP-12的突变体^7,8，9和细胞感染托斯卡纳病毒（TOSV）的¹⁰感染的细胞感染的细胞中的转录活性。这里所描述的协议，可以很容易地适应用于不同的病毒，并有可能进行修改，以包括特定的病毒或细胞蛋白的免疫荧光染色。

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研究方案

通过荧光显微镜转录分析

1。感染细胞与MP-12和标签新生RNA与欧盟

1. 放置12毫米的圆形盖玻片，盖玻片，每孔到12孔组织培养板。

注意：如果细胞有麻烦秉 ​​承盖玻片，放置在井前大衣与聚-L-赖氨酸（MW≥70,000）。为了这个目标，淹没在无菌的0.1毫克/毫升的溶液5分钟，在H ₂ O的聚-L-赖氨酸的盖玻片。冲洗盖玻片，用无菌H ₂ O和风干至少2小时。

2. 种子293细胞到盖玻片上，在1毫升生长培养基（含有10％胎牛血清，100 U / ml的青霉素和100毫克/毫升链霉素的DMEM培养液），每孔中加入5×10 ⁴细胞。在培养箱孵育在37℃和5％CO ₂ O / N
3. 3感染复数（MOI）感染细胞与MP-12。至少包括两个未受感染的井，两口井将作为未感染控制，其他的将被视为与放线菌素D（ACTD）作为转录抑制控制在1.5步。移除生长培养基中，稀释的病毒原液，加入到各孔的总体积是200毫升。增湿培养箱中，孵育1小时，在37℃和5％CO _2。

注：感染细胞，细胞也可以被转染的质粒DNA或体外合成的RNA编码一个特定的病毒蛋白质。为了这个目标，转染细胞根据制造商的说明，用适当的化学转染试剂，在转染后16小时，进行到步骤1.5。 RNA标记和固定之前，明智的做法是优化转染条件和培养时间。

4. 删除接种，并添加1毫升新鲜的生长培养基，每孔。在37°C孵育15小时。

ove_content> 备注：如果此协议用 ​​于与其他病毒适应，最好是执行一个时间过程实验，以确定最佳的时间点，RNA标记和固定。设置此时间过程使感染时间是交错排列的，和所有样品可标记的，固定的，和在同一时间染色。

5. 在15小时后感染（HPI），更换生长培养基中，培养基中含有1毫米欧盟。模拟感染井之一，也加入5微克/毫升ACTD。这将作为控制转录抑制，，ACTD抑制依赖于DNA的RNA合成。返回细胞的孵化器。
6. 16 HPI，除去介质和洗涤盖玻片一次，用1毫升的PBS（氯化钾0.20克/升，KH ₂ PO ₄ 0.20克/升，氯化钠8.00克/升的Na ₂ HPO ₄ 1.15克/升，pH值7.4）每口井。修复细胞，每孔中加入1毫升4％多聚甲醛（PFA），在RT下孵育30分钟。

注意：要准备4％PFA固定的解决方案，溶解10克的多聚甲醛在150毫升H ₂ O加热至60°C在加热磁力搅拌器。加入500μl1M的NaOH，继续搅拌，直到溶液变得清晰。筛选PFA溶液通过纸过滤器，以去除微粒，并添加62.5毫升磷酸盐缓冲液（77毫摩尔的NaH ₂ PO _4，287毫米的Na ₂ HPO _4，pH 7.4）中。加入H ₂ O至总体积为250毫升。冻结在-20°C的单用途等分。

7. 每口井用1毫升的PBS洗一次。没有孵化需要时间，这和所有随后的洗涤步骤。立即进行第2步。

注：重要的是立即着手进行点击反应，RNA退化较长时间保持在这个阶段，如果，RNA荧光信号的损失已经可以观察到细胞保持1小时4°C 。同样，如果每形成一个时间过程实验，一定要标签，修复，并在同一时间，所有的样品染色。

2。点击反应检测标记的RNA

1. 通透细胞加入1 ml 0.2％的Triton X-100的PBS中。在RT下孵育10分钟。

注：所有步骤中使用的解决方案，需要2.1至2.3核酸自由。

2. 用1ml PBS中，每孔洗涤三次。
3. 删除盖玻片的12孔板并转入湿热试验箱。涵盖50 - 100μL点击染色溶液（100毫米的Tris pH值8.5，1毫米_硫酸铜 ，20μM荧光叠氮化[最大激发/发射：590/617纳米，100毫米抗坏血酸），每个每个盖玻片。孵育1小时RT在黑暗中。

注意：要组装湿热试验箱，线的细胞培养或培养皿底部，一个直径10厘米的塑料石蜡膜。线的内侧边缘的二SH与湿纸巾。放置到塑料盖玻片石蜡膜。

注意：要小心，不要让干燥的盖玻片，在此期间或在协议中的任何其他步骤。最好是添加染色液每个盖玻片后直接被放置在潮湿的腔。

注意：，准备点击染色液新鲜紧接到这一步。 1.5 M Tris pH值8.5，100mM的CuSO ₄的，和500mM的抗坏血酸储备液可被存储在4℃下然而，放弃任何抗坏血酸原液已经变成黄色。

注意：一定要选择相匹配的过滤器上的荧光显微镜的荧光。

4. 取出盖玻片湿热试验箱和地方到一个新的12孔板，每孔1毫升PBS洗三次。

注意：如果没有去model的病毒蛋白进行需要的话，可被安装盖玻片，在此步骤之后（进行步骤3.3）成像。

3。免疫荧光检测病毒蛋白的表达

1. 向每孔加入1 ml的封闭缓冲液（3％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA）的PBS中），并孵育30分钟，在RT下在黑暗中。
2. 删除盖玻片12孔板，转移到湿热试验箱，覆盖50 - 100微升的主要抗体（抗-RVFV，一种礼品从RB TESH博士，UTMB）的阻断缓冲液（1:500）稀释。孵育1小时RT在黑暗中。

注意：当使用不同的病毒适应这个协议，确定您的主要抗体最佳稀释。

注：另外，这一步可以在4°C O / N在黑暗中。

3. 到12孔板取出盖玻片湿热试验箱和地方洗三次，每孔用1ml PBS。
4. 从12孔的地方，放置到潮湿的腔室和盖50 - 100μl的第二抗体（抗小鼠IgG共轭的荧光染料[激发/发射最大：五百一十九分之四百九十五nm]的在封闭缓冲液（1）稀释清除盖玻片： 500）。孵育1小时RT在黑暗中。

注意：一定要选择二次抗体，可以识别你的主要抗体和筛选器匹配的荧光显微镜。

注意：如果需要的话，200 ng / ml的DAPI可以加入第二抗体稀释至可视化的细胞核。

5. 删除从潮湿的腔室盖玻片和地点到12孔板中，每孔1毫升PBS洗三次。
6. 安装1滴（ 约 15微升）Fluoromount-G放置到载玻片盖玻片。盖玻片浸入到H ₂ O，通过触摸届，去除多余的H ₂ OE侧对纸巾，单元侧到下拉的Fluoromount-G。空气干燥5分钟。

注意：如果倒置显微镜成像，允许Fluoromount-G，以巩固在4°CO / N或加盖盖玻片，在显微镜幻灯片，通过密封的边缘用透明的指甲油。

注：幻灯片可以立即成像或储存在4℃下在黑暗中长达一个星期。

4。收购数据

1. 用荧光显微镜的图像。

注意：一定要选择适当的荧光基团，可以可视化使用显微镜。仅供参考，以下是荧光用于收购本出版物中的图像和过滤器集。

DAPI：
激发滤光片：BP 330 - 385
双色镜：400马克
排放过滤器：LP 420

激发滤光片：BP 460 - 490
双色镜：DM 505
排放过滤器：LP 510

荧光最大激发/发射六百十七分之五百九十：
激发滤光片：BP 545 - 580
双色镜：DM 600
排放过滤器：LP 610

通过流式细胞仪转录分析

5。感染细胞与MP-12和标签新生RNA与欧盟

1. 种子293细胞到6孔组织培养板中生长培养基（含有10％胎牛血清，100 U / ml的青霉素，100μg/ ml的链霉素的DMEM培养基）中。增湿培养箱中，孵育在37℃，5％CO _2，直到细胞已经达到了80 - 100％汇合。
2. 感染细胞与MP-12在MOI 3。包括至少两个未感染的井两口井将作为未受感染的控制，其他的将被视为与ACTD步骤5.4。移除生长培养基中，稀释的病毒原液，使总体积，每孔加入400微升。增湿培养箱中，孵育1小时，在37℃和5％CO _2。
3. 删除接种，每孔加入2毫升新鲜的生长培养基。在37°C孵育12小时。

注意：如果此协议用 ​​于与其他病毒适应，最好是执行一个时间过程实验，以确定最佳的时间点，用于标识和收获。设置此时间过程，使感染时间是交错的，所有的样品都可以被标记，收获，并在同一时间染色。

4. 在12 HPI，更换生长培养基中，培养基中含有0.5毫欧。模拟感染井之一，也加入5微克/毫升ACTD。这将作为控制转录抑制，，ACTD抑制依赖于DNA的RNA合成。返回细胞的孵化器。
5. 在13 HPI，洗细胞一次机智ħPBS和收获胰酶消化细胞。三次洗涤收获的细胞用含有1mM EDTA的溶液（PBS-EDTA）。

注：在这和随后的步骤中，不要离心细胞的速度比500 - 1,000 XG防止细胞断裂。离心细胞，1 - 2分钟，去滓。

注意：如果表面免疫计划后，点击反应，收获用橡皮警察或一次性细胞刮刀代替。

6. 修复细胞重新悬浮在1ml的4％多聚甲醛，并培育30分钟，在RT。参见步骤说明如何准备4％PFA 1.6。
7. 与1毫升PBS-EDTA洗一次，每口井。立即着手第6步。

注：重要的是立即着手进行点击反应，RNA退化，如果较长时间保持在这个阶段。同样，如果执行时间c未尝不是实验，同时所有样品的标签，固定和染色。

6。点击反应检测标记的RNA

1. 通透细胞重新悬浮于0.5ml的0.2％的Triton X-100的PBS中。在RT下孵育10分钟。

注意：所有步骤中使用的解决方案，需要6.1至6.3无核酸酶的。

注意：如果细胞不正确沉积物在此步骤中，增加离心时间为5分钟。沉淀的行为将提高细胞一旦被暂停在FACS缓冲液（6.4）。

2. 用1毫升PBS洗一次。

注意：不要使用EDTA在这一步，因为这将螯合^铜离子的点击反应的必要。

3. 悬浮细胞在200微升点击染色溶液（100毫米的Tris pH值8.5，1毫米_硫酸铜 ，200nm的叠氮标记用荧光染料[EXC最大itation /发射：六百六十五分之六百五十〇纳米，100毫米抗坏血酸）。孵育1小时RT在黑暗中。

注意：，准备点击染色液新鲜紧接到这一步。 1.5 M Tris pH值8.5，100mM的CuSO ₄的，和500mM的抗坏血酸储备液可被存储在4℃下然而，放弃任何抗坏血酸原液已经变成黄色。

注意：如果重悬细胞聚集在一起，在此步骤中，通过上下吸几次。

注意：一定要选择流式细胞仪，可以检测到荧光。

注意：还准备点击染色过程不会受到感染的细胞的一个样品，这些将用于流式细胞仪的校准。要么使用一半的受感染的细胞，包括一个额外的步骤5.2感染。这些CON在步骤7.1中，控制细胞将被免疫染色。

4. 用FACS缓冲液（含1mM EDTA和0.5％（重量/体积）牛血清白蛋白的PBS）洗两次。

注：如果没有病毒蛋白的免疫细胞可以立即分析（继续执行步骤8）。

7。免疫荧光检测病毒蛋白的表达

1. 悬浮细胞在200微升的主要抗体（抗-RVFV）稀释FACS缓冲液（1:10000）孵育1小时即时在黑暗中。

注：另外，这一步可以在4°C O / N在黑暗中。

注意：还准备进行点击染色过程，但不会被免疫染色的未感染的细胞的一个样品，这些将用于流式细胞仪的校准。要么使用模拟感染细胞的一半，或包括一个额外的未感染以及步骤5.2。

注意：当使用不同的病毒适应这个协议，确定您的主要抗体最佳稀释。

2. 洗涤细胞两次在流式细胞仪缓冲。
3. 200微升的二次抗体（抗鼠IgG共轭荧光染料[最大激发/发射：519分之495纳米）的悬浮细胞在FACS缓冲液（1:1,000）和稀释孵育1小时即时在黑暗中。
4. 一次洗涤细胞在流式细胞仪缓冲。

注：此时，细胞可以储存在4℃的O / N在黑暗中。

8。收购数据

1. 于500μlFACS缓冲液，转移到5毫升聚苯乙烯管中重悬细胞，并用流式细胞仪分析。使用MP-12感染的细胞（没有点击反应，抗RVFV染色）和模拟感染细胞（点击反应）对仪器进行校准。

不E：一定要选择合适的荧光基团，可以检测到您的仪器。仅供参考，以下是激光线和过滤器集，用于收购本出版物中显示的数据。

荧光与激发/发射光谱五百十九分之四百九十五：
激光：488纳米
过滤器：530/30

荧光与激发/发射光谱六百六十五分之六百五：
激光：640纳米
过滤器：670/20

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结果

奈米RVFV蛋白（家庭布尼亚病毒科 ，属^{Phlebovirus）11}抑制宿主细胞的转录，通过两种不同的机制：（i）在螯合P44亚单位的基础转录因子TFIIH ¹¹及（ii）通过促 ​​进p62的蛋白酶体降解亚基的TFIIH ^6。由于MP-12菌株可在生物安全2级实验室处理，被排除在美国，选择代理规则适用于其他野生RVFV MP-12疫苗株，在这个协议中描述的实验已用于¹³键入RVFV株。 MP-12菌...

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讨论

所提供的协议描述了一种方法来衡量效果的的尿苷模拟欧盟通过掺入到新生RNA病毒感染宿主细胞的转录。这种方法比以前的方法有以下几个优点：它是快速，灵敏，它不依赖于使用放射性同位素。此外，该方法可适应通过荧光显微镜或流式细胞仪定量数据通过使用本质上是相同的试剂，得到的定性数据。当结合病毒抗原的免疫荧光染色，这种方法也使得研究者能够区分感染未受感染的细胞。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips	Fisherbrand	12-545-82
5 ml polystyrene tubes	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI	Sigma	D-9542	dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)	Invitrogen	A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	dissolve in H2O for 500 mM
paper filter	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Fluorescence Microscope			e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer			e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa