Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Resumo

Este método descreve o uso de mouse química para medir as mudanças na transcrição da célula hospedeira após a infecção com o vírus da febre do Vale do Rift (RVFV) tensão MP-12. Os resultados podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência qualitativamente ou quantitativamente, obtido através de citometria de fluxo. Este método é adaptável para utilização com outros vírus.

Resumo

Muitos vírus RNA evoluíram a capacidade para inibir a transcrição da célula hospedeira como um meio para contornar as defesas celulares. Para o estudo destes vírus, é, por conseguinte, é importante ter uma forma rápida e fiável de medir a actividade de transcrição em células infectadas. Tradicionalmente, a transcrição foi medida quer por incorporação de nucleótidos radioactivos tais como ³ H-uridina seguido por detecção através de autoradiograf ia ou contagem de cintilações, ou incorporação de análogos de uridina derivados halogenados tais como 5-bromouridine (BRU), seguido por detecção por imunocoloração. O uso de isótopos radioactivos, no entanto, exige equipamento especializado e não é viável em um certo número de configurações de laboratório, ao passo que a detecção de BrU pode ser complicado e pode sofrer de uma baixa sensibilidade.

A química clique recentemente desenvolvidos, o que envolve uma formação de triazole catalisada por cobre a partir de uma azida e um alcino, proporciona agora uma rápida e highly alternativa sensíveis a estes dois métodos. Instruções química é um processo de dois passos em que ARN nascentes é rotulado pela primeira vez por incorporação do análogo de uridina 5-etiniluridina (UE), seguido de detecção do rótulo com uma azida fluorescente. Estas azidas estão disponíveis como vários fluoróforos diferentes, permitindo uma grande variedade de opções para visualização.

Este protocolo descreve um método para medir a supressão de transcrição em células infectadas com o vírus da febre de Rift Valley (RVFV) estirpe MP-12, utilizando química do clique. Ao mesmo tempo, a expressão de proteínas virais nestas células é determinada por imunocoloração intracelular clássica. Etapas de 1 a 4 detalhar um método para visualizar supressão transcricional via microscopia de fluorescência, enquanto os passos 5 a 8 pormenor um método para quantificar a supressão da transcrição via citometria de fluxo. Este protocolo é facilmente adaptável para utilização com outros vírus.

Introdução

Tradicionalmente, a actividade de transcrição foi medida através da incorporação de qualquer radioactivos ⁽³ H-uridina) ¹ ou halogenados (BRU) em ^dois nucleósidos de ARN nascentes. Estes análogos de uridina são absorvidos pelas células, convertida em uridina-trifosfato (UTP), através da via de recuperação de nucleósido, e subsequentemente incorporada no ARN recém-sintetizado. ^3H-uridina pode ser detectada por auto-radiografia, o que pode ser demorado, ou cintilação de contagem, o que requer equipamento especializado. Além disso, a utilização de isótopos radioactivos podem não ser prático em um certo número de configurações de laboratório, incluindo os de alta laboratórios biossegurança contenção. BrU pode ser detectada através de coloração imunológica com anticorpos anti-Bru, que podem exigir a permeabilização duras para garantir o acesso do anticorpo ao núcleo parcial ou desnaturação do ARN, com a estrutura secundária do ARN pode ser um impedimento estereoquímico à ligação de anticorpos.

_content "> O protocolo aqui descrito utiliza a recentemente desenvolvida clique química ³ para medir a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12. Instruções química baseia-se num cobre altamente selectivo e eficiente (I) catalisada por reacção de cicloadição entre um e alcino uma porção de azida de ^4,5. Neste protocolo, o ARN nascentes em células infectadas é rotulado pela primeira vez através da incorporação de uridina analógico UE. Num segundo passo, o UE incorporado é detectado por meio de reacção com um azeto fluorescente. As principais vantagens deste método são (1) que não requerem a utilização de isótopos radioactivos e (2), que não requer a permeabilização dura ou desnaturação do ARN. Com um peso molecular de menos de 50 Da, o acesso da azida fluorescente não é impedida por insuficiente estrutura secundária permeabilização ou RNA. Além disso, os pesquisadores não estão limitadas na sua escolha de anticorpos primários ao combinar a detecção de ARN com uma classeimmunostaining iCal para proteínas virais.

Dois métodos diferentes são descritas neste protocolo: uma para a visualização de transcrição através de microscopia de fluorescência (passos 1-4), e uma para quantificar a transcrição através de citometria de fluxo (passos 5-8). Ambos os métodos combinam rotulagem de ARN nascentes com uma imunocoloração intracelular para as proteínas virais, o que permite estabelecer uma correlação entre a actividade de transcrição e infecção viral numa base célula-por-célula.

Os autores usaram com sucesso o protocolo aqui descrito para determinar a actividade de transcrição em células infectadas com a estirpe RVFV MP-12 ^6, as células infectadas com diferentes MP-12 mutantes ^{7,8, 9,} e as células infectadas com o vírus da Toscana (TOSV) ^10. O protocolo aqui descrito pode ser facilmente adaptado para ser utilizado com vírus diferentes e tem o potencial de ser modificado para incluir a coloração por imunofluorescência de proteínas virais ou celulares específicos.

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Protocolo

Análise da transcrição por microscopia de fluorescência

1. Infectar as células com o MP-12 e etiqueta RNA nascentes com a UE

1. Coloque lamínulas redondas de 12 mm na placa de cultura de tecidos de 12 poços, uma lamela por poço.

Nota: Se as células têm dificuldade em aderir a lamelas, casaco com poli-L-lisina (≥ 70.000 MW), antes de colocar em poços. Para este objectivo, lamelas submersas numa solução estéril de 0,1 mg / mL em _H2O de poli-L-lisina, durante 5 min. Enxágüe com lamelas estéril H ₂ O e ar seco por pelo menos 2 horas.

2. Para semear as células 293 em lamelas, adicionar ⁴ de 5 x 10 células em 1 ml de meio de crescimento (DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina e 100 mg / ml de estreptomicina) por poço. Incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO ₂ S / N.
3. Infectar as células com MP-12 a uma multiplicidade de infecção (moi) de 3. Inclua pelo menos duas poços não infectados: um dos dois poços servirá como controlo não infectado, o outro será tratado com actinomicina D (ActD) no passo 1.5 como um controlo para a supressão transcricional. Remova o meio de crescimento e diluir o estoque de vírus de modo a que o volume total adicionado a cada poço é de 200 ml. Incubar durante 1 hora numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO _2.

Nota: Em vez de infectar as células, as células podem também ser transfectadas com ADN de plasmídeo ou de ARN sintetizado in vitro que codifica uma proteína viral específica. Para este objectivo, transfectar células com um reagente apropriado de transfecção química de acordo com as instruções do fabricante e prosseguir para a etapa 1.5 em 16 horas após a transfecção. É aconselhável para otimizar as condições de transfecção e tempo de incubação antes de rotulagem RNA e fixação.

4. Remover inoculo e adicionar 1 ml de meio de crescimento fresco por poço. Incubar a 37 ° C durante 15 horas.

ove_content "> Nota:. Se adaptar este protocolo para utilização com um outro vírus, é aconselhável realizar uma experiência de evolução no tempo para determinar o ponto de tempo óptimo para a rotulagem de RNA e fixação Definir este curso de tempo, de modo que os tempos de infecção são escalonados e todos As amostras podem ser marcados, fixadas e coradas no mesmo tempo.

5. Aos 15 horas pós-infecção (hpi), substitua meio de crescimento com meio contendo 1 mM UE. Para um dos poços infectadas falsas, também adicionam-se 5 ug / ml de ActD. Isto servirá como controle para a supressão da transcrição, como ActD inibe a síntese de ARN dependente de ADN. Retorno células na incubadora.
6. Aos 16 hpi, remover o meio e lava-se as lamelas uma vez com 1 ml de PBS (KCI 0,20 g / l, KH ₂ PO ₄ 0,20 g / L, NaCl a 8,00 g / L, Na ₂ HPO ₄ 1,15 g / l, pH 7,4) por poço. Fixar as células por adição de 1 ml de 4% de paraformaldeído (PFA) por poço e incubando durante 30 minutos à temperatura ambiente.

Nota: Para preparar a solução de fixação PFA a 4%, dissolver 10 g de paraformaldeído em 150 ml de _H2O aquecida a 60 ° C num agitador magnético aquecido. Adicionar 500 mL de NaOH 1M e continue a mexer até que a solução se torna claro. Filtrar a solução através de um filtro de PFA de papel para remover partículas e adicione 62,5 ml de tampão fosfato (77 mM de NaH ₂ PO _4, 287 mM de Na ₂ HPO _4, pH 7,4). Adicionar H ₂ O para um volume total de 250 ml. Congelar a -20 ° C em alíquotas de uso único.

7. Lavar uma vez com 1 ml de PBS por poço. Sem o tempo de incubação é necessário para este e todos os passos de lavagem subsequentes. Proceder de imediato para o passo 2.

Nota: É importante a proceder imediatamente à reacção clique, como o RNA degenera se manteve nesta fase, por períodos prolongados de tempo, uma perda do sinal de fluorescência do RNA já pode ser observado se as células são mantidas durante 1 hora a 4 ° C, . De igual modo, se porformando um experimento de evolução no tempo, não se esqueça de etiqueta, corrigir e mancha todas as amostras ao mesmo tempo.

2. Clique reação para detectar RNA Rotulado

1. Permeabilizar células por adição de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 em PBS. Incubar durante 10 minutos à RT.

Nota: Todas as soluções usadas nos passos 2.1 e 2.3 devem ser livre de nuclease.

2. Lavar três vezes com 1 ml de PBS por poço.
3. Remover lamelas placa de 12 poços e para dentro da câmara de transferência de humidade. Cobrir cada lamela com 50 - solução de coloração clique 100 ul (100 mM Tris pH 8,5, _CuSO4 1 mM, 20 mM de azida fluorescente [excitação / emissão máximo: 590/617 nm], ácido ascórbico a 100 mM) a cada. Incubar durante 1 h à RT, no escuro.

Nota: Para montar a câmara húmida, a linha inferior de uma cultura de células ou de uma placa de Petri com um diâmetro de 10 cm com uma película de plástico de parafina. Forrar o interior da borda da dish com toalhas de papel úmidas. Coloque as lamelas sobre a película de plástico de parafina.

Nota: Tenha cuidado para não deixar que as lamelas secar durante este ou qualquer outro passo no protocolo. É melhor adicionar a solução de coloração para cada lamela directamente depois de ter sido colocado na câmara de humidade.

Nota: Preparar a solução de coloração clique fresco imediatamente anterior a esta etapa. As soluções de reserva de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO _4, e 500 mM de ácido ascórbico pode ser armazenado a 4 ° C. No entanto, descartar qualquer solução de ácido ascórbico, que tornou-se amarelo.

Nota: Certifique-se de selecionar um fluoróforo que coincide com os filtros em seu microscópio fluorescente.

4. Remover lamelas de câmara úmida e coloque em uma placa de 12 poços fresco e lavar três vezes com 1 ml de PBS por poço.

Nota: Se nenhum deprotecção das proteínas virais é desejada, lamelas pode ser montado e fotografada após este passo (avançar para o passo 3.3.)

3. Imunofluorescência para detectar a expressão de proteínas virais

1. Adicionar 1 ml de tampão de bloqueio (3% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) em PBS) a cada poço e incubar durante 30 min à RT, no escuro.
2. Remover lamelas placa de 12 poços, a transferência para a câmara húmida e cobrir com 50-100 jul de anticorpo primário (anti-RVFV, uma simpática oferta do Dr. RB Tesh, UTMB), diluídas em tampão (1:500) de bloqueio. Incubar durante 1 h à RT, no escuro.

Nota: Quando este protocolo de adaptação para o uso com um vírus diferente, determinar a diluição óptima para o seu primeiro anticorpo primário.

Observação: Como alternativa, este passo pode ser realizado de O / N a 4 ° C no escuro.

3. Remover lamelas de câmara úmida e coloque de volta na placa de 12 poços e lavartrês vezes com 1 ml de PBS por poço.
4. Remover lamelas de 12 poços lugar, o local em câmara húmida e cobrir com 50-100 uL de anticorpo secundário (anti-IgG de ratinho conjugado com corante fluorescente [excitação / emissão máximo: 495/519 nm]) diluído em tampão de bloqueio (1: 500). Incubar durante 1 h à RT, no escuro.

Nota: Certifique-se de selecionar um anticorpo secundário que pode reconhecer o seu anticorpo primário e coincide com os filtros em seu microscópio fluorescente.

Nota: Se for desejado, 200 ng / ml de DAPI podem ser adicionados à diluição do anticorpo secundário para visualizar núcleos.

5. Remover lamelas da câmara húmida e local de volta para placa de 12 poços e lava-se três vezes com 1 ml de PBS por poço.
6. Monte lamelas, colocando uma gota (ca. 15 mL) de Fluoromount-G em uma lâmina de microscópio. Mergulhar o lamela em _H2O, remover o excesso de H ₂ O, tocando thlado e contra uma toalha de papel e coloque do lado do celular para dentro da gota de Fluoromount-G. Secar ao ar durante 5 min.

Nota: Se a imagem em um microscópio invertido, permitir Fluoromount-G para solidificar a 4 ° CO / N ou apor as lamelas para a lâmina de microscópio, selando a borda com unha polonês transparente.

Nota: As lâminas podem ser visualizados de imediato ou armazenados a 4 ° C no escuro até uma semana.

4. Aquisição de Dados

1. Imagem usando um microscópio fluorescente.

Nota: Certifique-se de selecionar fluorophores adequadas que podem ser visualizadas através de seu microscópio. Para referência, são os seguintes os fluoróforos e conjuntos de filtros usados ​​para adquirir as imagens apresentadas nesta publicação.

DAPI:
Filtro de excitação: BP 330-385
Dichromatic espelho: 400 DM
Filtro de emissão: LP 420

fluoróforo com uma excitação / emissão máxima de 495/519:
Filtro de excitação: BP 460-490
Dichromatic espelho: 505 DM
Filtro de emissão: LP 510

Fluoróforo com uma excitação / emissão máxima de 590/617:
Filtro de excitação: BP 545-580
Dichromatic espelho: 600 DM
Filtro de emissão: LP 610

Análise de citometria de fluxo por transcrição

5. Infectar as células com o MP-12 e etiqueta RNA nascentes com a UE

1. Semente de células 293 em placas de cultura de tecidos de 6 poços em meio de crescimento (DMEM contendo 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina). Incubar numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO _2, até que as células tenham atingido 80 - 100% de confluência.
2. Infectar as células com MP-12 a uma moi de 3. Incluir pelo menos dois dos poços não infectados: um dos dois poços servirão como controlo não infectado, o outro será tratado com ActD no passo5.4. Remova o meio de crescimento e diluir o estoque de vírus de modo a que o volume total adicionado a cada poço é de 400 uL. Incubar durante 1 hora numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO _2.
3. Remover inoculo e adicionar 2 ml de meio de crescimento fresco por poço. Incubar a 37 ° C durante 12 horas.

Nota: Se a adaptação deste protocolo para utilização com um outro vírus, é aconselhável realizar uma experiência de evolução no tempo para determinar o ponto de tempo óptimo para a rotulagem e colheita. Estabelecer esta evolução no tempo de modo a que os tempos de infecção são escalonados e todas as amostras podem ser marcados, colhidas e coradas ao mesmo tempo.

4. Aos 12 hpi, substitua meio de crescimento com meio contendo UE 0,5 mM. Para um dos poços infectadas falsas, também adicionam-se 5 ug / ml de ActD. Isto servirá como controle para a supressão da transcrição, como ActD inibe a síntese de ARN dependente de ADN. Retorno células na incubadora.
5. Aos 13 hpi, lave as células uma vez a sagacidadeh PBS e colheita das células por tripsinização. Lave as células colhidas três vezes com PBS contendo EDTA a 1 mM (PBS-EDTA).

Nota: Durante este e os passos subsequentes, não centrifugar células mais rápido do que 500 - 1000 xg para evitar a ruptura da célula. Centrifugar células para 1 - 2 min de sedimentos.

Nota: Se um immunostaining superfície está prevista após a reação click, colheita usando um policial de borracha ou raspador de células descartáveis ​​vez.

6. Fixar as células por ressuspensão em 1 ml de 4% de PFA e incubar durante 30 min à TA. Consulte o passo 1.6 para obter instruções sobre como preparar PFA 4%.
7. Lavar uma vez com 1 ml de PBS-EDTA por cavidade. Prossiga imediatamente para a etapa 6.

Nota: É importante a proceder imediatamente à reacção clique, como o RNA degenera se manteve nesta fase, por períodos prolongados de tempo. Do mesmo modo, se executar um tempo cexperiência ourse, não se esqueça de etiquetar, corrigir e mancha todas as amostras ao mesmo tempo.

6. Clique reação para detectar RNA Rotulado

1. Permeabilizar células por ressuspensão em 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 em PBS. Incubar durante 10 minutos à RT.

Nota: Todas as soluções usadas nos passos 6,1-6,3 necessidade de ser livre de nuclease.

Nota: Se as células não sedimentos adequadamente durante esta etapa, aumenta o tempo de centrifugação de 5 min. Comportamento de sedimentação irá melhorar quando as células são suspensas em tampão FACS (passo 6.4).

2. Lavar uma vez com 1 ml de PBS.

Nota: Não use EDTA nesta etapa, pois isso quelar o Cu ^{2 +} íons necessária para a reação clique.

3. Ressuspender as células em 200 ul de solução de coloração clique (Tris 100 mM pH 8,5, _CuSO4 1 mM, azida de 200nM marcado com corante fluorescente [excacreditação / emissão máximo: 650/665 nm], ácido ascórbico a 100 mM). Incubar durante 1 h à RT, no escuro.

Nota: Preparar a solução de coloração clique fresco imediatamente anterior a esta etapa. As soluções de reserva de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO _4, e 500 mM de ácido ascórbico pode ser armazenado a 4 ° C. No entanto, descartar qualquer solução de ácido ascórbico, que tornou-se amarelo.

Nota: Se as células se agregam durante esta etapa, ressuspender pipetando cima e para baixo várias vezes.

Nota: Certifique-se de selecionar um fluoróforo que pode ser detectado pelo citômetro de fluxo.

Nota: se preparar também uma amostra de células não infectadas que são submetidos ao processo de coloração clique, estes irão ser necessários para a calibração do citómetro de fluxo. Ou utilizar metade das células infectadas, ou incluir um poço adicional infectadas no passo 5.2. Estes controlo células serão imunocoradas no passo 7.1.

4. Lavar duas vezes com tampão FACS (PBS contendo EDTA 1 mM e 0,5% (w / v) BSA).

Nota: Se nenhum imunomarcação de proteínas virais é desejado, as células podem ser analisadas imediatamente (prosseguir para o passo 8).

7. Imunofluorescência para detectar a expressão de proteínas virais

1. Ressuspender as células em 200 ul do anticorpo primário (anti-RVFV) diluído em tampão de SCAF (1:10.000) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro.

Observação: Como alternativa, este passo pode ser realizado de O / N a 4 ° C no escuro.

Nota: se preparar também uma amostra de células não infectadas, que foram submetidas ao procedimento de coloração clique, mas não vai ser corada, estes irão ser necessários para a calibração do citómetro de fluxo. Ou utilizar metade das células infectadas por simulação ou incluir um poço adicional não infectadas empasso 5.2.

Nota: Quando este protocolo de adaptação para o uso com um vírus diferente, determinar a diluição óptima para o seu primeiro anticorpo primário.

2. Lave as células duas vezes em tampão de SCAF.
3. Ressuspender as células em 200 uL de anticorpo secundário (anti-IgG de ratinho conjugado com corante fluorescente [excitação / emissão máximo: 495/519 nm]) diluído em tampão de SCAF (1:1.000) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro.
4. Lave as células uma vez em tampão de FACS.

Nota: Neste ponto, as células podem ser armazenadas O / N a 4 ° C no escuro.

8. Aquisição de Dados

1. Ressuspender as células em 500 ul de tampão de FACS, transferência para tubos de 5 ml e analisam poliestireno, utilizando um citómetro de fluxo. Utilize-12 MP células infectadas (nenhum clique reacção, só a coloração anti-RVFV) e células infectadas simuladas (click reacção apenas) para calibrar o instrumento.

Nãoe: Não se esqueça de selecionar fluorophores adequadas que podem ser detectados por seu instrumento. Para referência, são as seguintes as linhas de laser e conjuntos de filtros utilizados para obter os dados mostrados nesta publicação.

Com um fluoróforo de excitação / emissão de espectro de 495/519:
Laser: 488 nm
Filtro: 530/30

Com um fluoróforo de excitação / emissão de espectro de 650/665:
Laser: 640 nm
Filtro: 670/20

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Resultados

A protea de NSS RVFV (Bunyaviridae família, género Phlebovírus) ¹¹ inibe a transcrição geral da célula hospedeira através de dois mecanismos distintos: (i) por sequestrar a subunidade p44 do factor de transcrição basal TFIIH ¹¹ e (ii), promovendo a degradação da p62 proteossômica subunidade de TFIIH ^6. O RVFV MP-12 estirpe ^{13 de} vacina tem sido usada para os experimentos descritos neste protocolo, desde MP-12 estirpe pode ser tratado em nível de ...

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Discussão

O protocolo fornecido descreve um método para medir o efeito da infecção virai em transcrição da célula hospedeira através da incorporação do análogo de uridina UE em ARN nascentes. Este método possui várias vantagens sobre os métodos anteriores: é rápido, sensível e que não contam com a utilização de isótopos radioactivos. Além disso, o método pode ser adaptado para se obter dados qualitativos através de microscopia de fluorescência ou de dados quantitativos através de citometria de fluxo, util...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips	Fisherbrand	12-545-82
5 ml polystyrene tubes	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI	Sigma	D-9542	dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)	Invitrogen	A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	dissolve in H2O for 500 mM
paper filter	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Fluorescence Microscope			e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer			e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa