Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis

Resumen

Este método describe el uso de la química clic para medir los cambios en la transcripción de la célula huésped después de la infección con el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) cepa MP-12. Los resultados se pueden visualizar a través de microscopía de fluorescencia cualitativamente o cuantitativamente obtenerse a través de citometría de flujo. Este método es adaptable para su uso con otros virus.

Resumen

Muchos virus de ARN han desarrollado la capacidad para inhibir la transcripción célula huésped como un medio para eludir las defensas celulares. Para el estudio de estos virus, por lo tanto, es importante disponer de una manera rápida y fiable de medición de la actividad transcripcional en las células infectadas. Tradicionalmente, la transcripción se ha medido ya sea por la incorporación de nucleósidos radiactivos tales como ^3H-uridina seguido por la detección mediante autorradiografía o recuento de centelleo, o la incorporación de análogos halogenados tales como uridina 5-bromouridina (BRU) seguido de la detección a través de inmunotinción. El uso de isótopos radiactivos, sin embargo, requiere un equipo especializado y no es factible en una serie de entornos de laboratorio, mientras que la detección de BrU puede ser engorroso y puede sufrir de baja sensibilidad.

La química clic desarrollado recientemente, que consiste en una formación de triazol catalizada por cobre de una azida y un alquino, ahora proporciona un rápido y highly alternativa sensible a estos dos métodos. Haga clic en la química es un proceso de dos pasos en el que el ARN nacientes se etiqueta por primera incorporación de la uridina análogo 5-etiniluridina (UE), seguido por la detección de la etiqueta con una azida fluorescente. Estos azidas están disponibles como varios fluoróforos diferentes, lo que permite una amplia gama de opciones para la visualización.

Este protocolo describe un método para medir la supresión transcripcional en células infectadas con el virus de la fiebre de Rift Valley (RVFV) cepa MP-12 usando química clic. Al mismo tiempo, la expresión de proteínas víricas en estas células se determina por inmunotinción intracelular clásica. Los pasos 1 a 4 detalle un método para visualizar la represión transcripcional a través de microscopía de fluorescencia, mientras que los pasos del 5 al 8 de detalle un método para cuantificar la represión transcripcional mediante citometría de flujo. Este protocolo es fácilmente adaptable para su uso con otros virus.

Introducción

Tradicionalmente, la actividad transcripcional se ha medido mediante la incorporación de cualquiera radiactivo ⁽³ H-uridina) ¹ o halogenados (BRU) ² nucleósidos en ARN nacientes. Estos análogos de uridina son absorbidos por las células, convertidos en uridina-trifosfato (UTP) a través de la vía de recuperación de nucleósido, y posteriormente incluidas en los ARN recientemente sintetizado. ³ H-uridina pueden ser detectados por autorradiografía, que puede llevar mucho tiempo, o de centelleo contando, que requiere un equipo especializado. Por otra parte, el uso de isótopos radiactivos puede no ser práctico en una serie de entornos de laboratorio, incluidos los laboratorios de alta contención de seguridad de la biotecnología. BrU se puede detectar a través de inmunotinción con anticuerpos anti-Bru, que pueden requerir la permeabilización áspera para garantizar el acceso del anticuerpo al núcleo o desnaturalización parcial de ARN, como la estructura secundaria del ARN podría ser un impedimento estérico para la unión de anticuerpos.

_content "> El protocolo descrito aquí utiliza el Click recientemente desarrollado clic química ³ para medir la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12. química se basa en un cobre altamente selectiva y eficiente (I) catalizada por reacción de cicloadición entre un alquino y un resto azida ^4,5. En este protocolo, ARN naciente en las células infectadas se etiqueta primero a través de la incorporación de uridina análogo de la UE. En un segundo paso, que se incorpora a la UE se detecta a través de la reacción con una azida fluorescente. Las principales ventajas de este método son (1) que no requiere el uso de isótopos radiactivos y (2) que no requiere la permeabilización dura o desnaturalización del ARN. Con un peso molecular de menos de 50 Da, el acceso de la azida fluorescente no esté impedido por el insuficiente estructura secundaria permeabilización o ARN. Además, los investigadores no están limitados en su elección de anticuerpos primarios cuando la combinación de la detección de ARN con una claseinmunotinción ical para las proteínas virales.

Dos diferentes métodos se describen en este protocolo: uno para la visualización de la transcripción a través de microscopía de fluorescencia (pasos 1-4), y uno para la cuantificación de la transcripción a través de citometría de flujo (pasos 5-8). Ambos de estos métodos cosechadora etiquetado de ARN naciente con una inmunotinción intracelular de proteínas virales, lo que permite una correlación entre la actividad transcripcional y la infección viral en una base de celda por celda.

Los autores han utilizado con éxito el protocolo que se describe aquí para determinar la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12 ^6, las células infectadas con diferentes MP-12 mutantes ^{7,8, 9,} y las células infectadas con el virus Toscana (TOSV) ^10. El protocolo descrito aquí puede ser fácilmente adaptado para el uso con diferentes virus y tiene el potencial de ser modificado para incluir la tinción de inmunofluorescencia de las proteínas virales o celulares específicas.

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Protocolo

Análisis de la transcripción por microscopía de fluorescencia

1. Infectar las células con el MP-12 y la etiqueta de ARN naciente con la UE

1. Lugar 12 mm cubreobjetos redondos en placa de cultivo tisular de 12 pocillos, un cubreobjetos por pocillo.

Nota: Si las células tienen problemas para la adhesión a cubreobjetos, la capa con poli-L-lisina (MW ≥ 70000) antes de colocar en los pozos. Para este objetivo, cubreobjetos de sumergir en una solución estéril de 0,1 mg / ml en _H2O de poli-L-lisina durante 5 min. Enjuague cubreobjetos con _H2O estéril y secar al aire durante al menos 2 horas.

2. Para las células de semillas 293 en cubreobjetos, añadir x 10 células ⁴ 5 en 1 ml de medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) por pocillo. Incubar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% CO ₂ S / N.
3. Infectar las células con MP-12 a una multiplicidad de infección (MOI) de 3. Incluya por lo menos dos pozos no infectados: uno de los dos pozos servirán como el control no infectado, y el otro serán tratados con actinomicina D (ActD) en el paso 1.5 como un control para la supresión transcripcional. Retire medio de crecimiento y se diluye el stock de virus de manera que el volumen total añadido a cada pocillo es de 200 ml. Incubar durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO _2.

Nota: En vez de infectar a las células, las células también se pueden transfectar con ADN plásmido o in vitro sintetizan ARN que codifica una proteína viral específica. Para este objetivo, transfectar células con un reactivo de transfección química apropiada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y continúe en el paso 1.5 a 16 h después de la transfección. Es aconsejable para optimizar las condiciones de transfección y el tiempo de incubación antes de su etiquetado ARN y la fijación.

4. Eliminar el inóculo y se añade 1 ml de medio de cultivo fresco por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 15 hr.

ove_content "> Nota:. Si la adaptación de este protocolo para el uso con otro virus, es aconsejable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo para determinar el momento óptimo para el etiquetado de ARN y la fijación Configurar este curso de tiempo de modo que los tiempos de infección están escalonadas y todos muestras pueden ser etiquetados, se fijaron, y se tiñeron en el mismo tiempo.

5. En 15 horas después de la infección (hpi), sustituya medio de cultivo con medio que contenía 1 mM UE. Para uno de los pozos de infección simulada, también añadir 5 g / ml de ActD. Esto servirá como el control para la supresión de la transcripción, como ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente de ADN. Células Volver a la incubadora.
6. A los 16 hpi, eliminar el medio y lavar los cubreobjetos de una vez con 1 ml de PBS (KCl 0,20 g / L, KH ₂ PO ₄ 0,20 g / l, NaCl 8,00 g / L, Na ₂ HPO ₄ 1,15 g / L, pH 7,4) por pocillo. Fijar las células mediante la adición de 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) por pocillo e incubando durante 30 min a TA.

Nota: Para preparar la solución de fijación PFA 4%, se disuelven 10 g de paraformaldehído en 150 ml de H ₂ O se calienta a 60 ° C en un agitador magnético con calefacción. Añadir 500 l de NaOH 1 M y seguir removiendo hasta que la solución se aclare. Filtrar la solución de PFA a través de un papel de filtro para eliminar las partículas y añadir 62,5 ml de tampón de fosfato (77 mM NaH ₂ PO _4, 287 mM de Na ₂ HPO _4, pH 7,4). Añadir _H2O hasta un volumen total de 250 ml. Congelar a -20 ° C en alícuotas de un solo uso.

7. Lavar una vez con 1 ml de PBS por pocillo. No se requiere tiempo de incubación para este y todos los pasos de lavado posteriores. Proceda inmediatamente al paso 2.

Nota: Es importante para proceder inmediatamente con la reacción de click, como el ARN degenera si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados de tiempo, una pérdida de la señal de fluorescencia de RNA ya se puede observar si las células se mantienen durante 1 hora a 4 ° C . Del mismo modo, si porformando un experimento de evolución en el tiempo, asegúrese de etiqueta, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo.

2. Haga clic en la reacción para detectar ARN marcado

1. Permeabilizar las células mediante la adición de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 en PBS. Incubar durante 10 min a TA.

Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 2.1 a 2.3 deben estar libre de nucleasa.

2. Lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo.
3. Retire cubreobjetos de la placa de 12 pocillos y transferencia en cámara húmeda. Cubra cada portaobjetos con 50 - 100 l solución de tinción clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM de _CuSO4, 20 mM de azida fluorescente [excitación / emisión máxima: 590/617 nm], ácido ascórbico 100 mM) cada uno. Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Para el montaje de la cámara húmeda, línea de la parte inferior de un cultivo de células o placa de Petri con un diámetro de 10 cm con una película de plástico de parafina. Forre el interior del borde de la diSH con toallas de papel húmedas. Coloque el cubreobjetos sobre la película de parafina plástico.

Nota: Tenga cuidado de no dejar que los cubreobjetos se sequen durante este o cualquier otro paso en el protocolo. Lo mejor es añadir la solución de tinción a cada cubreobjetos directamente después de que se ha colocado en la cámara húmeda.

Nota: Preparar la solución de tinción clic fresco inmediatamente antes de este paso. Las soluciones madre de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de _CuSO4, y ácido ascórbico 500 mM se pueden almacenar a 4 ° C. Sin embargo, descartar cualquier solución de ácido ascórbico que se ha convertido amarillo.

Nota: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que coincida con los filtros de su microscopio de fluorescencia.

4. Retire cubreobjetos de cámara húmeda y colocar en una placa de 12 pocillos frescos y lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo.

Nota: si no dese desea la protección de las proteínas virales, cubreobjetos se puede montar y fotografiada después de este paso (vaya al paso 3.3).

3. La inmunofluorescencia para detectar la expresión de las proteínas virales

1. Añadir 1 ml de tampón de bloqueo (3% (w / v) de suero de albúmina (BSA) en PBS bovina) a cada pocillo y se incuba durante 30 min a TA en la oscuridad.
2. Retire cubreobjetos de placa de 12 pocillos, de transferencia en cámara húmeda y cubra con 50 - 100 l de anticuerpo primario (anti-RVFV, una especie de regalo del Dr. RB Tesh, UTMB) diluido en tampón de bloqueo (1:500). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Cuando la adaptación de este protocolo para su uso con un virus diferente, determinar la dilución óptima para su anticuerpo primario primero.

Nota: Como alternativa, este paso se puede realizar de O / N a 4 ° C en la oscuridad.

3. Retire cubreobjetos de cámara húmeda y lugar de nuevo en placa de 12 pocillos y lavartres veces con 1 ml de PBS por pocillo.
4. Retire cubreobjetos de un lugar de 12 pocillos, en lugar cámara húmeda y cubierta con 50 - 100 l de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón conjugado con colorante fluorescente [excitación / emisión máxima: 495/519 nm]) diluido en tampón de bloqueo (1: 500). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Asegúrese de seleccionar un anticuerpo secundario que puede reconocer el anticuerpo primario y coincide con los filtros de su microscopio de fluorescencia.

Nota: Si se desea, 200 ng / ml de DAPI se puede añadir a la dilución de anticuerpo secundario para visualizar los núcleos.

5. Retire cubreobjetos de la cámara húmeda y lugar de nuevo en placa de 12 pocillos y lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo.
6. Montar cubreobjetos mediante la colocación de una gota (ca. 15 l) de Fluoromount-G en un portaobjetos de microscopio. Sumerja el portaobjetos en H ₂ O, eliminar el exceso de H ₂ O tocando ªlado de correo contra una toalla de papel, y el lugar de células del lado hacia abajo en la gota de Fluoromount-G. Deje secar al aire durante 5 minutos.

Nota: Si formación de imágenes en un microscopio invertido, permitir Fluoromount-G para solidificar a 4 ° CO / N o colocar el cubreobjetos en el portaobjetos de un microscopio mediante el sellado del borde con esmalte de uñas transparente.

Nota: diapositivas se pueden visualizar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de una semana.

4. Adquisición de Datos

1. De imagen usando un microscopio de fluorescencia.

Nota: Asegúrese de seleccionar fluoróforos adecuados que se pueden visualizar utilizando su microscopio. Como referencia, los siguientes son los fluoróforos y conjuntos de filtros utilizados para la adquisición de las imágenes mostradas en esta publicación.

DAPI:
Filtro de excitación: BP 330-385
Dichromatic espejo: 400 DM
Filtro de emisiones: LP 420

Fluoróforo con un máximo de excitación / emisión de 495/519:
Filtro de excitación: BP 460-490
Dichromatic espejo: 505 DM
Filtro de emisiones: LP 510

Fluoróforo con un máximo de excitación / emisión de 590/617:
Filtro de excitación: BP 545-580
Dichromatic espejo: 600 DM
Filtro de emisiones: LP 610

Análisis de la transcripción por citometría de flujo

5. Infectar las células con el MP-12 y la etiqueta de ARN naciente con la UE

1. Semilla células 293 en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos en medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina). Incubar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO ₂ hasta que las células han alcanzado el 80 - 100% de confluencia.
2. Infectar las células con MP-12 a una moi de 3. Incluir al menos dos pozos infectados: uno de los dos pozos servirá como control no infectado, el otro serán tratados con ActD en el paso5.4. Retire medio de crecimiento y se diluye el stock de virus de manera que el volumen total añadido a cada pocillo es de 400 l. Incubar durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO _2.
3. Retire inóculo y añadir 2 ml de medio de cultivo fresco por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 12 hr.

Nota: Si la adaptación de este protocolo para el uso con otro virus, es aconsejable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo para determinar el momento óptimo para el etiquetado y la cosecha. Establecer este supuesto tiempo de modo que los tiempos de infección están escalonados y todas las muestras pueden ser etiquetados, se recogieron, y se tiñeron en el mismo tiempo.

4. A las 12 hpi, sustituya medio de cultivo en un medio con 0,5 mM UE. Para uno de los pozos de infección simulada, también añadir 5 g / ml de ActD. Esto servirá como el control para la supresión de la transcripción, como ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente de ADN. Células Volver a la incubadora.
5. A los 13 hpi, lavar las células una vez que el ingenioh PBS y la cosecha por tratamiento con tripsina de las células. Lavar las células cosechadas tres veces con PBS que contenía 1 mM de EDTA (PBS-EDTA).

Nota: Durante esta y las siguientes medidas, no centrifugar las células más rápidamente que 500 - 1000 xg para evitar la rotura celular. Centrifugar las células durante 1-2 min para sedimentar.

Nota: Si se planea una inmunotinción superficie siguiendo la reacción de click, la cosecha utilizando una goma de policía o un raspador celular desechable en su lugar.

6. Fijar las células mediante resuspensión en 1 ml de PFA al 4% y se incuba durante 30 min a TA. Consulte el paso 1.6 para obtener instrucciones sobre cómo preparar 4% PFA.
7. Lavar una vez con 1 ml de PBS-EDTA por pocillo. Proceda inmediatamente al paso 6.

Nota: Es importante para proceder inmediatamente con la reacción de click, como el ARN degenera si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados de tiempo. Del mismo modo, si se realiza una vez cexperimento ourse, asegúrese de etiquetar, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo.

6. Haga clic en la reacción para detectar ARN marcado

1. Permeabilizar las células mediante resuspensión en 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 en PBS. Incubar durante 10 min a TA.

Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 6.1 a 6.3 deben estar libre de nucleasa.

Nota: Si las células no hacen sedimentos correctamente durante este paso, aumentar el tiempo de centrifugación de 5 min. Comportamiento de sedimentación se mejorará una vez que las células se suspenden en tampón FACS (paso 6.4).

2. Lavar una vez con 1 ml de PBS.

Nota: No utilice EDTA en este paso, ya que esto quelar el Cu ^{2 +} iones necesarios para la reacción de click.

3. Resuspender las células en 200 l solución de tinción clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM de _CuSO4, 200 nM azida marcado con colorante fluorescente [exclitación / máximo de emisión: 650/665 nm], ácido ascórbico 100 mM). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Preparar la solución de tinción clic fresco inmediatamente antes de este paso. Las soluciones madre de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de _CuSO4, y ácido ascórbico 500 mM se pueden almacenar a 4 ° C. Sin embargo, descartar cualquier solución de ácido ascórbico que se ha convertido amarillo.

Nota: Si las células se agrupan durante este paso, volver a suspender pipeteando arriba y abajo varias veces.

Nota: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que puede ser detectada por el citómetro de flujo.

Nota: también preparar una muestra de las células infectadas que no están sometidos al procedimiento de tinción clic; éstos serán necesarios para la calibración del citómetro de flujo. Cualquier uso de la mitad de las células infectadas o incluir un adicional de infección así en el paso 5.2. Estos concélulas trol se immunostained en el paso 7.1.

4. Lavar dos veces con tampón FACS (PBS que contenía 1 mM de EDTA y 0,5% (w / v) de BSA).

Nota: Si no se desea inmunotinción de proteínas virales, las células se pueden analizar inmediatamente (continúe en el paso 8).

7. La inmunofluorescencia para detectar la expresión de las proteínas virales

1. Resuspender las células en 200 l de anticuerpo primario (anti-RVFV) diluidos en tampón FACS (1:10.000) y se incuban durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Como alternativa, este paso se puede realizar de O / N a 4 ° C en la oscuridad.

Nota: También prepara una muestra de las células no infectadas que se sometieron al procedimiento de tinción clic, pero no se immunostained, éstos serán necesarios para la calibración del citómetro de flujo. Cualquier uso de la mitad de las células infectadas simuladas o incluir un bien no infectada adicional enpaso 5.2.

Nota: Cuando la adaptación de este protocolo para su uso con un virus diferente, determinar la dilución óptima para su anticuerpo primario primero.

2. Lavar las células dos veces en tampón FACS.
3. Resuspender las células en 200 l de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón conjugado con colorante fluorescente [excitación / emisión máxima: 495/519 nm]) diluido en tampón FACS (1:1.000) y se incuba durante 1 hora a TA en la oscuridad.
4. Lavar las células una vez en tampón FACS.

Nota: En este punto, las células pueden ser almacenadas O / N a 4 ° C en la oscuridad.

8. Adquisición de Datos

1. Resuspender las células en 500 l de tampón FACS, transferencia en tubos de poliestireno de 5 ml y analizar utilizando un citómetro de flujo. Usa-12 MP células infectadas (ninguna reacción clic, sólo tinción anti-RVFV) y las células infectadas simuladas (haga clic reacción sólo) para calibrar el instrumento.

Noe: Asegúrese de seleccionar fluoróforos que pueden ser detectados por el instrumento. Como referencia, las siguientes son las líneas de láser y conjuntos de filtros utilizados para la adquisición de los datos mostrados en esta publicación.

Fluoróforo con un espectro de excitación / emisión de 495/519:
Láser: 488 nm
Filtrar: 530/30

Fluoróforo con un espectro de excitación / emisión de 650/665:
Láser: 640 nm
Filtrar: 670/20

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Resultados

La proteína NE de RVFV (familia Bunyaviridae, género Phlebovirus) ¹¹ inhibe la transcripción en general célula huésped a través de dos mecanismos distintos: (i) por secuestrante de la subunidad p44 del factor de transcripción basal TFIIH ¹¹ y (ii) mediante la promoción de la degradación proteasomal de la p62 subunidad de TFIIH ^6. El MP-12 cepa de la vacuna ¹³ RVFV se ha utilizado para los experimentos descritos en este protocolo desde el MP-12 cepa s...

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Discusión

El protocolo proporcionado describe un método para medir el efecto de la infección viral en la transcripción de la célula huésped a través de la incorporación de uridina análogo de la UE en el ARN nacientes. Este método tiene varias ventajas sobre los métodos anteriores: es rápido, sensible, y no se basa en el uso de isótopos radiactivos. Además, el método puede ser adaptado para producir los datos cualitativos a través de microscopía de fluorescencia o de datos cuantitativos a través de citometría de ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips	Fisherbrand	12-545-82
5 ml polystyrene tubes	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI	Sigma	D-9542	dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)	Invitrogen	A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	dissolve in H2O for 500 mM
paper filter	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Fluorescence Microscope			e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer			e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa