宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

要約

この方法は、リフトバレー熱ウイルス（RVFV）MP-12株による感染の後、宿主細胞転写の変化を測定するためにクリックケミストリーの使用を記載している。結果は、蛍光顕微鏡を介して、定性的に可視化またはフローサイトメトリーを介して定量的に得ることができる。この方法は、他のウイルスとの使用に適合可能である。

要約

多くのRNAウイルスは、細胞の防御を回避する手段として、宿主細胞の転写を阻害する能力を進化させてきた。これらのウイルスの研究のために、感染細胞において転写活性を測定する迅速かつ信頼できる方法を有することが重要である。伝統的に、転写はH-ウリジンは、このような免疫を介して検出が続き、5 -ブロモウリジン（BRU）などのハロゲン化ウリジン類似体のオートラジオグラフィーまたはシンチレーション計数、または組み込みを介した検出が続く³などの放射性ヌクレオシドの取り込みのいずれかにより測定された。 BRUの検出が煩雑になることができ、低感度に苦しむかもしれない放射性同位体の使用は、しかしながら、特殊な装置を必要とし、実験室の設定の数には不可能である。

アジドとアルキンから銅触媒トリアゾール形成を含む最近開発されたクリックケミストリーは、今では迅速かつhighlを提供していますこれら2つの方法にyを敏感代わる。クリックケミストリーは、新生RNAは、第1の蛍光アジドとの標識の検出に続いてアナログウリジン-5 - ethynyluridine（EU）の取り込みにより標識された2段階プロセスである。これらのアジドは可視化のためのオプションの広い範囲を可能にする、いくつかの異なる蛍光体として利用可能です。

このプロトコルは、クリックケミストリーを用いたリフトバレー熱ウイルス（RVFV）株MP-12に感染した細胞内で転写抑制を測定する方法を説明しています。同時に、これらの細胞におけるウイルスタンパク質の発現は、古典的な細胞内の免疫染色によって決定される。 4詳細手順1〜8詳細を通して、フローサイトメトリーを介した転写抑制を定量化する方法を、手順5ながら、蛍光顕微鏡を介した転写抑制を可視化する方法。このプロトコルは、他のウイルスとの使用に容易に適応可能である。

概要

伝統的に、転写活性は、放射性^（3 H-ウリジン^）1のいずれかの取り込みを介して測定または新生RNAに^（BRU）2ヌクレオシドハロゲン化されています。これらウリジン類似体は、細胞に取り込まヌクレオシドサルベージ経路を介しウリジン三リン酸（UTP）に変換され、続いて新たに合成されたRNAに組み込ま^。3 H-ウリジンは、時間がかかることがオートラジオグラフィー、またはシンチレーションによって検出することができているカウント、特殊な装置を必要とします。さらに、放射性同位元素の使用が高い封じ込めバイオ研究所を含め、実験室の設定の数には実用的ではないかもしれない。 BRUは、RNA二次構造は、抗体結合のための立体障害かもしれないとして、RNAの核または部分変性に対する抗体のアクセスを確保するため厳しい透過処理が必要になる場合があります抗BRU抗体による免疫染色で検出することができます。

_content ">ここで記述されたプロトコルは、最近RVFV株MP-12に感染した細胞内で転写活性を測定する化学^3をクリックして開発した。クリックケミストリーは非常に選択的かつ効率的な銅（I）触媒によるアルキンとの間の付加環化反応に依存して利用^4,5アジド部分は、このプロトコルでは、感染細胞における新生RNAは、第ウリジンアナログEUの取り込みを介して標識される。第二 ​​工程では、取り込まれたEU、蛍光アジドとの反応により検出される。この方法の主な利点はそれは放射性同位元素の使用を必要とせず、それはRNAの過酷な透過又は変性を必要としないこと。50μm未満Daの分子量と（2）、蛍光アジドのアクセスが不十分なことによって妨げられない（1）ということである透過またはRNAの二次構造。クラスにRNAの検出を組み合わせた場合また、研究者は一次抗体の彼らの選択に限定されるものではないウイルスタンパク質の免疫染色のiCal。

蛍光顕微鏡（ステップ1-4）を介して転写を可視化するための一つであり、フローサイトメトリー（ステップ5-8）を介して転写を定量化するためのいずれかの2つの異なる方法は、このプロトコルに記載されている。どちらの方法でも、セル単位で転写活性とウイルス感染との間の相関を可能にするウイルスタンパク質に対する免疫細胞内で新生RNAの標識を結合する。

著者らは、正常プロトコルがRVFV株MP-12 ^6、トスカーナウイルス^（TOSV）10に感染した別のMP-12変異体^7,8、9、及び細胞に感染した細胞に感染した細胞において転写活性を決定するために、ここで説明に使用した。ここで説明するプロトコルは、簡単に異なるウイルスの使用に適合し、特定のウイルス又は細胞タンパク質の免疫蛍光染色を含むように修正される可能性を有することができる。

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プロトコル

蛍光顕微鏡法による転写の分析

1。 EUとのMP-12とラベル新生RNAと細胞に感染

1. 12ウェル組織培養プレート中に場所が12mmの円形カバーガラス、ウェルごとにカバースリップ。

注：細胞がウェル内に配置する前に、トラブルカバーガラスに付着し、ポリ-L-リジン（MW≥70,000）とコートを持っている場合。この目的のために、5分間のポリ-L-リジンのH ₂ O中の無菌の0.1 mg / mlの溶液中で水没カバースリップ。少なくとも2時間のための無菌H ₂ Oと空気乾燥でカバーグラスをすすぐ。

2. カバースリップ上にシード293細胞を、ウェルあたり、1mlの増殖培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン、100 mg / mlのストレプトマイシンを含む）中で5×10 ⁴細胞を加える。 37℃加湿インキュベーター内でインキュベート℃、5％CO ₂ O / N
3. 3の感染多重度（MOI）でMP-12で細胞を感染させる。うちの少なくとも2つを含む感染していない井戸：2つのウェルのいずれかが感染していない対照となる、もう一方は転写抑制のための制御としてステップ1.5でアクチノマイシンD（ACTD）で処理されます。増殖培地を取り外し、各ウェルに加え総量が200ミリリットルになるように、ウイルスストックを希釈。 ℃、5％CO _2、37℃加湿インキュベーター中で1時間インキュベートする。

注：代わりに細胞を感染から、細胞はまた、プラスミドDNAでトランスフェクト又はインビトロで特定のウイルスタンパク質をコードするRNAを合成することができる。この目的のために、適切な化学トランスフェクション試薬とトランスフェ細胞は、製造元の指示に従って、16時間後にトランスフェクションで1.5に進みます。それは、RNAラベリングと固定前にトランスフェクション条件とインキュベーション時間を最適化することをお勧めします。

4. 接種を外し、ウェルあたり1ミリリットル新鮮な増殖培地を追加します。 15時間37℃でインキュベートする。

ove_content "> 注：別のウイルスで使用するために、このプロトコルを適合させる場合は、RNAの標識および固定のために最適な時点を決定するために経時変化実験を行うことをお勧めします感染時間をずらして、すべてされるように、この経時変化を設定します。サンプルは、標識固定し、同時に染色することができる。

5. 15時間感染後（HPI）では、1 mMのEUを含む培地で増殖培地を交換してください。モック感染井戸のいずれかに、また5μgの/ミリリットルACTDを追加します。 ACTDはDNA依存性RNA合成を阻害するので、これは、転写抑制のためのコントロールとして機能します。インキュベーターにセルを返します。
6. 16 hpiの時、培地を除去し、1mlのPBS（KClを0.20グラム/ L、KH ₂ PO ₄ 0.20グラム/ L、NaClを8.00グラム/ LのNa ₂ HPO ₄ 1.15グラム/ L、pH7.4）で一回カバースリップを洗うウェルあたり。ウェルあたり4％パラホルムアルデヒド（PFA）を1ml添加​​し、RTで30分間インキュベートして細胞を固定する。

注意：4％PFA固定液を調製するために、°Cに加熱マグネチックスターラーで60まで加熱し150ミリリットルH ₂ O中に10グラムパラホルムアルデヒドを溶解する。 1MのNaOHを500μlを加え、溶液が透明になるまで攪拌し続ける。粒子を除去し、62.5ミリリットルリン酸緩衝液（77 mMののNaH ₂ PO _4、287 mMの_の Na ₂ HPO _4、pHは7.4）を追加するろ紙を通してフィルタPFAソリューション。 250ミリリットルの総容積にH ₂ Oを追加します。シングルユースのアリコートで-20℃で凍結。

7. ウェルあたり1mlのPBSで一回洗浄します。いいえインキュベーション時間は、この後続のすべての洗浄ステップは必要ありません。ステップ2にすぐに進みます。

注：長期間で、この段階で維持する場合RNAは退化ように、それは、すぐにクリック反応を進めることが重要である細胞を、4℃で1時間保持している場合はRNA蛍光信号の損失は、すでに観察することができる°C 。同様に、当たりの場合経時実験を形成する、ラベルに必ず修正し、同時にすべてのサンプルを染色。

2。標識RNAを検出する反応をクリック

1. 1mlのPBS中の0.2％トリトンX-100を加えることによって、細胞を透過性。室温で10分間インキュベートする。

注：ステップ2.1から2.3で使用されるすべてのソリューションは、ヌクレアーゼフリーのようにする必要があります。

2. ウェルあたり1mlのPBSで三回洗浄する。
3. 湿度の高い室に12ウェルプレートと転送からカバースリップを削除します。各：100μlのクリック染色液（100mMのアスコルビン酸100mMトリスpHは8.5、1 mMののCuSO _4、20μM蛍光アジ[617分の590 nmの励起/発光最大]） - 50で各カバースリップをカバーしています。暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。

注：湿潤チャンバーを組み立てるために、プラスチック製パラフィンフィルムで10センチ径のライン細胞培養やペトリ皿の底を。ジの端部の内側に並ぶ湿らせたペーパータオルでSH。プラスチックパラフィンフィルム上にカバースリップを置きます。

注意：カバーガラスは、プロトコルでは、このまたは他の任意のステップの間に乾燥させないように注意してください。それは湿気のあるチャンバ内に配置された後に直接各カバースリップに染色液を追加することをお勧めします。

注意：このステップの直前に新鮮クリック染色液を準備します。 1.5 MトリスpH8.5の100mMののCuSO _4、及び500mMのアスコルビン酸のストック溶液を4℃で保存することができるしかし、黄色になって、任意のアスコルビン酸原液を捨てる。

注意：お使いの蛍光顕微鏡のフィルターに一致する蛍光体を選択してください。

4. 新鮮な12ウェルプレートに湿潤チャンバーと場所からカバーガラスを外し、ウェルあたり1mlのPBSで3回洗浄する。

注意：なしデ場合ウイルスタンパク質の護は、望まれているカバースリップをマウントすることができ、このステップ（3.3に進みます）の後に結像する。

3。ウイルスタンパク質の発現を検出する免疫​​蛍光

1. 各ウェルにブロッキング緩衝液1ml（3％（w / v）のウシにおける血清アルブミン（BSA）をPBS）を加え、暗所で室温で30分間インキュベートする。
2. 湿度の高い室に、12ウェルプレートから転送をカバースリップを外し、50でカバー - バッファー（1:500）をブロックで希釈した一次抗体を100μl（抗RVFV博士RBテッシュからの親切な贈り物、UTMB）。暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。

注意：別のウイルスを使用するため、このプロトコルを適応する場合は、最初にあなたの一次抗体の最適な希釈を決定します。

注：あるいは、このステップは暗所で4℃でO / Nを行うことができる。

3. 12ウェルプレートに戻って湿潤チャンバーと場所からカバーガラスを取り外し、洗うウェルあたり1mlのPBSで3回。
4. 50と湿度の高い室とカバーに12ウェル場所、場所からカバースリップを削除 - 二次抗体を100μl（抗マウスIgG蛍光色素[励起/発光最大値：519分の495 nmの]に抱合）（1ブロッキング緩衝液で希釈した： 500）。暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。

注意：あなたの一次抗体を認識し、あなたの蛍光顕微鏡のフィルターに一致することができる二次抗体を選択してください。

注：必要に応じて、200 ngの/ mlのDAPIが核を可視化する二次抗体の希釈液に添加することができる。

5. バック12ウェルプレートに湿潤チャンバーと場所からカバーガラスを外し、ウェルあたり1mlのPBSで3回洗浄する。
6. 顕微鏡スライド上にFluoromount™を-Gの1滴（ 約 15μL）を配置することにより、カバースリップをマウントします。 H ₂ Oにカバースリップを浸し、目に触れることによって過剰H ₂ Oを除去Fluoromount™を-Gのドロップダウンにペーパータオル、と場所細胞側に対してE側。 5分間空気乾燥した。

注：倒立顕微鏡でイメージングする場合、Fluoromount™を-G 4で固化することができます°CO / Nや接辞カバースリップ顕微鏡スライドに透明マニキュアでエッジを密封することによって。

注：最大1週間のためにスライドがすぐにイメージしたり、暗闇の中で4℃で保存することができます。

4。データの取得

1. 蛍光顕微鏡を用いた画像。

注：ご使用の顕微鏡を用いて可視化することができ、適切な蛍光プローブを選択してください。参考までに、以下は、本書に示されている画像を取得するために使用される蛍光団とフィルターセットです。

DAPI：
励起フィルター：BP 330から385
二色鏡：DM 400
発光フィルター：LP 420

519分の495の励起/発光最大フルオロフォア：
励起フィルター：BP 460から490
二色鏡：DM 505
発光フィルター：LP 510

617分の590の励起/発光最大蛍光団：
励起フィルター：BP 545から580
二色鏡：DM 600
発光フィルター：LP 610

フローサイトメトリーによる転写の分析

5。 EUとのMP-12とラベル新生RNAと細胞に感染

1. 増殖培地（DMEM、10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン、100μg/mlの/ mlのストレプトマイシンを含む）中の6ウェル組織培養プレートに293細胞をシード。 100％コンフルエント- 37℃、5％CO ₂の細胞が80に達するまでの加湿インキュベーター中でインキュベートする。
2. MOI 3でMP-12で細胞を感染させる。少なくとも二つの感染していない井戸を含める：2つのウェルの一つは、他のステップでACTDで処理されますが、感染していないコントロールとして機能します5.4。増殖培地を取り出し、総容積は、各ウェルに添加するようにウイルスストックを希釈する400μlのです。 ℃、5％CO _2、37℃加湿インキュベーター中で1時間インキュベートする。
3. 接種を外し、ウェル当たり2ミリリットル新鮮な増殖培地を追加します。 12時間37℃でインキュベートする。

注：別のウイルスを使用するために、このプロトコルを適合させる場合は、ラベル付けと収穫するための最適な時点を決定するために経時変化実験を実行することが望ましい。感染時間がずれていると、すべてのサンプルを採取し、標識し、同時に染色することができるように、この時間経過を設定する。

4. 12 HPIでは、0.5mMのEUを含む培地で増殖培地を交換してください。モック感染井戸のいずれかに、また5μgの/ミリリットルACTDを追加します。 ACTDはDNA依存性RNA合成を阻害するので、これは、転写抑制のためのコントロールとして機能します。インキュベーターにセルを返します。
5. 13 HPIでは、ウィット一度細胞を洗浄細胞のトリプシン処理によって時間PBSと収穫。 PBSで1mMのEDTA（PBS-EDTA）を含むと回収した細胞を3回洗浄する。

注意：本製品と後続のステップの間に、500よりも速く、細胞を遠心分離しないでください- 1,000 XGをセルの破損を防ぐために。 1細胞を遠心分離 - 堆積物〜2分。

注意：表面の免疫染色がクリック反応後に計画されている場合は、代わりにゴム警官や使い捨てセルスクレーパーを使って収穫。

6. 室温で30分間、4％PFAとインキュベート1mlに、それらを再懸濁することにより細胞を固定。 4％PFAを準備する方法については、1.6の手順を参照してください。
7. ウェルあたり1mlのPBS-EDTAで一回洗ってください。ステップ6に進んですぐに。

注意：長時間のため、この段階で守ればRNAが退化としてそれは、すぐにクリック反応を進めることが重要です。同様に、時間cを実行した場合ourse実験では、ラベルに必ず、同時にすべてのサンプルを修正して染色。

6。標識RNAを検出する反応をクリック

1. PBS中の0.2％トリトンX-100 0.5mlに再懸濁することにより、細胞を透過性。室温で10分間インキュベートする。

注：ステップ6.1から6.3で使用されるすべてのソリューションは、ヌクレアーゼフリーのようにする必要があります。

注：細胞はこのステップ中沈渣正しくない場合は、5分まで遠心時間を増やします。沈降挙動は一度細胞はFACSバッファー（ステップ6.4）に懸濁している改善されます。

2. 1mlのPBSで一回洗浄します。

注：これはクリック反応のために必要なのCu ^{2 +イオン}をキレート化しますように、このステップでEDTAを使用しないでください。

3. 200μlのクリック染色液に再懸濁した細胞（100mMトリスpHは8.5、1 mMののCuSO _4、蛍光色素[EXCで標識された200nmのアジitation /発光極大：665分の650 nm]と、100mMのアスコルビン酸）。暗闇の中で室温で1時間インキュベートする。

注意：このステップの直前に新鮮クリック染色液を準備します。 1.5 MトリスpH8.5の100mMののCuSO _4、及び500mMのアスコルビン酸のストック溶液を4℃で保存することができるしかし、黄色になって、任意のアスコルビン酸原液を捨てる。

注：このステップの間に一緒に細胞の塊であれば、上下に数回ピペッティングして再懸濁します。

注意：お使いのフローサイトメトリーによって検出することができる蛍光体を選択してください。

注：以下もクリック染色手順に供されていない感染細胞のいずれかの試料を調製し、これらはフローサイトメータの校正に必要とされる。どちら感染細胞の半分を使用するか、ステップ5.2でうまく感染追加が含まれています。これらの詐欺制御の細胞は、ステップ7.1で免疫染色されます。

4. FACS緩衝液（PBS 1mMのEDTAおよび0.5％（w / v）のBSAを含む）で2回洗浄する。

注：ウイルスタンパク質のno免疫染色が望まれていない場合、細胞は（ステップ8に進み）、直ちに分析することができる。

7。ウイルスタンパク質の発現を検出する免疫​​蛍光

1. 再懸濁し、FACSバッファー（1:10,000）で希釈した一次抗体を200μlで細胞（抗RVFV）と暗所で室温で1時間インキュベートする。

注：あるいは、このステップは暗所で4℃でO / Nを行うことができる。

注：またクリック染色手順に供したが、免疫染色されず、これらはフローサイトメーターのキャリブレーションのために必要とされる非感染細胞の一つのサンプルを準備します。モック感染細胞の半分を使用するかでよく追加の感染を含むいずれかステップ5.2。

注意：別のウイルスを使用するため、このプロトコルを適応する場合は、最初にあなたの一次抗体の最適な希釈を決定します。

2. FACS緩衝液で細胞を2回洗浄します。
3. 二次抗体を200μlに再懸濁した細胞（抗マウスIgG蛍光色素に結合した[励起/発光最大値：519分の495 nm]で）FACSバッファー（1:1,000）で希釈し、暗所で室温で1時間インキュベートする。
4. FACS緩衝液で細胞を1回洗浄します。

注：この時点で、細胞を、暗所で4℃でO / Nを記憶することができる。

8。データの取得

1. 、500μlのFACS緩衝液中で細胞を再懸濁を5mlポリスチレンチューブに転送し、フローサイトメーターを用いて分析する。計器を校正するためにMP-12に感染した細胞（無クリック反応、抗RVFV染色のみ）とモック感染細胞を（のみ反応をクリックします）を使用します。

しないE：あなたの楽器によって検出することができる適切な蛍光プローブを選択してください。参考までに、以下は、本書に示されたデータを取得するために使用されるレーザーラインと設定フィルタです。

519分の495の励起/発光スペクトルと蛍光団：
レーザー：488nmの
フィルタ：30分の530

665分の650の励起/発光スペクトルと蛍光団：
レーザー：640 nmの
フィルタ：20分の670

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結果

P62のプロテアソームによる分解を促進することにより隔離することでは、（i）基本転写因子TFIIH ¹¹と、（ii）のP44サブユニット：RVFVのNSsのタンパク質は、（ ブニヤウイルス科 、属フレボ ^）11は、2つの異なるメカニズムを通じて宿主細胞一般的な転写を阻害TFIIH ⁶のサブユニット。 MP-12株は、生物学的安全性レベル2実験室で処理することができ、他の野?...

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ディスカッション

提供されたプロトコールは、新生RNAへウリジンアナログEUの取り込みを介して宿主細胞の転写に対するウイルス感染の影響を測定するための方法が記載されている。それは、高速で敏感であり、それは、放射性同位元素の使用に依存しない：この方法は、従来の方法に比べていくつかの利点を有する。さらに、この方法は、蛍光顕微鏡又は本質的に同じ試薬を用いてフローサイトメトリーを?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips	Fisherbrand	12-545-82
5 ml polystyrene tubes	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI	Sigma	D-9542	dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)	Invitrogen	A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	dissolve in H2O for 500 mM
paper filter	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Fluorescence Microscope			e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer			e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa