JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод описывает использование мыши химии для измерения изменений в принимающих транскрипции клетки после заражения лихорадкой Рифт-Валли Вирус (RVFV) штамма MP-12. Результаты могут быть визуализированы качественно с помощью флуоресцентной микроскопии или получают с количественным выходом путем проточной цитометрии. Этот способ можно приспособить для использования с другими вирусами.

Аннотация

Многие вирусы РНК эволюционировали способность ингибировать транскрипцию клетку-хозяина, как средство, чтобы обойти сотовой оборону. Для изучения этих вирусов, поэтому важно, чтобы иметь быстрый и надежный способ измерения транскрипционной активности в инфицированных клетках. Традиционно транскрипции был измерен либо по включению радиоактивной нуклеозиды, такие как 3 H-уридина с последующим детектированием с помощью авторадиографии или сцинтилляционного счетчика или включение галогенированные аналоги уридина, такие как 5-bromouridine (BRU) с последующим детектированием с помощью иммунной окраски. Использование радиоактивных изотопов, однако, требует специального оборудования и не представляется возможным в ряде лабораторных условиях, в то время обнаружения BRU может быть громоздкими и могут страдать от низкой чувствительности.

Недавно разработанный мыши химии, который включает в себя медь катализируемой триазола образование из азида и алкина, теперь обеспечивает быстрое и Highlу чувствительных альтернативы этих двух методов. Нажмите химии является двухстадийным процессом, в котором возникающий РНК первый помечены путем включения уридина аналоговый 5-ethynyluridine (ЕС), с последующим детектированием этикетку с флуоресцентным азидом. Эти азиды доступны в нескольких различных флуорофоров, что обеспечивает широкий спектр возможностей для визуализации.

Этот протокол описывает метод измерения транскрипционные подавления в клетках, инфицированных лихорадкой Рифт-Валли Вирус (RVFV) штамма MP-12 с использованием клик химии. Одновременно экспрессии вирусных белков в этих клетках определяется классической внутриклеточный иммунной окраски. Шаги с 1 по 4 подробно метод визуализации транскрипционный подавление с помощью флуоресцентной микроскопии, а шаги с 5 по 8 подробно метод количественного транскрипционный подавление с помощью проточной цитометрии. Этот протокол может быть легко адаптирован для использования с другими вирусами.

Введение

Традиционно транскрипционную активность была измерена посредством включения или радиоактивный (3 H-уридина) один или галогенированных (BRU) 2 нуклеозидов в возникающий РНК. Эти аналоги уридина принимаются к клеткам, превращается в уридин-трифосфата (UTP) через нуклеозидов путь спасения, и впоследствии включено во вновь синтезированную РНК. 3 H-уридина может быть обнаружен с помощью авторадиографии, которые могут быть трудоемким или сцинтилляционного считая, что требует специального оборудования. Кроме того, использование радиоактивных изотопов не может быть практически в ряде лабораторных условиях, в том числе высокой сдерживания биобезопасности лабораторий. BRU могут быть обнаружены с помощью иммунных анти-BRU антител, которые могут потребовать суровых проницаемости для обеспечения доступа антитела к ядру или частичной денатурации РНК, а вторичной структуры РНК может быть стерических затруднений для связывания антител.

_content "> протокол, описанный здесь использует недавно разработанные нажмите химии 3 для измерения транскрипционной активности в клетках, инфицированных штаммом RVFV MP-12. Нажмите химии опирается на высокой селективностью и эффективное меди (I), катализируемой реакции циклоприсоединения между алкина и азид фрагмент 4,5. В этом протоколе, возникающий РНК в инфицированных клетках сначала помечены посредством включения уридина аналоговый ЕС. На втором этапе, объединенный ЕС обнаружены с помощью реакции с флуоресцентным азидом. Основным преимуществом этого метода являются (1), что она не требует использования радиоактивных изотопов и (2) что он не требует суровых проницаемости или денатурации РНК. с молекулярной массой менее 50 Da, доступ флуоресцентного азида не мешают недостаточный проницаемости или вторичной структуры РНК. Кроме того, исследователи не ограничены в своем выборе первичных антител при объединении обнаружения РНК с классомческих иммуноокрашивания для вирусных белков.

Две различные методы описаны в данном протоколе: один для визуализации с помощью транскрипции флуоресцентной микроскопии (шаги 1-4) и один для количественного транскрипция проточной цитометрии (шаги 5-8). Оба этих метода сочетают маркировки растущих РНК с внутриклеточным иммуногистохимическое вирусных белков, что обеспечивает корреляцию между транскрипционной активности и вирусной инфекции на ячейку за ячейкой основе.

Авторы успешно использовали протокол, описанный здесь, чтобы определить транскрипционной активности в клетках, инфицированных штаммом RVFV MP-12 6 клеток, инфицированных различными MP-12 мутанты 7,8, 9 и клетки, инфицированные вирусом Toscana (TOSV) 10. Протокол, описанный здесь, может быть легко адаптирован для использования с различными вирусами и имеет потенциал, чтобы быть модифицирован, чтобы включать иммунофлуоресценции окрашивание специфических вирусных или клеточных белков.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Анализ транскрипции с помощью флуоресцентной микроскопии

1. Инфицировать клетки с MP-12 находятся в стадии становления и этикетка РНК с ЕС

  1. Место 12-мм выстрел покровные в 12-луночных планшета для культуры ткани, один покровное на лунку.

Примечание: Если клетки имеют проблемы придерживаясь покровные, пальто с поли-L-лизин (М ≥ 70000) перед устанавливать в скважинах. С этой целью погрузить покровные в стерильном 0,1 мг / мл раствора в H 2 O, поли-L-лизин в течение 5 мин. Промыть покровные стерильной H 2 O и воздушно-сухой в течение не менее 2 часов.

  1. Для семян 293 клеток на покровных стеклах, добавляют 5 × 10 4 клеток в 1 мл ростовой среды (DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) на лунку. Инкубируют в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2 O / N.
  2. Infect клеток с MP-12 при множественности инфекции (MOI) 3. Включать не менее двух неинфицированных скважин: одна из двух скважин будет служить неинфицированных управления, другие будут относиться с актиномицином D (ActD) на шаге 1.5 в качестве контроля для транскрипционных подавления. Удалить ростовой среде и разбавить вирус штока так, что общий объем в каждую лунку добавляли 200 мл. Инкубировать в течение 1 часа во влажном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.

Примечание: Вместо того, чтобы инфицировать клетки, клетки могут быть трансфицированы ДНК плазмиды или в пробирке синтезированных РНК, кодирующей специфический вирусный белок. С этой целью трансфекции клеток с соответствующим реагентом трансфекции химические в соответствии с инструкциями производителя и перейти к этапу 1,5 при 16 часов после трансфекции. Желательно, чтобы оптимизировать трансфекции условий и времени инкубации до РНК маркировки и фиксации.

  1. Удалить посевной и добавить 1 мл свежей питательной среды на лунку. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 час.
ove_content "> Примечание. Если адаптация этот протокол для использования с другим вирусом, то целесообразно выполнить эксперимент время курса для определения оптимального момента времени для РНК маркировки и фиксации Установка этого времени ход, так что инфекция раз в шахматном порядке, и все Образцы могут быть помечены, фиксировали и окрашивали в то же время.

  1. В 15 ч после инфекции (HPI), замените питательную среду средой, содержащей 1 мМ ЕС. К одному из макета инфицированных скважин, а также добавить 5 мкг / мл ActD. Это будет служить контроль за транскрипционные подавления, как ActD ингибирует ДНК-зависимой РНК. Возврат клеток в инкубаторе.
  2. В 16 HPI, удалите средних и мыть покровные один раз 1 мл PBS (KCl 0,20 г / л, KH 2 PO 4 0,20 г / л, NaCl 8,00 г / л, Na 2 НРО 4 1,15 г / л, рН 7,4) на лунку. Fix клетки добавлением 1 мл 4% параформальдегида (PFA) на лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.

Примечание: Чтобы подготовить 4% PFA в фиксирующем растворе, растворите 10 г параформальдегида в 150 мл H 2 O нагревают до 60 ° С на нагретой магнитной мешалкой. Добавить 500 мкл 1 М NaOH и продолжаем движение, пока раствор не станет ясно. Фильтр PFA раствора через бумажный фильтр для удаления частиц и добавляют 62,5 мл фосфатного буфера (77 мМ NaH 2 PO 4, 287 мМ Na 2 HPO 4, рН 7,4). Добавить H 2 O до общего объема 250 мл. Замораживание при -20 ° С в одноразовых аликвоты.

  1. Мыть один раз с 1 мл PBS на лунку. Нет времени инкубации не требуется для этого и всех последующих этапов стирки. Немедленно приступить к шагу 2.

Примечание: Важно, чтобы немедленно перейти с щелчком реакции, РНК вырождается при хранении на этой стадии в течение длительных периодов времени; потерю сигнала флуоресценции РНК уже можно наблюдать, если клетки выдерживали в течение 1 ч при 4 ° C . Аналогичным образом, если вобразуя время эксперимента конечно, не забудьте этикетке, исправить, и пятна все образцы в то же время.

2. Нажмите Реакция на обнаружение меченой РНК

  1. Проницаемыми клеток путем добавления 1 мл 0,2% Тритон Х-100 в PBS. Инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.

Примечание: Все растворы, используемые с шагом 2,1 до 2,3 должны быть нуклеаз.

  1. Мытье три раза с помощью 1 мл PBS на лунку.
  2. Удалить покровные с 12 лунками и передачи в влажной камере. Обложка каждого покровное с 50 - 100 мкл раствора окрашивания клик (100 мМ Трис рН 8,5, 1 мМ CuSO 4, 20 мкМ флуоресцентного азид [возбуждения / испускания максимальная: 590/617 нм], 100 мМ аскорбиновой кислоты) каждый. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Примечание: Чтобы собрать влажной камере, линия нижней части клеточной культуре или чашки Петри с диаметром 10 см с пластиковой пленкой парафина. Линия внутренней кромки диSH с влажными бумажными полотенцами. Поместите покровные на пластиковой пленкой парафина.

Примечание: Будьте осторожны, чтобы не позволить покровные высохнуть в течение этой или любой другой шаг в протоколе. Лучше всего, чтобы добавить окрашивание раствора в каждую покровным непосредственно после того, как он был помещен во влажной камере.

Обратите внимание: Подготовьте решение кнопкой окрашивания свежей непосредственно перед этим шагом. Маточные растворы 1,5 М трис, рН 8,5, 100 мМ CuSO 4 и 500 мМ аскорбиновой кислоты можно хранить при температуре 4 ° С. Тем не менее, отказаться от любой акции раствора аскорбиновой кислоты, которая превратила желтый.

Примечание: убедитесь, что выбран флуорофором, который соответствует фильтрам на вашем флуоресцентного микроскопа.

  1. Удалить из покровных влажной камере и место в свежем 12-луночный планшет и вымыть три раза с 1 мл PBS на лунку.

Примечание: Если не де-защиты вирусных белков желательно, покровные может быть установлен и отображаемого после этого шага (перейти к этапу 3.3).

3. Иммунофлуоресценция для выявления экспрессии вирусных белков

  1. Добавляют 1 мл блокирующего буфера (3% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS) в каждую лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
  2. Удалить покровные с 12-луночный планшет, перевод на влажной камере и покрытие с 50 - 100 мкл первичного антитела (анти-RVFV, своего рода подарком д-ра RB Tesh, UTMB), разведенного в блокирующем буфере (1:500). Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Примечание: При этом адаптация протоколов для использования с различными вирус, определить оптимальный для вашего разбавления первичных антител в первую очередь.

Примечание: В качестве альтернативы, этот шаг может быть выполнен O / N при 4 ° С в темноте.

  1. Удалить из покровных влажной камере и место обратно в 12-луночный планшет и мытьтри раза с помощью 1 мл PBS на лунку.
  2. Удалить покровные с 12-и места, места в влажной камере и накрыть 50 - 100 мкл вторичными антителами (анти-IgG мыши конъюгированные с флуоресцентным красителем [возбуждения / испускания максимальная: 495/519 нм]), разведенного в блокирующем буфере (1: 500). Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Примечание: убедитесь, что выбран вторичные антитела, способные распознавать ваши первичного антитела и соответствует фильтрам на вашем флуоресцентного микроскопа.

Примечание: При желании, 200 нг / мл DAPI может быть добавлен к вторичным антителом разбавления для визуализации ядер.

  1. Удалить из покровных влажной камере и место обратно в 12-луночный планшет и вымыть три раза с 1 мл PBS на лунку.
  2. Установите покровные, поместив одну каплю (Калифорния. 15 мкл) Fluoromount-G на предметное стекло микроскопа. Погрузите в покровного H 2 O, удалить избыток H 2 O, касаясь йE Боковое против бумажным полотенцем и поместить камеру стороной вниз в каплю Fluoromount-G. Воздух сухой в течение 5 мин.

Примечание: Если изображение на инвертированный микроскоп, позволит Fluoromount-G затвердевать при 4 ° CO / N или прикрепить к покровные стекло микроскопа путем герметизации края с прозрачным лаком для ногтей.

Примечание: Слайды могут быть отображены немедленно или хранят при 4 ° С в темноте в течение до недели.

4. Приобретение данных

  1. Изображение с использованием флуоресцентного микроскопа.

Примечание: Не забудьте выбрать соответствующие флуорофорам которые могут быть визуализированы с помощью микроскопа. Для справки, являются следующие флуорофорам и наборы фильтров используется для получения изображения показаны в настоящей публикации.

DAPI:
Фильтр возбуждения: BP 330 - 385
Двухцветные зеркала: DM 400
Эмиссионный фильтр: LP 420

флуорофора с возбуждением / максимум эмиссии 495/519:
Фильтр возбуждения: BP 460 - 490
Двухцветные зеркала: DM 505
Эмиссионный фильтр: LP 510

Флуорофора с возбуждением / максимум эмиссии 590/617:
Фильтр возбуждения: BP 545 - 580
Двухцветные зеркала: DM 600
Эмиссионный фильтр: LP 610

Анализ транскрипции с помощью проточной цитометрии

5. Инфицировать клетки с MP-12 находятся в стадии становления и этикетка РНК с ЕС

  1. Семенной 293 клеток в 6-луночный культуральный планшет ткани в питательной среде (DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина). Инкубируют в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2, пока клетки не достигли 80 - 100% сплошности.
  2. Инфицировать клетки с MP-12 в МВД 3. Включите по крайней мере два неинфицированных скважин: одна из двух скважин будет служить в качестве неинфицированных управления, другие будут относиться с ActD на шаге5.4. Удалить ростовой среде и разбавить вирус штока так, что общий объем в каждую лунку добавляли 400 мкл. Инкубировать в течение 1 часа во влажном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
  3. Удалить посевной и добавить 2 мл свежей питательной среды на лунку. Инкубировать при 37 ° С в течение 12 час.

Примечание: Если этот протокол адаптации для использования с другим вирусом, рекомендуется выполнять время эксперимента курс для определения оптимального момента времени для маркировки и сбора урожая. Установка этого времени ход, так что инфекция раз в шахматном порядке, и все образцы могут быть помечены, собирали и окрашивали в то же время.

  1. В 12 HPI, замените ростовой среды на среду, содержащую 0,5 мМ ЕС. К одному из макета инфицированных скважин, а также добавить 5 мкг / мл ActD. Это будет служить контроль за транскрипционные подавления, как ActD ингибирует ДНК-зависимой РНК. Возврат клеток в инкубаторе.
  2. В 13 HPI, мыть клетки один раз остроумиемч PBS и урожай обработкой трипсином клетки. Мытье собранные клетки три раза PBS, содержащем 1 мМ EDTA (PBS-EDTA).

Примечание: В этой и последующих шагах, не центрифуги клетки быстрее, чем 500 - 1000 мкг, чтобы предотвратить клетки поломки. Центрифуга клетки в течение 1 - 2 мин до осадка.

Примечание: Если поверхность иммуноокрашивания планируется после щелчка реакции, урожай помощью полицейского резиновые или одноразовые скребком ячейки вместо этого.

  1. Fix клетки путем ресуспендирования их в 1 мл 4% PFA и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Обратитесь к шагу 1.6 Инструкции о том, как подготовить 4% PFA.
  2. Промывают один раз 1 мл PBS-EDTA на лунку. Немедленно приступить к шагу 6.

Примечание: Важно, чтобы немедленно перейти с щелчком реакции, РНК вырождается при хранении на этой стадии в течение длительных периодов времени. Аналогичным образом, если выполнение временной СМедведица эксперимент, обязательно маркировать, исправить и запятнал все образцы в то же время.

6. Нажмите Реакция на обнаружение меченой РНК

  1. Проницаемыми клетки путем ресуспендирования в 0,5 мл 0,2% Тритон Х-100 в PBS. Инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.

Примечание: Все растворы, используемые с шагом 6,1 до 6,3 должны быть нуклеаз.

Примечание: если клетки не должным образом осадок на этом этапе, увеличивают время центрифугирования до 5 мин. Осаждение улучшится как только клетки суспендируют в FACS буфере (шаг 6.4).

  1. Мыть один раз с 1 мл PBS.

Примечание: Не использовать ЭДТА на этом этапе, так как это хелат Cu 2 + ионы необходимы для мыши реакции.

  1. Ресуспендируют клеток в 200 мкл красящий раствор клик (100 мМ Трис рН 8,5, 1 мМ CuSO 4, 200 нМ азид помечены флуоресцентным красителем [отлканализационным / максимум излучения: 650/665 нм], 100 мМ аскорбиновой кислоты). Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Обратите внимание: Подготовьте решение кнопкой окрашивания свежей непосредственно перед этим шагом. Маточные растворы 1,5 М трис, рН 8,5, 100 мМ CuSO 4 и 500 мМ аскорбиновой кислоты можно хранить при температуре 4 ° С. Тем не менее, отказаться от любой акции раствора аскорбиновой кислоты, которая превратила желтый.

Примечание: Если клетки слипаются во время этого шага, ресуспендируйте с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.

Примечание: убедитесь, что выбран флуорофором, которые могут быть обнаружены с помощью вашего проточной цитометрии.

Примечание: Также подготовить один образец инфицированных клеток, которые не подвергались процедуре окрашивания мыши, эти будут необходимы для калибровки проточного цитометра. Либо использовать половины инфицированных клеток или включить дополнительный инфицированы также на шаге 5.2. Эти конуправления клетки будут иммуноокрашиванию на шаге 7.1.

  1. Мытье дважды FACS-буфером (PBS, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,5% (вес / объем) БСА).

Примечание: Если иммунной вирусных белков не требуется, клетки могут быть проанализированы немедленно (перейти к шагу 8).

7. Иммунофлуоресценция для выявления экспрессии вирусных белков

  1. Ресуспендируют клеток в 200 мкл первичного антитела (анти-RVFV), разведенного в FACS буфере (1:10000) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Примечание: В качестве альтернативы, этот шаг может быть выполнен O / N при 4 ° С в темноте.

Примечание: Также подготовить один образец неинфицированных клетках, которые были подвергнуты процедуре окрашивания мыши, но не будет иммуноокрашиванию, они будут необходимы для калибровки проточного цитометра. Либо использовать половину макет инфицированные клетки или включать дополнительные скважины на неинфицированныхШаг 5.2.

Примечание: При этом адаптация протоколов для использования с различными вирус, определить оптимальный для вашего разбавления первичных антител в первую очередь.

  1. Вымойте клетки дважды в буфере FACS.
  2. Ресуспендируют клеток в 200 мкл вторичного антитела (анти-мышь IgG, конъюгированные с флуоресцентным красителем [возбуждение / максимума излучения: 495/519 нм]), разведенного в FACS буфере (1:1000) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
  3. Вымойте клетки раз в буфере FACS.

Примечание: В этой точке клетки могут храниться O / N при 4 ° С в темноте.

8. Приобретение данных

  1. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера FACS, передача в 5 мл пробирки полистирола и анализировать с использованием проточного цитометра. Используйте MP-12 инфицированных клетках (без щелчка реакции, анти-RVFV окрашивание только) и макет инфицированных клеток (нажмите реакцию только) для калибровки прибора.

НеE: Не забудьте выбрать соответствующую флуорофорам, которые могут быть обнаружены с помощью вашего инструмента. Для справки, являются следующие лазерных линий и наборы фильтров используется для получения данных, приведенных в этой публикации.

Флуорофора с возбуждением / спектра излучения 495/519:
Лазер: 488 нм
Фильтр: 530/30

Флуорофора с возбуждением / спектра излучения 650/665:
Лазер: 640 нм
Фильтр: 670/20

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

АПЛ белка RVFV (Bunyaviridae семьи, род Phlebovirus) 11 ингибирует клетки-хозяина общей транскрипции с помощью двух различных механизмов: (I) за счет связывания p44 субъединицы базального транскрипционного фактора TFIIH 11 и (II) путем содействия протеосомную деградации p62 субъединицы T...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Предоставляется протокол описывает метод для оценки влияния вирусной инфекции на хост транскрипции клетки через включение уридином аналоговых ЕС в зарождающейся РНК. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с предыдущими способами: это быстрый, чувствительный, и он не опирается...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим RB Tesh за предоставление мыши поликлональных анти-RVFV антисыворотки и М. Гриффин UTMB проточной цитометрии средство сердечника за помощью проточной цитометрии. Эта работа была поддержана на 5 U54 AI057156 через западный региональный центр повышения квалификации, грант NIH R01 AI08764301, и финансирование из Сили Центра разработки вакцин на UTMB.BK была поддержана Джеймс У. Маклафлин Фонд стипендий на UTMB.OL была поддержана на Мориса Р. Hilleman на ранних этапах карьеры Награды Исследователя.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5-ethynyl-uridineBerry AssociatesPY 7563dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslipsFisherbrand12-545-82
5 ml polystyrene tubesBD Biosciences352058
Actinomycin D (ActD)Sigma9415dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgGInvitrogenA-11029
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruzsc-2323
CuSO4SigmaC-8027dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI SigmaD-9542dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM Invitrogen11965092
FBSInvitrogen16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)InvitrogenA10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)InvitrogenA10277
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01
L-ascorbic acidSigmaA-5960dissolve in H2O for 500 mM
paper filterVWRbrand28333-087
paraformaldehyde Sigma158127
Penicillin-StreptomycinInvitrogen15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)SigmaP1274
Triton X-100SigmaT-8787
Trizma baseSigmaT-1503dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTAInvitrogen25200056
Fluorescence Microscopee.g. Olympus IX71
Flow Cytometere.g. BD Biosciences LSRII Fortessa

Ссылки

  1. Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
  2. Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine labelling and bromodeoxyuridine antibodies. Cytometry. 14, 455-458 (1993).
  3. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 15779-15784 (2008).
  4. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  5. Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
  6. Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs protein of rift valley fever virus promotes posttranslational downregulation of the TFIIH subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
  7. Kalveram, B., et al. Rift Valley fever virus NSs inhibits host transcription independently of the degradation of dsRNA-dependent protein kinase PKR. Virology. , (2012).
  8. Head, J. A., Kalveram, B., Ikegami, T. Functional analysis of Rift Valley fever virus NSs encoding a partial truncation. PLoS One. 7, e45730(2012).
  9. Lihoradova, O. A., et al. Characterization of Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain Encoding NSs of Punta Toro Virus or Sandfly Fever Sicilian Virus. PLoS Negl Trop Dis. 7, e2181(2013).
  10. Kalveram, B., Ikegami, T. Toscana Virus NSs Protein Promotes Degradation of Double-Stranded RNA-Dependent Protein Kinase. J. Virol. , (2013).
  11. Schmaljohn, C., Nichol, S. In Fields Virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams and Wilkins. 1741-1789 (2007).
  12. Le May, N., et al. TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
  13. Caplen, H., Peters, C. J., Bishop, D. H. Mutagen-directed attenuation of Rift Valley fever virus as a method for vaccine development. J. Gen. Virol. 66, 2271-2277 (1985).
  14. Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious Rift Valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
  15. Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of viral RNA by fluorescence in situ hybridization (FISH). J. Vis. Exp. , e4002(2012).
  16. Reich, E., Goldberg, I. H. Actinomycin and nucleic acid function. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 3, 183-234 (1964).
  17. Holmes, K. L., Lantz, L. M., Russ, W. Conjugation of fluorochromes to monoclonal antibodies. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 4 (Unit 4 2), (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

78BunyaviridaeMP 12

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены