方法对NF-κB依赖的成年神经发生的调制与分析

摘要

方法的NF-κB依赖型成年海马神经发生的操作和分析的描述。详细的协议提出了一个齿状回依赖性行为测试（称为空间格局分离巴恩斯迷宫）的认知结果小鼠的调查。这项技术也将有助于使在其他实验设置的调查。

摘要

海马起着举足轻重的作用，在情节记忆的形成和巩固，并在空间定位。从历史上看，成年海马一直被看作是哺乳动物大脑的一个非常静态的解剖区域。然而，最近的研究结果已经表明，在海马的齿状回是巨大的可塑性在成人的区域，不仅包括修改现有的神经元回路的，但也成年神经发生。此可塑性被复杂的转录调控网络，其中，所述转录因子NF-κB中起着突出的作用。研究和操纵成年神经发生，转基因小鼠模型的NF-κB活性的前脑特异性神经元的抑制可以使用。

在这项研究中，方法是用于对NF-κB依赖的神经发生的分析，包括其结构方面，神经元凋亡和祖细胞的增殖和认知意义，whic描述h的通过齿状回（DG）相关的行为测试，空间格局分离 - 巴恩斯迷宫（SPS-BM）的特别评估。在SPS-BM协议可以简单地适用于与设计，以评估特定基因对成年海马神经发生的影响等转基因动物模型的使用。此外，SPS-BM可以在其他实验设置旨在调查和处理DG-依赖的学习，例如，使用药剂使用。

引言

本体论上，海马是已知的最古老的大脑解剖结构之一。它负责不同的复杂的任务，如在长期记忆，空间定位，并形成各自的存储器中，并固结的调节枢转功能。在解剖学上，海马由锥体细胞层（ 层锥体 ）包括大角Ammonis（CA1，CA2，CA3，CA4和）区和齿状回（ 齿状回 ），其中包含的颗粒细胞和一些神经祖细胞内的颗粒下层区。的颗粒细胞经所谓苔藓纤维（颗粒细胞的轴突）突出朝向CA3区。

直到最后世纪末，成年哺乳动物大脑被认为是静态的器官缺乏细胞可塑性和神经发生。然而，在过去的二十年中，越来越多的证据量清楚地表明了成年神经发生在至少2脑区，脑室下区（SVZ）和海马的颗粒下层区域。

我们以前的研究，并与其他团体，都表明，转录因子NF-κB的是成年神经发生的关键分子调节剂之一，其放松管制导致严重的结构缺陷，海马和认知障碍^1-6。 NF-κB是五DNA结合亚基二聚体的不同组合组成的诱导转录因子的通用名称：P50，P52，C-REL，RelB基因和P65（的RelA），后三家的反式激活域。于大脑，在细胞质中发现的最丰富的形式是P50和P65，这是由卡巴B（IκB）蛋白的抑制剂保持在非活性形式的异源二聚体。

学习和直接操纵的NF-κB驱动的神经，我们用转基因小鼠模型，以使所有的NF-κBsubun的简单的抑制作用它的，特别是在脑^7（ 见图1）。为了这个目的，我们杂交以下转基因小鼠系，IκB/ - 和-/tTA。采用NF-κB抑制剂IκBa（超阻遏IκBa-AA1）的反式显性负突变体产生的⁸号线-转基因IκB/。相反，野生型IκBα，IκBα-AA1具有两个丝氨酸残基突变为丙氨酸（V32和V36），这阻碍了该抑制剂的磷酸化和随后的蛋白酶体降解。对IκBa-AA1-转基因的前脑神经元特异性表达，IκB/ - 小鼠杂交小鼠窝藏钙 - 钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα（CAMKIIα）的启动子，可以通过四环素反式激活物（TTA）被驱动^9。

P65基因敲除小鼠的胚胎致死表型，由于大量肝细胞凋亡^10，所以这里显示的方法提供了一个优雅的方法为调查的NF-κB在产后和成年神经的作用。

经典的行为学测试，以空间学习和记忆研究20世纪80年代由理查德·莫里斯，测试被称为Morris水迷宫^（MWM）11被描述。在这个开放的场水迷宫，动物学会从不透明水中逃脱到基于方向和额外迷宫的线索隐藏的平台。 MWM的干变体是所谓的巴恩斯迷宫^{（BM）12。}本次测试采用了圆形板布置在板的边缘20圆孔，用一个定义孔作为转义框，视觉多余的迷宫线索方向。这两种实验范式依靠飞行行为引起的啮齿动物单曲厌恶水，或打开，明亮的照明空间。这两项测试让空间方位的调查，以及相关的内存性能。虽然海马起着空间记忆形成的一般和重要作用，海马Ř参与egions不同，根据不同的应用测试。在BM测试的内存源于enthorinal皮层（EC）和位于海马CA1区域无危险品^13-16的贡献锥体神经元之间的神经元活动。特别是，经典的BM主要是通过突触颞ammonic途径从欧盟三CA1至欧盟五，重要的是，DG关键是参与所谓的空间模式识别^17，这意味着不仅是处理依赖于导航视觉和空间信息，但也差不多陈述或记忆转化为不同的，不重叠的陈述。这个任务需要的功能的三突触回路从欧盟二DG可以CA3到CA1和EC六，不能在BM ¹⁵进行测试。

为应对这些挑战，我们设计了一套SPS-BM作为一个行为测试，具体测试齿状回依赖的认知表现在合作ntrol动物，并在IκB/ tTA的超阻抑物模型下的NF-κB的抑制。重要的是，与此相反的MWM或骨髓，在SPS-BM可以揭示从神经发生减值产生微妙的行为缺陷。因为空间图案分离是严格依赖于EC II和DG和CA3和CA1和EC VI之间的功能性电路，该测试是内中的神经发生电位变化，苔藓纤维通路的修改或组织稳态的变化高度敏感DG。

技术上，设定了我们的试验是基于研究Clelland 等，其中的空间间隔图案是用一个木制的8臂旋臂迷宫^（RAM）19进行测试。在我们修改设置，八臂，7个相同的黄色食物房屋所取代。总之，这里显示的方法，包括doublecortin表达（DCX +）海马，苔藓纤维突起，神经元细胞内德细胞分析ATH特别是SPS-BM这里提出，可应用到的结合具有在成年神经发生的影响的转基因其他小鼠模型的研究。进一步的应用可能包括药物制剂的研究和测量它们对DG和空间格局分离的影响。

研究方案

伦理声明

这项研究进行了严格按照政府的动物和保健使用委员会，国家北莱茵 - 威斯特法伦州，（德国杜塞尔多夫）的LANUV的规定。所有的动物实验已根据许可证号8.87-51.04.20.09.317（LANUV，NRW）批准LANUV，杜塞尔多夫。所做的一切努力，尽量减少痛苦和需要研究的动物的数量。

1。动物护理及房屋

1. 在本文描述的协议中使用的所有动物应保持无特定病原体的条件下，由联邦欧洲实验动物科学协会（FELASA）所定义的。
2. 小鼠应保持在标准笼在温度和湿度控制（22℃）室温条件下昼夜（12小时亮/暗周期）根据与HEPA过滤空气。
3. 标准化的食物和水应提供自由采食 。
4. 如果IκB/ tTA的和IκB/ -对照小鼠被使用时，对每个动物应该进行基于PCR的基因分型，如^7,18说明。
5. 雄性动物具有小于四天年龄差异应该被使用，以减少个体差异。
6. （可选）：对于NF-κB的激活实验，多西环素，必须在饮用水管理（2毫克/毫升与2.5％蔗糖）至少14天。

2。空间格局分离 - 巴恩斯迷宫（SPS-BM）

1. 所有的行为测试应根据国际和当地的指引进行。
2. 重要！只使用雄性小鼠为六个月或以上的年龄。一个测试系列的动物之间的年龄差应不超过四天。测试必须由同一运营商为每个系列中进行。老鼠应该得到一个标准的饮食前测试，以进一步提高部分被作为驱动动力weet食物奖励。
3. 成立了一个白色的圆板由硬塑料制成（直径120mm厘米， 见图5A）在湿度和温度控制室内（22℃），照明用至少4×80 W和3×215 W霓虹灯荧光灯。重要！确保正确的照明使用，因为老鼠的动机进入食品屋部分由自己情绪的推动，以明亮，暴露的地方。
4. 设置在视频跟踪系统。相机应放在115厘米上面的板的中心（参见图5A）。
5. 附上五彩额外迷宫线索（EMC），以白色色布中的动物，从板的边缘大约100公分（ 见图5A）容易看见的位置。
6. 仔细清洁板具有快速消毒剂，可以从实验装置中移除任何气味。
7. 将7相同的黄色食物业（12厘米×7厘米×8厘米， 见图5A ）的白色车牌。该位置应明确标记（ 见图5A）。
8. 将甜的食物颗粒奖励（一季度的Kellogs单曲Froot循环/食品屋）上定义的位置所有的食物里面的房子（ 见图5A），只有一个定义的粮食房子是可以自由进出的动物（地点楼参见图5A ）。关闭非靶食品与房屋透明薄膜。
9. 试验前，进行习惯（一天开始任务之前）。使所有食品的房子可以自由进出，让小鼠自由探索迷宫和检索的食物颗粒奖励（10分钟/动物）。
10. 切换电脑和相机并启动视频跟踪系统的软件。
11. 开始录制。
12. 将动物在圆形板所定义的起点（ 图5A，S：起始位置），让老鼠来搜索目标食品的房子10分钟。
13. 申通快递P上的视频跟踪。
14. 重要！每次试验与快速消毒后清洁圆板和食品的房子。
15. 每天重复这些试验连续七天（每个动物）。
16. 使用适当的统计软件分析结果（延迟，覆盖距离和错误）。定义错误，接近了错误的食物及/或不输入和检索的食物颗粒奖励与适当的盒子接触。对于分组分析中使用双因素方差分析和Bonferroni事后检验。
17. （可选）牺牲小鼠并分析如下所述的海马。

3。 BrdU标记

1. 每天一次腹膜内注射50毫克/千克IP的BrdU 3天（微分和积分的分析）或200毫克/公斤的ip为单次注射（增殖的分析）。
2. 牺牲动物，解剖海马和下述准备40微米的部分。
3. Denaturate的用2M HCl中10分钟的部分和孵育在10分钟的0.1M硼酸盐缓冲液。
4. 标注一在12系列从每个动物免疫组织化学40μm的切片（240微米外），如下所述使用针对的BrdU抗体。
5. 通过共聚焦显微镜分析量化整个颗粒细胞层和颗粒下层区域的rostrocaudal程度的标记的细胞。乘以12所得的数目由两个获得每海马和除法的BrdU标记细胞的估计总数量，就得到每个危险品标记细胞的总数量。

4。去除大脑和冷冻切片的制备由未注动物

1. 请遵守当地批准的程序实施安乐死的动物。小鼠可直接安乐死颈椎脱位。
2. （可选）可动物安乐死之前，根据当地和国际准则进行麻醉， 如腹腔麟蹄CTION为0.8 mL圣阿韦坦的33克鼠标（通过混合150与1.85毫升生理盐水或生理缓冲液由2.2毫克2,2,2 - 三溴乙醇1毫升乙醇异戊酯毫升原液新鲜的）。
3. 消毒的头部与聚维酮碘（10％聚维酮碘）浸泡过的纱布和棉签随后用纱布浸泡在70％乙醇中。
4. 采用合适的手术剪刀斩首动物和拉扯皮肤一边。
5. （可选）固定器可应用于避免折返迟钝的皮肤。
6. 做中线切口在颅骨小心地将头骨碎片放在一边。
7. 小心使用适当的手术器械（ 如莫里亚勺）删除整个大脑。
8. 预冷加入25ml 2 -甲基丁烷在50ml的烧杯中（ 例如，肖特杜兰）到-30至-40℃，在干冰上。
   注：对于这非常适合共聚焦激光扫描显微镜“厚”部分自由浮动的染色，取出大脑，洗3在缓冲液中，并储存在4℃下在磷酸盐缓冲的时间的30％蔗糖溶液的50ml管中，直到大脑已经下沉降到底部（通常过夜）。
9. 小心地将大脑一块Nescofilm（封口膜），并涵盖了充足的量TissueTek华侨城化合物，在-80℃直至使用2 - 甲基丁烷，店内冻结Nescofilm。
   注意：对于在-20℃下储存在9％蔗糖，7毫摩尔MgCl _2，50 mM磷酸盐缓冲液，44％甘油长时间存储。
10. 切脑入10-12微米厚的部分适当的冷冻切片机。
    注：对于厚，自由浮动的部分，大脑冻结在适当cryotome cryotome阶段（ 如赖克特荣，Frigomobil）和削减在-20°40微米的水平段至- 25℃。收集刀切片用细刷，并收集在缓冲区或保持存储解决方案（步骤4.9），在-20℃下长期贮存。
11. 小心地装上单显微镜载玻片两片。在我们电子商务的Superfrost UltraPlus型幻灯片强烈建议，最大限度地部分粘连。
12. 干燥载玻片5分钟，在室温下进行。幻灯片可以贮存于-80℃直至使用。

5。从灌注动物部分的制备

1. 麻醉以上（步骤4.2）所描述的动物。
2. 仔细transcardially灌注动物用磷酸盐缓冲盐水（PBS）中含肝素（0.025 10g/100ml的PBS）和普鲁卡因（0.5 10g/100ml的PBS）中2〜4分钟，随后在PBS中的4％多聚甲醛10-15分钟。灌注是通过使用约1.2-1.4米或利用蠕动泵设置为大约15毫升/分钟的静水压力通过左心室和开口的右心房灌流最佳执行。最佳灌注导致苍白的大脑，没有红色的血管是可见的。
3. 解剖和后固定于4％多聚甲醛的大脑，在4℃放置24小时。
4. 低温保护大脑在PBS中30％蔗糖，在4℃下至少24小时。
5. 冻结在cryotome舞台的大脑。
6. 使用适当的cryotome制备40μm的由整个前脑横截面。
7. 幻灯片可以在-20℃直至使用被存储在冷冻保护剂溶液（0.1M磷酸盐缓冲液，50％甘油，0.14％的MgCl _2，8.6％的蔗糖）。

6。未注动物的脑切片的免疫组化

1. 后固定冷冻切片中，如上​​所述，使用-20℃下的冷甲醇10分钟制备。
2. 用含0.3％的Triton-X（从哪个被用于提高二次抗体的物种）中过夜，4℃5％正常血清阻断
3. 冲洗3次用1×PBS，并与第一抗体孵育过夜，在4℃下
4. 冲洗3次用1×PBS，孵育在室温下的二抗一小时。
5. 冲洗3次用1×PBS
6. 凑nterstain的部分使用SYTOX绿，或DAPI（或替代的DNA染料）的DNA。
7. 冲洗3次用1×PBS
8. 嵌入在水性介质中嵌入的部分。
9. 让包埋剂聚合至少48小时。

7。灌注动物的脑切片的免疫组化

1. 如步骤6.2中所述，随后孵育含有0.3％的Triton-X（自由浮动的）在4℃过夜固定脑切片中第一抗体溶液稀释在PBS块
2. 漂洗三次，用1×PBS，孵育在稀释于PBS中含有0.3％的Triton-X（自由浮动）在室温下搅拌3小时的二级抗体溶液。
3. 冲洗3次用1×PBS
4. 染液的部分使用SYTOX绿色或DAPI（或替代的DNA染料）的DNA。
5. 漂洗三次，用1×PBS
6. 嵌入在水性介质中嵌入的部分。
7. 让包埋剂聚合一吨至少48小时。

8。的苔藓纤维预测调查

1. 牺牲动物，准备上述40微米的冠状切片，用抗体神经丝染色米海马节
2. 扫描部分在使用共聚焦激光扫描显微镜可视化苔藓纤维和核的适当波长。启动扫描在低倍镜下。
3. 使用低倍图像方向和目标的海马苔藓纤维的预测。
4. 扫描部分（Z-切片），在高分辨率和高放大倍数。
5. 通过分析染色的NF-M可视化的苔藓纤维的外观形态和连通性。
6. （可选）分析海马叶片的尺寸和体积。使用DNA信号的测量。

9。氟翡翠C含量（神经细胞死亡）

1. 牺牲动物，解剖hippocAMPUS，并准备上述12微米的部分。
2. 让该部分干燥30分钟，在室温下进行。
3. 固定在4％PFA的部分为40分钟，在室温下进行。
4. 简述双蒸₂ O洗部3X
5. 孵育0.06％的高锰酸钾（ _高锰酸钾 ）的部分为10分钟连续下，轻轻摇动。
6. 洗部3X用双蒸₂ O。
7. 孵育切片用20分钟，在室温下0.002％氟玉C溶液。
8. （可选）对于同时核染色，0.002％氟翡翠C溶液可补充10微克/毫升的DAPI。
9. 简述双蒸₂ O洗部3X
10. 让该部分干燥30分钟，在室温下进行。
11. 孵育二甲苯的部分（1分钟）
12. 采用二甲苯为基础的安装介质（DPX）安装部分。

结果

杂交育种的IκB/ -以及tTA的转基因小鼠系导致NF-κB活性的海马条件抑制。

调查IκBα-AA1-转基因的双转基因小鼠（ 图1A）的表达，大脑分离，cryosectioned和使用抗体抗GFP（绿色荧光蛋白）染色。共聚焦激光扫描显微镜观察发现高表达在CA1和CA3区的转基因，并在危险品（ 图1B）。

该IκBα-AA1-转基因表达类型-2B祖细胞?...

讨论

成年神经发生，并通过经多西环素在神经元抑制NF-κB的，其激活后其操纵的可能性，提供了调查，​​在成人大脑，以及为神经元去和重新生成的新生神经元引人入胜系统。该系统的优点在于，NF-κB信号通路抑制神经元不仅导致改变神经细胞死亡，祖细胞的增殖和迁移，以及严重的结构和解剖学上的变化，而且在学习的明显缺陷。重要的是，IκB/ tTA的动物的表型可逆转实验和多西环素给药后获救?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining