NF-KB-bağımlı yetişkin nöron Modülasyon ve Analiz Yöntemleri

Özet

NF-KB-bağımlı yetişkin hipokampal nöron manipülasyonu ve analiz için yöntemler tarif edilmiştir. Ayrıntılı bir protokol farelerin bilişsel sonuçların araştırılması için bir dentat girus-bağımlı davranış testi (uzaysal desen ayrılık-Barnes labirent adlandırılır) için sunulmuştur. Bu teknik aynı zamanda, diğer deneysel ortamlarda araştırmaları sağlama yardımcı olmalıdır.

Özet

Hipokampus epizodik anıların oluşumu ve konsolidasyon önemli bir rol oynar, ve mekansal yönde. Tarihsel olarak, yetişkin hipokampus, memeli beyin, çok statik bir anatomik bölgesi olarak incelendi. Ancak, son bulgular hipokampusun dentat girus mevcut nöronal devrelerin değişiklikler, aynı zamanda yetişkin nöron sadece içeren, yetişkinlerde büyük bir plastisite bir alan olduğunu göstermiştir. Bu esneklik, transkripsiyon faktörü NF-KB önemli bir rol oynadığı, kompleks transkripsiyonel ağlar tarafından düzenlenir. Yetişkin nöron, NF-KB aktivitesi ön beyin özgü nöronal engellenmesi için bir fare modeli de kullanılabilir çalışma ve işlemek için.

Bu çalışmada, yöntem, yapısal açıdan, nöronal apoptoz ve progenitor çoğalması ve bilişsel önemi, hangi içeren NF-KB-bağımlı nöron analizi tarif edilmektedirh özellikle kıvrımlarının (DG)-bağımlı davranış testi, mekansal desen ayrılık-Barnes labirenti (SPS-BM) üzerinden değerlendirildi. SPS-BM protokolü sadece erişkin hipokampal nöron özellikle genlerin etkisini değerlendirmek için tasarlanmış diğer transgenik hayvan modelleri ile kullanım için adapte olabilir. Dahası, SPS-BM farmakolojik ajanları kullanarak, örneğin, DG-bağımlı öğrenmeyi araştıran ve manipüle amaçlı diğer deneysel ortamlarda kullanılabilir.

Giriş

Ontolojik, hipokampus bilinen eski anatomik beyin yapılarından biridir. Bu tür uzun süreli bellek, uzaysal ve ilgili hafızanın oluşumu ve konsolidasyon düzenlenmesinde önemli fonksiyonlar gibi çeşitli karmaşık görevler için sorumludur. Anatomik olarak, hipokampus kendi subgranular bölge içinde granül hücreleri ve birkaç nöronal progenitörlerin içeren cornu ammonis (CA1, CA2, CA3 ve CA4) bölgeleri ve kıvrımlarının (dentat girus), dahil olmak üzere, piramidal hücre tabakası (stratum pyramidale) oluşmaktadır . Granül hücreleri olarak adlandırılan mossy liflerden (granül hücrelerin akson) ile CA3 bölgesine doğru çıkıntı.

Geçen yüzyılın sonuna kadar, yetişkin memeli beyin hücre plastisite ve nöron eksik statik bir organ olduğuna inanılıyordu. Ancak, son iki yılda, kanıtların giderek artan miktarı açıkça yer alıyor yetişkin nörogenezi gösterir en azİki beyin bölgeleri, bölge subventricular (SVZ) ve hipokampus subgranular bölge.

Daha önceki çalışmalar, ve diğer gruplar bu, transkripsiyon faktörü NF-KB yetişkin nöron önemli moleküler düzenleyicilerin biridir ve ağır yapısal kusurlar hipokampal ve bilişsel bozukluklar ^1-6 onun de-regülasyon sonuçları olduğunu göstermiştir. NF-KB, beş DNA-bağlayıcı alt birimlerinin farklı dimerik kombinasyonlarından oluşan bir endüklenebilir transkripsiyon faktörünün genel adıdır: p50, p52, c-Rel, RelB ve p65 (RelA), bunlardan son üç transaktivasyon alanları vardır. Beyin içinde, sitoplazma içinde bulunan en bol bir şekilde p50 ve kappa B (IkB)-proteinleri inhibitörü ile bir inaktif halde tutulur p65, bir heterodimerdir.

NF-KB odaklı nöron çalışma ve direkt olarak işlemek için, NF-KB subun tüm basit önlenmesini sağlamak için transgenik fare modelleri kullanmakonun, özellikle ön beyin ⁷ (Şekil 1). Ve -/tTA - Bu amaçla, biz şu transgenik fare hatları, IKB / çapraz yetiştirilmiş. Transgenik IKB / - hat NF-KB-inhibitörü IκBa (süper-represor IκBa-AA1) bir trans-dominant negatif mutant kullanılarak oluşturulan ^8. Yabani tip IκBα aksine, IκBα-AA1 inhibitörünün fosforilasyonunu ve daha sonra proteozomal bozulmasını engelleyebilir alaninler (V32 ve V36) için mutasyona uğramış iki serin kalıntısına sahiptir. IκBa-AA1-transgenin ön beyin nöron-özel ifadesi için, IkB / - fareler fareler, kalsiyum-kalmodulin bağımlı kinaz barındıran çapraz-yetiştirilmiş IIα tetrasiklin trans-etkinleştirici bölgesiyle (tTA) tarafından tahrik edilebilir (CAMKIIα)-promoteri ^9.

p65 knock-out fareler nedeniyle masif karaciğer apoptoz ^10, bir embriyonik ölümcül fenotip var, bu nedenle burada gösterilen yaklaşımı zarif bir yöntem sağlarpostnatal ve erişkin nöron NF-KB rolünü araştırmak için.

Uzaysal öğrenme ve bellek çalışma klasik davranış testi Richard Morris, Morris su labirenti-(MWM) ¹¹ olarak bilinen bir test tarafından 1980'lerde tanımlanmıştır. Bu açık alanda su labirentinde, hayvanlar yönlendirme ve ekstra labirent ipuçları dayalı gizli bir platform üzerine opak sudan kaçmak için öğrenirler. MWM kuru bir varyant olarak adlandırılan Barnes labirenti (BM) ^12'dir. Bu test, bir bir çıkış kutusu olarak tanımlanan delik ve yönlendirme için görsel fazladan-maze ipuçları ile, plakanın sınırında düzenlenmiş dairesel delikler 20 ile dairesel bir levha kullanır. Hem deneysel paradigmalar bir kemirgen `ın su kaçınma, ya da açık, parlak ışıklı mekanlarda tarafından uyarılan uçuş davranış güveniyor. Her iki test uzaysal bir soruşturma ve ilgili bellek performansı sağlar. Hipokampus uzamsal hafıza oluşumunda genel ve önemli bir rol oynamasına rağmen, hipokampal rkatılan egions uygulanan teste göre değişir. BM test bellek enthorinal korteks (EC) ve DG ^13-16 bir katkısı olmadan hipokampusun CA1-bölgesinde bulunan piramidal nöronlar arasında nöronal etkinlik ortaya çıkar. Özel olarak, klasik BM esas Önemli olarak, DG önemlisi işleme bölgesinin sadece ima sözde uzamsal örüntü tanıma ^17, katılır EC V'a CA1 EC III monosinaptik temporo-amonik yolu ile gösterime dayanır görsel ve mekansal bilgi değil, aynı zamanda farklı, örtüşmeyen gösterimleri içine benzer temsilleri veya anıları dönüşüm. Bu görev CA1 ve BM ¹⁵ test edilemez AT VI, için CA3 için DG EC II fonksiyonel bir tri-sinaptik devre gerektirir.

Bu sorunları çözmek için, biz özellikle co dentat girus bağımlı bilişsel performansını test etmek için bir davranış testi olarak SPS-BM tasarladılarntrol hayvan ve NF-KB inhibisyonu aşağıdaki IkB / tTA süper-represör modelinde. Önemli olarak, MWM ya da BM aksine, SPS-BM nöron düşüklüğü kaynaklanan ince davranışsal hasarları ortaya çıkarabilir. Uzamsal-desen-ayırma EC II ve DG ve CA3 ve CA1 ve AT VI arasında işlevsel bir devre üzerinde sıkı sıkıya bağlı olduğundan, bu test içinde potansiyel nörojenezindeki değişiklikler, yosunlu lif yolunun değişiklikler veya doku homeostasisin değişikliklere son derece hassas DG.

Teknik olarak, bizim test set-up Clelland ve arkadaşları tarafından araştırmaya dayanmaktadır., Mekansal ayrılık desen ahşap 8-kollu radyal kollu labirent (RAM) ¹⁹ kullanılarak test edildiği. Bizim modifiye set-up, sekiz silah yedi özdeş sarı gıda evler almıştır. Özet olarak, yöntemler, hipokampus, mossy lif çıkıntılar, nöronal hücre dE içinde doublekortin salgılayan (DCX +) hücre analizleri de dahil olmak üzere, burada gösterilenATH ve özellikle SPS-BM Burada yer, yetişkin nöron üzerinde bir etkiye sahip transgenlerin katıldığı diğer fare modelleri araştırmalar uygulanabilir. Diğer uygulamalar farmakolojik ajanların çalışma ve DG ve mekansal desen ayrılık üzerindeki etkisini ölçmek içerebilir.

Protokol

Etik beyanı

Bu çalışma, toplum ve hayvan bakımı kullanım komitesi, devlet Kuzey Ren-Vestfalya, (Düsseldorf, Almanya) ve LANUV düzenlemeleri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri lisans numarası 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW) altında LANUV, Düsseldorf tarafından kabul edildi. Tüm çabalar sıkıntı ve çalışma için gerekli hayvan sayısını en aza indirmek için yapılmıştır.

1.. Hayvan Bakım ve Barınma

1. European Federation Laboratory Animal Science Derneği (FELASA) tarafından tanımlanan, burada tarif edilen protokollere kullanılan tüm hayvanlar, özel patojen içermeyen koşullar altında tutulmalıdır.
2. HEPA süzülmüş havası sahip olan fareler, günlük koşullarında (12 saat ışık / karanlık çevrimi) altında bir ısı-ve nem-kontrollü (22 ° C) bir odada standart kafeslerde muhafaza edilmelidir.
3. Standart yiyecek ve su ad libitum temin edilmelidir.
4. IkB / tTA ve IkB / ise - kontrol fareleri kullanılır ^{7, 18} de tarif edildiği gibi, PCR tabanlı bir genotipleme, her bir hayvan için gerçekleştirilmelidir.
5. Az dört gün bir yaş farkı olan erkek hayvanlar bireysel değişkenliği azaltmak için kullanılacak gerekir.
6. (İSTEĞE BAĞLI): NF-KB etkinleştirme deneyler için, doksisiklin, en az 14 gün boyunca (% 2.5 sükroz ile 2 mg / ml) içme suyu içinde tatbik edilmelidir.

2. Mekansal Desen Ayırma-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Tüm davranış testi uluslararası ve yerel kurallara uygun olarak yapılmalıdır.
2. ÖNEMLİ! Altı ay veya daha eski bir çağda sadece erkek fareler kullanın. Bir test serisinin hayvanlar arasındaki yaş farkı az dört gün olmalıdır. Test, her seri için aynı operatör tarafından gerçekleştirilmelidir. Fareler ayrıca kısmen olarak tahrik motivasyonunu artırmak için önce test için bir standart diyet almalıdırweet gıda ödül.
3. Sert plastikten yapılmış bir beyaz dairesel plaka ayarlayın en az 4 x 80 W ve 3 x 215 W neon floresan lambalar ile aydınlatılan bir nem ve sıcaklık kontrollü bir odada (22 ° C) ve (çapı 120 cm, Şekil 5A bakınız) . ÖNEMLİ! Farelerin motivasyon kısmen aydınlık, maruz yerlere kendi kaçınma tarafından yönlendirilen gıda evlere girmek için, doğru aydınlatma kullanıldığından emin olun.
4. Video izleme sistemi kurmak. Kamera 115 cm plakasının merkezinde (bkz. Şekil 5A) üstünde olmalıdır.
5. Hayvanların, plakanın sınırında yaklaşık 100 cm (Şekil 5A bakınız) kolayca görülebilir pozisyonlarda beyaz renkli kumaş için çok renkli ekstra-labirent ipuçları (EMC) takın.
6. Dikkatli deneysel set-up herhangi bir koku kaldırabilirsiniz hızlı bir dezenfektan ile plakasını temizlemeyin.
7. Yedi özdeş sarı gıda evler (12 cm x 7 cm x 8 cm, bakınız Şekil 5A yerleştirin güçlü. Konumları (Şekil 5A bakınız) Tümden işaretlenmiş olmalıdır.
8. Şekil 5A, tek bir tanımlanmış gıda ev hayvan (konum F serbestçe erişilebilir olmak (Şekil 5A bakınız) tanımlanmış pozisyonlara tüm gıda evlerin içine tatlı gıda pelet ödülleri (bir Kellogs `s Froot Döngü / gıda evin bir çeyrek) bkz yerleştirin .) Şeffaf folyo ile nontarget gıda evleri kapatın.
9. Testten önce, alışma (görev başlamadan bir gün önce) gerçekleştirin. Tüm gıda evler serbestçe erişilebilir yapın ve fareler serbestçe labirenti keşfetmek ve bir gıda pelet ödül (10 dk / hayvan) almak için izin verir.
10. Üzerinde bilgisayar ve kamerayı açın ve video izleme sistemi yazılımını başlatmak.
11. Kayda başlayın.
12. Dairesel plaka üzerinde tanımlanmış başlangıç ​​noktası (Şekil 5A, S: başlangıç ​​pozisyonu) de hayvan koyun ve fareler 10 dakika boyunca hedef gıda evde aramak için izin verir.
13. Stop video izleme.
14. ÖNEMLİ! Hızlı dezenfektan ile her deneme sonrasında dairesel plaka ve gıda evler temizleyin.
15. (Her hayvan için) yedi gün boyunca günde testi tekrarlayın.
16. Uygun istatistik yazılımını kullanarak sonuçları (gecikme, katedilen mesafe ve hatalar) analiz. Yanlış gıda ev ve / veya girme ve gıda pelet ödül almak olmadan uygun bir kutu ile temas yaklaşıyor gibi hataları tanımlayın. Gruplandırılmış analizi için Bonferroni post-hoc testi ile iki yönlü ANOVA kullanın.
17. (İSTEĞE BAĞLI) fareler Kurban ve aşağıda açıklandığı gibi hippocampi analiz.

3. BrdU Etiketleme

1. 3 gün (farklılaşma ve entegrasyon analizi) ya da tek bir enjeksiyon (proliferasyon analizi) için 200 mg / kg ip boyunca günde bir defa intraperitoneal olarak 50 mg / kg ip BrdU enjekte edilir.
2. , Hayvanların Kurban hipokampus incelemek ve aşağıda açıklandığı gibi 40 mikron bölümleri hazırlamak.
3. Denatüre10 dakika için 2 M HCI ile bölümler ve 10 dakika boyunca 0.1 M borat tamponu içinde inkübe edilir.
4. BrdU karşı antikorlar kullanılarak aşağıda tarif edildiği gibi, immünohistokimyasal olarak, her bir hayvandan 40 um bölümler (ayrı 240 um) bir tek-in-on iki serisi etiketleyin.
5. Tanecik hücre katmanlarında ve subgranular zonunun rostro ölçüde boyunca konfokal mikroskopi analizi ile etiketlenmiş hücrelerin ölçmek. DG başına etiketli hücrelerin toplam sayısını elde etmek için iki ile hipokampus ve bölme başına BrdU etiketli hücrelerin tahmini toplam sayısını elde etmek için, 12 ile elde edilen numaralar çarpın.

4. Perfüze olmayan hayvanlardan Brain ve kriyokesitler Hazırlanması çıkarılması

1. Hayvanların ötenazi için lokal olarak onaylanmış prosedürlere uymak. Fareler doğrudan servikal dislokasyon ile ötenazi olabilir.
2. (İSTEĞE BAĞLI) Hayvanlar periton inje örneğin, yerel ve uluslararası kurallara uygun olarak, ölümden önce anestezi olabilir(taze ya da fizyolojik tuz tamponu 1.85 ml 2.2 mg 2,2,2-tribromoethanol izoamil etanol ml 1 içinde yapılmış 150 ml stok çözelti karıştırılarak yapılan) 33 g bir fare için 0.8 ml olarak Avertin'in şeklinde gösterilmektedir.
3. Betadine (% 10 povidon-iyot)-batırılmış% 70 etanol ile ıslatılmış gazlı bez ile sonradan gazlı bez ve bez ile kafası sterilize.
4. Uygun cerrahi makas kullanılarak hayvan başını kesmek ve bir kenara cilt çekin.
5. (İSTEĞE BAĞLI) Fiksatörleri geri zekalı cilt katlama önlemek için uygulanabilir.
6. Kafatasında bir ensizyon olun ve dikkatli bir kenara kafatası parçaları çekin.
7. Dikkatle uygun bir cerrahi alet (örneğin Moria Kaşık) kullanılarak tüm beyin kaldırmak.
8. Kuru buz üzerinde -30 ila -40 ° C, 50 ml'lik bir cam kaba (örneğin, Schott Duran) içindeki bir 2-metilbütan ön soğutma 25 mi.
   Not: ideal konfokal lazer taramalı mikroskopi için uygundur "kalın" bölümlerinin serbest yüzen boyama için, beyin kaldırmak, 3 yıkamabeyin (tipik olarak gece boyunca) dibine kadar batmış fosfat içinde 4 ° C'de tampon ve mağaza kez 50 ml bir tüp içinde% 30 sukroz çözeltisi tamponlu.
9. Dikkatle nescofilm (Parafilm) bir parça beyin koyun ve TissueTek Ekim bileşik bol miktarda kapak, -80 ° C'de kullanıma kadar 2-metilbutan, mağaza nescofilm dondurulması.
   Not:% 9 sakaroz, 7 mM _MgCI2, 50 mM fosfat tampon maddesi,% 44 gliserol içinde -20 ° C bir mağazada uzun süre depolama için.
10. Uygun cryomicrotome 10-12 mikron kalınlığında kesitler halinde beyin kesin.
    Not: Kalın, serbest yüzen kesitler için, (örneğin Reichert Jung, Frigomobil.) Ve -20 ° 40 mikron yatay bölümleri kesmek uygun kriyotomu arasında kriyotomu sahnede beyin dondurmak - 25 ° C. Ince bir fırça ile bıçak bölümleri toplayın ve tampon toplamak veya uzun süre depolama için -20 ° C'de (4.9 adım) depolama çözümü tutmak.
11. Dikkatle tek mikroskop lamı üzerine iki dilim monte. BiziUltraPlus Superfrost slaytların e çok bölümlerden yapışmasını arttırmak için tavsiye edilir.
12. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca slaytlar kurutun. Slaytlar, kullanılıncaya kadar -80 ° C'de muhafaza edilebilir.

5. Perfüze Animals Bölümler hazırlanması

1. (Adım 4.2) yukarıda tarif edildiği gibi hayvanların anestezisi.
2. Dikkatle 10-15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid, ardından 2-4 dakika boyunca fosfat tamponlu heparin ihtiva eden tuzlu su (PBS) (0.025 g/100 ml PBS) ve prokain (0.5 g/100 mi PBS) ile transkardiyal hayvan perfüze . Perfüzyon en iyi şekilde yaklaşık olarak 1.2-1.4 m ya da yaklaşık olarak 15 ml / dak 'ya ayarlanmış bir peristaltik pompa kullanılarak bir hidrostatik basınç kullanarak sol ventrikül ve sağ atriyum açıklığı yoluyla perfüze edilmesi ile gerçekleştirilir. Hiç kırmızı kan damarları görünür olmak bir soluk beyaz beyin Optimal perfüzyon sonuçları.
3. Inceleyin ve 24 saat boyunca 4 ° C 'de% 4 paraformaldehid içinde beyinleri sonrası düzeltin.
4. Cryoen az 24 saat boyunca 4 ° C'de PBS içinde% 30 sukroz içinde beyinleri korur.
5. Kriyotomu sahnede beynini dondurur.
6. Uygun bir kriyotomu kullanarak tüm forebrains 40 mikron yatay kesitler hazırlamak.
7. Slaytlar, -20 ° C'de kullanıma kadar, dondurarak saklama çözeltisi (0.1 M fosfat tampon maddesi,% 50 gliserol,% 0.14 _MgCI2,% 8.6 sukroz) saklanabilir.

6. Perfüze Hayvanlar Beyin Bölümler İmmünohistokimyası

1. 10 dakika boyunca -20 ° C soğuk metanol kullanılarak, yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan cryosections, Post-düzeltin.
2. 4 ° C de bir gece (ikincil antikor yükseltilmesi için kullanılan türden)% 0.3 Triton-X içeren% 5, normal serum ile bloke
3. 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve 4 ° C de bir gece primer antikorlar ile inkübe
4. 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve bir saat süre ile, oda sıcaklığında, ikincil antikor ile inkübe edin.
5. 1x PBS ile 3 kez yıkayın
6. CouSYTOX yeşil veya DAPI (ya da bir başka DNA boya) kullanılarak DNA bölümünün nterstain.
7. 1x PBS ile 3 kez yıkayın
8. Sulu bir ortam içinde gömme bölümleri Embed.
9. Gömülü maddenin en az 48 saat boyunca polimerize olsun.

7. Perfüze Hayvanlar Beyin Bölümler İmmünohistokimyası

1. Adım 6.2 'de tarif edilen ve daha sonra 4 ° C de bir gece boyunca% 0.3 Triton-X (yüzer) ihtiva eden PBS içerisinde seyreltilmiş primer antikor çözeltisi içinde tespit edilmiş olan beyin bölümleri inkübe olarak Block
2. 1x PBS ile üç kez yıkayın ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında,% 0.3 Triton-X (serbest yüzen) ihtiva eden PBS içerisinde seyreltilmiş sekonder antikor, çözelti içinde inkübe edilir.
3. 1x PBS ile 3 kez yıkayın
4. SYTOX DAPI, yeşil ya da (ya da bir başka DNA boya) kullanılarak DNA bölümü Counterstain.
5. 1x PBS ile üç kez yıkayın
6. Sulu bir ortam içinde gömme bölümleri Embed.
7. Gömme ortamı için polimerize olsunt en az 48 saat.

8. Yosunlu Fiber Projeksiyonlar Araştırılması

1. , Hayvanlar kurban yukarıda tarif edildiği gibi 40 mikron koronal kesitler hazırlamak ve sinir lifi M. antikoru kullanılarak hipokamp bölümü leke
2. Mossy elyaflar çekirdek ve görselleştirmek için bir odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak, uygun dalga boyunda bölümleri tara. Düşük büyütme taramayı başlatın.
3. Yönlendirme için düşük büyütme görüntüleri kullanmak ve yosunlu lif projeksiyonları ile hipokampus hedef.
4. Yüksek çözünürlüklü ve yüksek büyütme bölümleri (z-bölümleme) tarayın.
5. NF-M lekeleme ile görselleştirilmiştir mossy liflerinin morfolojik görünümünü ve bağlantı analiz edin.
6. (İSTEĞE BAĞLI) hipokampal bıçaklarının boyutu ve hacmini analiz. Ölçümler için DNA sinyali kullan.

9. Fluoro-Jade C Deneyi (Nöron Hücre Ölümü)

1. Hayvanların Kurban, hipokampusunda teşrihAmpus, ve yukarıda tarif edildiği gibi 12 um kesitler hazırlamak.
2. Kesitler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasına izin verin.
3. Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca% 4 PFA içinde bölümleri düzeltildi.
4. Kısaca bölümler GKD ₂ O. ile 3 kez yıkayın
5. , Sürekli, yumuşak çalkalama altında 10 dakika boyunca% 0.06 potasyum permanganat (KMnO ₄₎ ile bölümleri inkübe edin.
6. Bölümler GKD ₂ O. ile 3 kez yıkayın
7. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 0.002 Floro-Jade C solüsyonu ile bölümleri inkübe edin.
8. (İSTEĞE BAĞLI) eşzamanlı nükleer boyamalar için,% 0.002 Flor-Jade C çözeltisi 10 mg / ml DAPI ile takviye edilebilir.
9. Kısaca bölümler GKD ₂ O. ile 3 kez yıkayın
10. Kesitler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kurumasına izin verin.
11. Ksilen ile inkübe bölümleri (1 dakika)
12. Bir ksilen bazlı montaj ortamı (DPX) kullanarak bölümleri monte edin.

Sonuçlar

IkB / çapraz yetiştirme - tTA ve transgenik fare hatları hipokampta NF-KB aktivitesi şartlı inhibisyonuna yol açar.

Çift transgenik fare (Şekil 1A) 'de IκBα-AA1-transjenin ekspresyonunu incelemek için, beyin izole cryosectioned ve GFP (yeşil floresan protein) karşı bir antikor kullanılarak boyandı. Konfokal lazer tarama mikroskobu CA1 ve CA3 bölgelerde transgenin yüksek ifade ile uyumlu idi ve dg içinde (Şekil 1 B). <...

Tartışmalar

Yetişkin nöron ve doksisiklin ile nöronlarda NF-KB inhibisyonu, ve daha sonra yeniden aktivasyonu ile kendi manipülasyon olasılığı, yetişkin beyin, hem de nöronal de-ve yeniden üretimi içine yeni doğmuş nöronlar araştırmalar için ilginç bir sistem sunar . Bu sistemin güzelliği olduğu nöronal hücre ölümü, progenitör çoğalma ve yer değiştirme, ve ağır yapısal ve anatomik değişimler değil, aynı zamanda açık bir öğrenme kusurları değişikliklere nöron sonuçlar sadece NF-KB siny...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining