שיטות לאפנון וניתוח של Neurogenesis מבוגרים NF-κB תלוי

Summary

שיטות למניפולציה והניתוח של neurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר NF-κB תלוי מתוארות. פרוטוקול מפורט מוצג לבדיקה משוננת gyrus תלוי התנהגותי (שמכונה במבוך ההפרדה בארנס דפוס המרחבי) לחקירת תוצאה קוגניטיבית בעכברים. טכניקה זו צריכה גם לעזור לאפשר חקירות בהגדרות ניסיוניות אחרות.

Abstract

ההיפוקמפוס ממלא תפקיד מרכזי בהיווצרות והגיבוש של זכרונות אפיזודי, ובהתמצאות במרחב. מבחינה היסטורית, ההיפוקמפוס המבוגר נצפה כאזור אנטומי מאוד סטטי של המוח היונקים. עם זאת, הממצאים אחרונים הראו כי הרכס משוננת של ההיפוקמפוס הוא אזור של פלסטיות עצומה במבוגרים, הכולל לא רק שינויים של מעגלים עצביים קיימים, אלא גם neurogenesis למבוגרים. פלסטיות זה מוסדרת על ידי רשתות תעתיק מורכבות, שבו גורם שעתוק NF-κB משחק תפקיד בולט. ללמוד ולטפל neurogenesis למבוגרים, מודל עכבר מהונדס לעיכוב עצבי מוח קדמי ספציפי של פעילות NF-κB ניתן להשתמש.

במחקר זה, שיטות מתוארות לניתוח נוירוגנזה NF-κB תלויה, לרבות היבטיה המבניים, אפופטוזיס העצבי ושגשוגם מולידם, ומשמעות קוגניטיבית, אשרשעות היו דווקא העריכה באמצעות gyrus משוננת (DG) תלוי מבחן התנהגות, מבוך ההפרדה בארנס דפוס המרחבי (SPS-BM). פרוטוקול SPS-BM יכול להיות פשוט מותאם לשימוש עם מודלים של בעלי חיים מהונדסים אחרים שנועדו להעריך את השפעתם של גנים מסוימים בneurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר. יתר על כן, SPS-BM יכול לשמש בהגדרות ניסיוניות אחרות שמטרתם לחקור ומניפולצית למידת DG תלויה, למשל, באמצעות סוכנים תרופתיים.

Introduction

אונטולוגית, ההיפוקמפוס הוא אחד המבנים העתיקים ביותר במוח אנטומיים הידועים. הוא אחראי על משימות מורכבות מגוונות, כגון פונקציות מרכזיות בוויסות של זיכרון לטווח ארוך, התמצאות במרחב, ועל היווצרות וגיבוש של הזיכרון, בהתאמה. מבחינה אנטומית, ההיפוקמפוס מורכב משכבות פירמידה תא (pyramidale שכבה) כוללים cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, וCA4) האזורים וgyrus משוננת (dentatus gyrus), המכיל תאי גרגיר וכמה אבות עצביים באזור subgranular . תאי גרגיר להקרין לכיוון אזור CA3 באמצעות הסיבים שנקרא אזובי (האקסונים של תאי גרגיר).

עד סוף המאה שעברה, היה האמין המוח של היונקים הבוגרים להיות איבר סטטי חסר פלסטיות ונוירוגנזה סלולריות. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, כמות הולכת וגדלה של עדויות מראה בבירור neurogenesis למבוגרים המתרחשים בלפחותשני אזורים במוח, אזור subventricular (SVZ) ואזור subgranular של ההיפוקמפוס.

המחקרים הקודמים שלנו, ואלה של קבוצות אחרות, הראו כי גורם שעתוק NF-κB הוא אחד הרגולטורים המולקולריים החיוניים של neurogenesis למבוגרים, ושתוצאות דה הרגולציה שלה בפגמים חמורים מבניים בהיפוקמפוס וליקויים קוגניטיביים ^1-6. NF-κB הוא השם הגנרי של גורם שעתוק מושרה מורכב משילובים שונים dimeric של חמש יחידות משנה-DNA מחייבת: p50, P52, c-Rel, RelB, וp65 (רלה), יש להם את שלוש האחרונים שבם תחומים transactivation. בתוך המוח, הצורה נפוצה ביותר נמצאת בציטופלסמה היא heterodimer של p50 וp65, אשר נשמר בצורה פעילה על ידי מעכב של kappa B (IκB), חלבונים.

ללמוד ולתפעל ישירות נוירוגנזה מונעת-NF-κB, אנו משתמשים במודלי עכבר מהונדסים כדי לאפשר עיכוב פשוט של כל subun NF-κBשלה, במיוחד במוח הקדמי ⁷ (ראה איור 1). לצורך כך, אנו חוצים גידלו-השורות הבאות מהונדסים עכבר, IκB / - ו-/tTA. IκB / המהונדס - הקו נוצר באמצעות מוטציה שלילית טרנס דומיננטי של NF-κB-המעכב IκBa (סופר מדכא IκBa-Aa1) ^8. בניגוד לIκBα wild-type, יש IκBα--1AA שתי שאריות סרין מוטציה לalanines (V32 וV36), אשר מעכב את זירחון והשפלה proteasomal הבא של המעכב. לביטוי נוירון הספציפי מוח קדמי של IκBa--1AA-transgene, IκB / - עכברים הכליאו עם עכברי מחסה קינאז בסידן calmodulin תלוי IIα (CAMKIIα), אמרגן שיכול להיות מונע על ידי טרנס activator טטרציקלין (TTA) ^9.

יש עכברים עקום החוצה p65 פנוטיפ הקטלני עוברי, בשל אפופטוזיס כבד המסיבי ^10, ולכן הגישה המוצגת כאן מספקת שיטה אלגנטיתלחוקר את התפקיד של NF-κB בלידה וneurogenesis למבוגרים.

מבחן ההתנהגות הקלאסי ללמוד למידה וזיכרון המרחביים שתואר ב1980s על ידי ריצ'רד מוריס, מבחן המכונה המים מבוך מוריס (MWM) ^11. במי מבוך פתוח בתחום זה, בעלי חיים ילמדו לברוח ממים אטומים על גבי פלטפורמה מוסתרת מבוססת על רמזי התמצאות ובמיוחד מבוך. גרסה יבשה של MWM היא המבוך שנקרא ברנס (BM) ^12. בדיקה זו עושה שימוש בצלחת עגולה עם 20 חורים עגולים מסודרים בגבול של צלחת, עם חור אחד מוגדר כתיבת בריחה, ורמזים נוסף מבוך חזותיים לאורינטציה. שני פרדיגמות הניסוי מסתמכות על הטיסה הנגרמת על ידי מכרסמים `s סלידה למים, או שטחים פתוחים, מוארים ההתנהגות. בשני המבחנים יאפשר חקירה של התמצאות במרחב, וביצועי זיכרון הקשורים. למרות ההיפוקמפוס ממלא תפקיד בכלל וחיוני להיווצרות הזיכרון המרחבי, r בהיפוקמפוסegions המעורב להשתנות בהתאם למבחן המוחל. הזיכרון נבדק בBM נובע מפעילות עצבית בין קליפת מוח enthorinal (EC) ונוירונים פירמידליים ממוקמים באזור CA1-של ההיפוקמפוס בלי תרומה של ^13-16 DG. בפרט, BM הקלאסי נשען בעיקר על ניווט באמצעות מסלול monosynaptic temporo-ammonic מEC III לCA1 לEC V. חשוב לציין, DG הוא מעורב באופן מכריע בהכרה שנקרא מרחבית דפוס ^17, מה שמרמז לא רק העיבוד של מידע חזותי ומרחבית, אלא גם את הפיכתו של ייצוג או זכרונות דומים לייצוגים שונים, nonoverlapping. משימה זו דורשת מעגל פונקציונלי תלת סינפטי מEC השני לDG לCA3 לCA1 ו-EC השישי, שלא ניתן לבדוק ^ב15 BM.

כדי לטפל באתגרים אלה, יש לנו המציאו SPS-BM כמבחן התנהגותי כדי לבדוק את הביצועים קוגניטיביים משוננת gyrus תלוי בשיתוף במיוחדבעלי החיים ntrol, ובמודל סופר המדכא IκB / TTA הבא עיכוב NF-κB. חשוב לציין, בניגוד לMWM או BM, SPS-BM יכול לחשוף גירעונות התנהגותיים עדינים הנובעים מירידת הערך של נוירוגנזה. מאז מרחבית דפוס ההפרדה היא תלויה אך ורק על מעגל פונקציונלי בין EC השני וDG וCA3 וCA1 ו-EC VI, המבחן הזה הוא רגיש מאוד לשינויים אפשריים בנוירוגנזה, שינויים של מסלול אזובי סיבים או שינויים של הומאוסטזיס רקמה בתוך DG.

מבחינה טכנית, ההגדרה של הבדיקה שלנו מבוססת על המחקר של Clelland et al., שבו דפוס ההפרדה המרחבית נבדק באמצעות מבוך 8 זרוע עץ זרוע הרדיאלית (RAM) ^19. בהגדרה שונה שלנו, הוחלפו שמונה זרועות על ידי שבעה בתי אוכל צהובים זהים. לסיכום, השיטות שמוצגים כאן, ובכלל זה ניתוח (DCX +)-להביע תאי doublecortin בתוך ההיפוקמפוס, תחזיות אזובי סיבים, דה תאים עצביתATH ובמיוחד SPS-BM שהוצג כאן, יכול להיות מיושם על חקירות של דגמי עכבר אחרים המשלבים transgenes שיש להם השפעה על neurogenesis למבוגרים. יישומים נוספים עשויים לכלול את המחקר של סוכנים תרופתיים ומדידת ההשפעה שלהם על הפרדת דפוס DG ומרחבים.

Protocol

שמירה על האתיקה

מחקר זה בוצע בהתאם קפדן עם התקנות של ועדת בעלי החיים ושימוש בטיפול הממשלתית, LANUV של המדינה נורדריין וסטפליה, (דיסלדורף, גרמניה). כל הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי LANUV, דיסלדורף תחת מספר הרישיון 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). כל המאמצים נעשו כדי למזער את המצוקה ואת מספר בעלי החיים הדרושים למחקר.

1. טיפול בבעלי חיים ושיכון

1. כל בעלי החיים המשמשים בפרוטוקולים שתוארו במסמך זה צריכים להיות כל הזמן תחת תנאי הפתוגן ללא ספציפיים, כפי שהוגדרו על ידי הפדרציה האירופית מעבדת מדעי בעלי החיים האגודה (FELASA).
2. צריכים להיות כל הזמן עכברים בכלובים סטנדרטיים בטמפרטורת חדר ולחות מבוקרת (22 ° C) בתנאים היומיים (שעות אור 12 / מחזור כהה) עם HEPA מסונן מיזוג.
3. מזון ומים תקניים צריכים להיות כרצונך בתנאי.
4. אם IκB / TTA וIκB / - עכברי בקרה משמשים, גנוטיפ מבוסס PCR יש לבצע עבור כל חיה, כפי שתואר ^{ב7, 18.}
5. צריכים להיות בשימוש בעלי חיים ממין זכר עם הפרש גילים של פחות מארבעה ימים כדי להפחית את השונות אישיות.
6. (לא חובה): לניסויים מחדש NF-κB, דוקסיציקלין חייב להינתן במי שתייה (2 מ"ג / מיליליטר עם סוכרוז 2.5%) לפחות 14 ימים.

2. תבנית מרחבית הפרדה-בארנס מבוך (SPS-BM)

1. כל הבדיקות התנהגותיות צריכה להתבצע על פי הנחיות בינלאומיות ומקומיות.
2. חשוב! השתמש רק בעכברי זכרים עם גיל שישה חודשים ומעלה. הפרש הגילים בין החיות סדרת מבחן אחד צריך להיות פחות מארבעה ימים. הבדיקה חייבת להתבצע על ידי אותו מפעיל לכל סדרה. העכברים צריכים לקבל תזונה רגילה לפני הבדיקה כדי להגביר את המוטיבציה מונעת באופן חלקי על ידי כנוסףגמול מזון weet.
3. הגדר את צלחת עגולה לבנה עשויה מפלסטיק קשיח (120 סנטימטר הקוטר, ראה איור 5 א) ובלחות בחדר בטמפרטורה מבוקרת (22 מעלות צלזיוס), מוארת עם לפחות 4 x 80 W ו 3 x 215 מנורות ניאון ניאון W . חשוב! להבטיח את התאורה הנכונה משמשת, כפי שהמוטיבציה של העכברים להיכנס לבתי האוכל הוא מונעת באופן חלקי על ידי שנאה שלהם למקומות בהירים, חשופים.
4. הגדר את מערכת וידאו למעקב. המצלמה צריכה להיות ממוקמת 115 ס"מ מעל מרכז הצלחת (ראה איור 5 א).
5. צרף רמזים ססגוניים במיוחד מבוך (EMC) לבד לבן בצבע בעמדות לעין בקלות לבעלי החיים, כ 100 סנטימטר מהגבול של הצלחת (ראו איור 5 א).
6. לנקות בזהירות את הצלחת עם חומר חיטוי מהיר שיכול להסיר כל ריח מניסיוני ההגדרה.
7. הנח שבעה בתים זהים צהובים מזון (12 ס"מ X 7 ס"מ X 8 סנטימטר, ראו איור 5A ) על הצלחת הלבנה. העמדות צריכה להיות מסומנות באופן חד משמעי (ראו איור 5 א).
8. הנח תגמולים מתוקים גלולה מזון (רבע מבית יותר הרציני Loop / מזון `s Kellogs) בתוך כל בתי האוכל בעמדות מוגדרות (ראה איור 5 א) רק עם ביתה אוכל הגדיר את אחד להיות נגיש באופן חופשי לבעלי החיים (מיקום F, ראו איור 5A ). לסגור את בתי האוכל nontarget בנייר שקוף.
9. לפני הבדיקה, לבצע הרגלה (יום אחד לפני שמתחיל את המשימה). הפוך את כל בתי המזון נגישים באופן חופשי ולאפשר לעכברים כדי לחקור את המבוך באופן חופשי וכדי לאחזר גמול גלולה מזון (10 דקות / בעלי חיים).
10. כבה את המחשב ואת המצלמה ולהפעיל את תוכנת מערכת וידאו למעקב.
11. להתחיל את ההקלטה.
12. מניחים את החיה בנקודת ההתחלה המוגדרת על הצלחת העגולה (איור 5A, S: להתחיל עמדה) ולאפשר לעכברים כדי לחפש את בית האוכל היעד ל10 דקות.
13. סטוp וידאו המעקב.
14. חשוב! נקה את הצלחת העגולה ובתי מזון לאחר כל ניסוי עם חומר חיטוי מהיר.
15. חזור על הבדיקה ביום למשך שבעה ימים רצופים (עבור כל חיה).
16. לנתח את התוצאות (חביון, מרחק מכוסה ושגיאות) באמצעות תוכנה הסטטיסטית מתאים. הגדרת טעויות כמתקרבים לבית האוכל הלא נכון ו / או מגע עם התיבה הנכונה בלי להיכנס ואחזור הפרס גלולה מזון. לצורך הניתוח קובצו להשתמש דו סטרי ANOVA עם פוסט הוק מבחן Bonferroni.
17. (אופציונלי) להקריב את העכברים ולנתח hippocampi כמתואר להלן.

3. תיוג BrdU

1. הזרק intraperitoneally 50 מ"ג / קילוגרם ip BrdU פעם ביום למשך 3 ימים (ניתוח של גזירה ואינטגרציה) או ה-IP 200 מ"ג / קילוגרם לזריקה אחת (ניתוח של התפשטות).
2. להקריב בעלי החיים, לנתח את ההיפוקמפוס ולהכין 40 מיקרומטר סעיפים כפי שיתואר להלן.
3. Denaturateחלקים עם 2 M HCl עבור 10 דקות ו דגירה ב0.1 חיץ borate M עבור 10 דקות.
4. תווית סדרה אחת ב-עשר 40 מיקרומטר סעיפים (מלבד 240 מיקרומטר) מכל חיה immunohistochemically, כפי שיתואר להלן באמצעות נוגדנים המכוונים נגד BrdU.
5. לכמת את התאים שכותרתו על ידי ניתוח מיקרוסקופיה confocal ברחבי מידת rostrocaudal של שכבת תאי גרגר ואזור subgranular. הכפל את המספרים וכתוצאה מכך על ידי 12 להשיג את המספר הכולל המשוער של תאים שכותרתו BrdU להיפוקמפוס ומתחלקים על ידי שתי כדי לקבל את המספר הכולל של תאים שכותרתו לDG.

4. ההסרה של המוח והכנת cryosections מבעלי חיים Nonperfused

1. שים לב לנהלים שאושרו באופן מקומי להרדמת חסד בעלי חיים. עכברים יכולים להיות מורדמים באופן ישיר על ידי נקע בצוואר הרחם.
2. יכולים להיות מורדמים בעלי חיים (אופציונליים) לפני euthanization על פי הנחיות בינלאומיות ומקומיות, למשל על ידי inje intraperitonealction של 0.8 מיליליטר Avertin לעכבר 33 g (טרי שנעשה על ידי ערבוב 150 מיליליטר פתרון מניות עשויים 2.2 מ"ג 2,2,2-tribromoethanol ב 1 מיליליטר isoamyl אתנול עם 1.85 מיליליטר של תמיסת מלח או חיץ פיסיולוגי).
3. לעקר את הראש עם פולידין (10% povidone-יוד) ספוג גזה ולאחר מכן עם ספוגית גזה הספוגה ב70% אתנול.
4. לערוף את בעלי החיים באמצעות מספריים כירורגיות מתאימים ולמשוך את העור בצד.
5. ניתן ליישם תופסנים (אופציונליים) כדי להימנע מהקיפול אחורי של העור המפגר.
6. ביצוע חתך קו האמצע בגולגולת ומושך בזהירות את השברים בגולגולת בצד.
7. מוציא בזהירות את המוח כולו באמצעות מכשיר מתאים כירורגית (למשל מוריה כפית).
8. Precool 25 מיליליטר של 2 מתילבוטאן בכוס מיליליטר 50 (למשל שוט דוראן) ל-30 עד C ° -40 על קרח יבש.
   הערה: עבור מכתים הריחוף ללא סעיפים "עבים", אשר מתאימים באופן אידיאלי למיקרוסקופ לייזר confocal סריקה, להסיר מוח, לשטוף 3פעמים בחיץ ולאחסן ב 4 ° C בפוספט שנאגרו 30% תמיסת סוכרוז ב50 צינור מיליליטר עד המוח שקע עד לתחתית (בדרך כלל בלילה).
9. בזהירות במקום מוח על פיסת Nescofilm (Parafilm) ומכסים בכמות גדולה של מתחם TissueTek אוקטובר, להקפיא בNescofilm ב2 מתילבוטאן, חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
   הערה: עבור אחסון לטווח זמן בחנות -20 מעלות צלזיוס בסוכרוז 9%, 7 מ"מ MgCl _2, חיץ פוספט 50 מ"מ, גליצרול 44%.
10. חותכים את המוח ל10-12 מיקרומטר חלקים עבים על cryomicrotome המתאים.
    הערה: חלקים עבים, חופשיים צף, להקפיא מוח על cryotome שלב של cryotome המתאים (למשל רייכרט יונג, Frigomobil.) ולחתוך 40 מיקרומטר סעיפים אופקיים ב -20 ° ל-- 25 ° C. לאסוף חלקים מסכין עם מכחול דק ולאסוף במאגר או לשמור בפתרון אחסון (שלב 4.9) ב -20 ° C עבור אחסון לטווח זמן.
11. הר שתי פרוסות בזהירות על שקופיות מיקרוסקופ אחת. שלנודואר של שקופיות Superfrost UltraPlus מומלץ מאוד למקסם את ההדבקה של החלקים.
12. ייבש את השקופיות עבור 5 דקות בטמפרטורת חדר. שקופיות ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

5. הכנת סעיפים מבעלי חיים perfused

1. להרדים את החיות כפי שתואר לעיל (שלב 4.2).
2. תנקב את החיה בזהירות transcardially עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) המכיל הפרין (0.025 g/100 מיליליטר PBS) ופרוקאין (0.5 g/100 מיליליטר PBS) במשך 2-4 דקות, ואחריו paraformaldehyde 4% ב-PBS עבור 10-15 דקות . זלוף מבוצע בצורה אופטימלית על ידי מרוסס דרך החדר והפתיחה של אטריום ימין השמאל באמצעות לחץ ההידרוסטטי של כ 1.2-1.4 מ 'או ניצול משאבת peristaltic מוגדרת כ 15 מיליליטר / דקה. תוצאות זלוף אופטימליות במוח לבן חיוור בלי כלי דם אדומים להיות גלויים.
3. לנתח ולאחר לתקן את מוחם בparaformaldehyde 4% ב-C ° 4 ל24 שעות.
4. Cryoלהגן על המוח בסוכרוז 30% PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות 24 שעות.
5. להקפיא את המוח על הבמה cryotome.
6. הכן 40 מיקרומטר סעיפים אופקיים מכל forebrains באמצעות cryotome מתאים.
7. ניתן לאחסן את השקופיות בפתרון cryoprotectant (M 0.1 חיץ פוספט, גליצרול 50%, 0.14% MgCl _2, סוכרוז 8.6%) ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

6. אימונוהיסטוכימיה של חלקים במוח של בעלי חיים Nonperfused

1. פוסט לתקן את cryosections, שהוכן כפי שתואר לעיל, תוך שימוש במתנול קר -20 ° C עבור 10 דקות.
2. לחסום עם 5% בסרום נורמלי המכיל 0.3% Triton-X (מהמינים ששימשו לגיוס הנוגדנים משני) לילה בשעה 4 ° C.
3. יש לשטוף 3x עם 1x PBS ו דגירה עם נוגדנים ראשוניים הלילה בשעה 4 ° C.
4. יש לשטוף 3x עם 1x PBS ו דגירה עם נוגדנים משני בטמפרטורת חדר במשך שעה אחת.
5. יש לשטוף 3x עם 1x PBS
6. Counterstain הקטע עבור ה-DNA באמצעות ירוק Sytox, או DAPI (או לצבוע DNA אלטרנטיבי).
7. יש לשטוף 3x עם 1x PBS
8. להטביע את החלקים במדיום מימיים הטבעה.
9. בואו מדיום הטבעת פלמר לפחות 48 שעות.

7. אימונוהיסטוכימיה של חלקים במוח של בעלי חיים perfused

1. בלוק כמתואר בשלב 6.2 ולאחר מכן דגירה הסעיפים הקבועים במוח בפתרון נוגדן ראשוני המדוללים PBS המכילים 0.3% Triton-X (חופשי צף) הלילה ב 4 ° C.
2. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS ו דגירה בפתרון נוגדנים משני המדולל PBS המכיל 0.3% Triton-X (חופשי משתנה) בטמפרטורת חדר למשך 3 שעות.
3. יש לשטוף 3x עם 1x PBS
4. Counterstain הקטע עבור ה-DNA באמצעות Sytox ירוק או DAPI (או לצבוע DNA אלטרנטיבי).
5. יש לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS
6. להטביע את החלקים במדיום מימיים הטבעה.
7. בואו מדיום הטבעת פלמר עבור48 שעות לא המעט.

8. חקירה של תחזיות טחבי סיבים

1. להקריב בעלי החיים, להכין 40 מיקרומטר סעיפי העטרה כפי שתואר לעיל ולהכתים את הסעיף בהיפוקמפוס באמצעות נוגדן לneurofilament מ '
2. סרוק את הקטעים באורך הגל המתאים באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה לדמיין סיבי אזובי וגרעינים. התחל את הסריקה בהגדלה נמוכה.
3. השתמש בתמונות בהגדלה הנמוכה להתמצאות ולמקד את ההיפוקמפוס עם תחזיות אזובי סיבים.
4. סרוק את הסעיפים (Z-חתך) ברזולוציה גבוהה והגדלה גבוהה.
5. נתח את המראה ואת קישוריות מורפולוגיות של סיבי אזובי דמיינו באמצעות צביעה לNF-M.
6. (אופציונלי) נתח את הגודל ונפח של להבים בהיפוקמפוס. השתמש באות ה-DNA למדידות.

9. Fluoro-Jade C Assay (מות תאים עצבי)

1. להקריב בעלי החיים, לנתח את hippocampus, ולהכין 12 מיקרומטר סעיפים כפי שתואר לעיל.
2. בואו הסעיפים להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
3. לתקן את הסעיפים בPFA 4% ל40 דקות בטמפרטורת חדר.
4. בקצרה לשטוף את החלקים 3X עם DDH ₂ O.
5. דגירה החלקים עם 0.06% permanganate אשלגן ₍₄ KMnO) עבור 10 דקות תחת טלטול מתמשך, עדין.
6. שטפו את החלקים 3x עם DDH ₂ O.
7. דגירה החלקים עם 0.002% פתרון C Fluoro-Jade עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר.
8. לstainings הגרעיני בו זמנית, פתרון 0.002% Fluoro-Jade C יכול להיות בתוספת (אופציונלי) עם 10 DAPI מיקרוגרם / מיליליטר.
9. בקצרה לשטוף את החלקים 3X עם DDH ₂ O.
10. בואו הסעיפים להתייבש במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
11. דגירה החלקים עם קסילן (1 דקות)
12. הר את החלקים באמצעות מדיום המבוסס על קסילן הרכבה (DPX).

תוצאות

הכלאות של IκB / - קווי העכבר מהונדסים וTTA מובילה לעיכוב מותנה של פעילות NF-κB בהיפוקמפוס.

כדי לחקור את הביטוי של IκBα--1AA-transgene בעכבר (איור 1 א) המהונדס הכפול, המוח היו מבודד, cryosectioned ומוכתם באמצעות נוגדן כנגד GFP (חלבון פל?...

Discussion

neurogenesis למבוגרים, ואת האפשרות של המניפולציה שלה באמצעות עיכוב של NF-κB בתאי עצב, ומאוחר יותר מחדש שלה באמצעות דוקסיציקלין, מציע מערכת מרתקת לחקירות לנוירונים יילוד במוח הבוגר, כמו גם לדה ודור מחדש עצבי . היופי של השיטה הזו הוא שעיכוב מסלול איתות NF-κB בנוירונים תוצאות לא ר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining