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Method Article
Os métodos para a manipulação e análise de NF-kB-dependente neurogenesis adulto hipocampo são descritos. Um protocolo detalhado é apresentado para o teste de comportamento dependente do giro dentado (denominado o padrão de separação espacial-Barnes labirinto) para a investigação dos resultados cognitivos em ratos. Esta técnica também deve ajudar a permitir investigações em outras configurações experimentais.
O hipocampo desempenha um papel fundamental na formação e consolidação de memórias episódicas, e na orientação espacial. Historicamente, o hipocampo adulto foi visto como uma região anatómica muito estático do cérebro de mamíferos. No entanto, resultados recentes demonstraram que o giro denteado do hipocampo é uma área de grande plasticidade em adultos, que envolva não apenas modificações de circuitos neuronais existentes, mas também a neurogénese adulto. Esta plasticidade é regulada por redes complexas de transcrição, em que o factor de transcrição NF-kB desempenha um papel proeminente. Para estudar e manipular neurogenesis adulto, um modelo de ratinho transgénico para-específica do cérebro anterior inibição neuronal da actividade de NF-kB pode ser usado.
Neste estudo, são descritos métodos para a análise da neurogénese NF-kB-dependentes, incluindo os seus aspectos estruturais, apoptose neuronal e a proliferação de células progenitoras, e significância cognitiva, which foi especificamente avaliada através de um giro denteado (DG) dependente teste comportamental, o padrão de separação espacial-Barnes labirinto (SPS-BM). O protocolo SPS-BM poderia ser simplesmente adaptados para uso com outros modelos animais transgênicos destinados a avaliar a influência de genes específicos em neurogênese adulta. Além disso, o SPS-BM poderia ser usado em outras configurações experimentais com vista a investigar e manipular aprendizagem DG-dependentes, por exemplo, por meio de agentes farmacológicos.
Ontologicamente, o hipocampo é um dos mais antigos estruturas anatómicas cerebrais conhecidos. Ele é responsável por diversas tarefas complexas, tais como funções fundamentais na regulação da memória de longo prazo, a orientação espacial ea formação e consolidação da respectiva memória. Anatomicamente, o hipocampo é constituído por camadas de células piramidais (estrato piramidal), incluindo o cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, e CA4) e regiões do giro dentado (gyrus dentatus), que contém as células granulares e alguns progenitores neuronais dentro da sua zona subgranular . As células granulares projectar em direcção à região CA3 através das ditas fibras musgosas (axónios de células granulares).
Até o final do século passado, cérebro de mamíferos adultos se acreditava ser um órgão estático falta plasticidade celular e neurogênese. No entanto, durante as duas últimas décadas, uma quantidade crescente de evidências demonstra claramente a neurogênese adulta ocorrendo em pelo menosduas regiões do cérebro, da zona subventricular (SVZ) e a zona subgranular do hipocampo.
Nossos estudos anteriores, e das de outros grupos, têm mostrado que o fator de transcrição NF-kB é um dos reguladores moleculares cruciais da neurogênese adulta, e que os seus resultados de-regulação em defeitos estruturais do hipocampo graves e deficiências cognitivas 1-6. NF-B é o nome genérico de um factor de transcrição indutível composto por diferentes combinações diméricos de cinco subunidades de ligação ao ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), o último dos quais tem três domínios de transactivação. Dentro do cérebro, a forma mais abundante encontrada no citoplasma é um heterodímero de p50 e p65, que é mantido sob uma forma inactiva, por inibidor de kappa B (IkB)-proteínas.
Para estudar e manipular diretamente neurogênese NF-kB-driven, usamos modelos de camundongos transgênicos para permitir simples inibição de toda a subun NF-kBsua, especificamente no cérebro anterior 7 (ver Figura 1). Para este fim, nós Cruzado as seguintes linhas camundongo transgênico, IkB / - e -/tTA. O transgênico IkB / - linha foi gerada usando um mutante negativo trans-dominante do NF-kB-inibidor IκBa (super-repressor IκBa-AA1) 8. Em contraste com o do tipo selvagem IκBα, IκBα-AA1 tem dois resíduos de serina mutados para alaninas (V32 e V36), os quais impedem a fosforilação e subsequente degradação proteosomal do inibidor. Para prosencéfalo expressão específica do neurônio do IκBa-AA1-transgene, IkB / - ratos foram cruzadas com ratos abrigar uma quinase cálcio-calmodulina-dependente IIα (CAMKIIα)-promotor que pode ser conduzido por tetraciclina trans-ativador (ATT) 9.
p65 camundongos knock-out ter um fenótipo letal embrionário, devido à maciça apoptose hepática 10, então a abordagem mostrada aqui fornece um método elegantepara investigar o papel do NF-kB em pós-natal e neurogênese adulta.
O teste comportamental clássica para estudar a aprendizagem espacial ea memória foi descrita em 1980 por Richard Morris, um teste conhecido como a água-labirinto Morris (MWM) 11. Neste campo aberto água-labirinto, os animais aprendem a escapar da água opaca sobre uma plataforma escondida com base na orientação e extra-labirinto pistas. Uma variante de seco da MWM é o chamado labirinto Barnes (BM) 12. Este teste utiliza uma placa circular com 20 orifícios circulares dispostas na fronteira de uma placa com um furo definida como uma caixa de fuga, e visuais pistas extra-labirinto de orientação. Ambos os paradigmas experimentais dependem do comportamento de fuga induzido por um roedor `s aversão à água, ou espaços abertos, brilhantemente iluminados. Ambos os testes permitem que uma investigação de orientação espacial, eo desempenho da memória relacionada. Embora o hipocampo desempenha um papel em geral e fundamental na formação da memória espacial, o hipocampo rEGIÕES envolvidos diferem dependendo do teste aplicado. A memória testada em BM surge da atividade neuronal entre o córtex enthorinal (CE) e os neurônios piramidais localizados no CA1-região do hipocampo, sem uma contribuição da DG 13-16. Em particular, o clássico BM depende principalmente da sua navegação através da via temporo-ammonic monossináptico de CE III CA1 para CE V. Mais importante, o DG é crucialmente envolvido no chamado reconhecimento do padrão espacial 17, o que implica não só o tratamento de informação visual e espacial, mas também a transformação das representações ou memórias semelhantes em diferentes representações, não sobrepostas. Esta tarefa exige um circuito tri-sináptico funcional do CE II DG para CA3 para CA1 e CE VI, que não podem ser testados na BM 15.
Para enfrentar esses desafios, nós planejamos SPS-BM como um teste comportamental para testar especificamente o desempenho cognitivo denteado dependente de giro em control animais, e no modelo de super-repressora de IkB / tTA a inibição do NF-kB. Importante, em contraste com a MWM ou o BM, o SPS-BM pode revelar déficits comportamentais sutis resultantes da diminuição da neurogênese. Desde espacial-padrão de separação é estritamente dependentes de um circuito funcional entre EC II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, este teste é altamente sensível a mudanças potenciais na neurogênese, modificações da via fibra de musgo ou alterações de homeostase do tecido dentro do DG.
Tecnicamente, a configuração do nosso teste baseia-se no estudo de Clelland et al., Em que o padrão de separação espacial foi testado utilizando uma madeira de 8 braços do labirinto radial do braço (RAM) 19. Em nossa modificado set-up, os oito braços foram substituídos por sete casas amarelas idênticas alimentos. Em resumo, os métodos mostrados aqui, incluindo a análise de células que expressam doublecortin (DCX +) dentro do hipocampo, as projeções de fibras musgosas, neuronal de células deatletas e, particularmente, o SPS-BM apresentado aqui, pode ser aplicado a investigações de outros modelos de mouse incorporando transgenes que têm um impacto sobre a neurogênese adulta. Outras aplicações podem incluir o estudo de agentes farmacológicos e medir o seu impacto sobre a separação padrão DG e espacial.
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Declaração de Ética
Este estudo foi realizado em estrita conformidade com os regulamentos do animal e uso de cuidados comitê governamental, LANUV do estado Renânia do Norte-Vestfália, (Düsseldorf, Alemanha). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo LANUV, Düsseldorf sob o número de licença 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento e o número de animais necessários para o estudo.
1. Animal Care e Habitação
2. Padrão espacial Separação-Barnes Maze (SPS-BM)
3. BrdU Labeling
4. Remoção dos cérebros e Preparação de Cortes congelados de Nonperfused Animais
5. Preparação das Seções de perfusão Animais
6. Imunohistoquímica de seções do cérebro de Nonperfused Animais
7. Imunohistoquímica de seções do cérebro de animais perfundidos
8. Investigação de Projeções Mossy Fibra
9. Fluoro-Jade C Assay (Neuronal morte celular)
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-Cruzamento das IkB / - linhas de camundongo transgênico e tTA leva à inibição condicional da atividade de NF-kB no hipocampo.
Para investigar a expressão de a-AA1-IκBα transgene no ratinho transgénico duplo (Figura 1A), os cérebros foram isolados, cryosectioned e coradas utilizando um anticorpo contra a GFP (proteína fluorescente verde). A microscopia de varrimento de laser confocal revelou elevada expressão do transgene nas regiões CA1 e CA3, e...
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Neurogênese adulta, ea possibilidade de sua manipulação através da inibição do NF-kB nos neurônios, e sua reativação posterior através doxiciclina, oferece um sistema fascinante para as investigações sobre os neurônios recém-nascidos no cérebro adulto, bem como em neuronal de-e re-geração . A beleza desse sistema é que a inibição de NF-kB via de sinalização nos neurônios não só resulta em mudanças na morte neuronal, proliferação e migração de células progenitoras, e as mudanças estruturai...
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Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecemos Angela Kralemann-Köhler para excelente suporte técnico. O trabalho experimental aqui descrito foi realizado em nosso laboratório e foi apoiado por subsídios do Conselho Alemã de Pesquisa (DFG) para CK e BK e uma concessão do Ministério alemão da Educação e Pesquisa (BMBF) para BK.
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Moria MC17 Perforated Spoon | FST | 10370-18 | removal of the brains |
Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi SV8 | removal of the brains |
Surgical scissors | FST | 14084-08 | removal of the brains |
Surgical scissors | FST | 14381-43 | removal of the brains |
Dumont #5 forceps | FST | 11254-20 | removal of the brains |
SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | slides for immunohistochemistry |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | fixative |
TissueTek OCT compound | Sakura Finetek | 1004200018 | embedding of the brains |
Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | blocking in IHC |
Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | blocking in IHC |
Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | blocking in IHC |
anti-Neurofilament-M antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, Dilution 1:200 |
anti-Doublecortin antibody | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, Dilution 1:800 |
anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | IHC, Dilution 1:2,000 |
anti-BrdU antibody | OBT0030G | Accurate Chemicals | IHC, Dilution 1:2,000 |
Fluoro-Jade C | FJ-C | HistoChem | Determination of neuronal cell death |
Betadine | Mundipharma | D08AG02 | disinfectant |
Cryomicrotome | Leica | CM1900 | preparation of brain slices |
Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | perfusion |
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm) | lab made | none | plate for SPS-BM, diameter 120 cm |
Buraton rapid disinfectant | Schülke Mayr | 113 911 | disinfectant |
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2 | TSE Systems | 302050-SW-KIT | tracking and analysis of SPS-BM |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | permeabilization/IHC |
Cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | preparation of 40 µm brain slices |
Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | embedding of the slides |
SYTOX green | Invitrogen | S7020 | Nuclear staining |
Food pellets (Kellog`s Froot Loops) | Kellog`s | SPS-BM | |
Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | Statistical evaluation of SPS-BM | |
Zen 2008 or Zen 2011 Software | Carl Zeiss | Software (Confocal microscope) | |
D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | mounting medium for Fluoro-Jade C staining |
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