Os métodos para a modulação e Análise de NF-kB-dependente Adulto Neurogenesis

Resumo

Os métodos para a manipulação e análise de NF-kB-dependente neurogenesis adulto hipocampo são descritos. Um protocolo detalhado é apresentado para o teste de comportamento dependente do giro dentado (denominado o padrão de separação espacial-Barnes labirinto) para a investigação dos resultados cognitivos em ratos. Esta técnica também deve ajudar a permitir investigações em outras configurações experimentais.

Resumo

O hipocampo desempenha um papel fundamental na formação e consolidação de memórias episódicas, e na orientação espacial. Historicamente, o hipocampo adulto foi visto como uma região anatómica muito estático do cérebro de mamíferos. No entanto, resultados recentes demonstraram que o giro denteado do hipocampo é uma área de grande plasticidade em adultos, que envolva não apenas modificações de circuitos neuronais existentes, mas também a neurogénese adulto. Esta plasticidade é regulada por redes complexas de transcrição, em que o factor de transcrição NF-kB desempenha um papel proeminente. Para estudar e manipular neurogenesis adulto, um modelo de ratinho transgénico para-específica do cérebro anterior inibição neuronal da actividade de NF-kB pode ser usado.

Neste estudo, são descritos métodos para a análise da neurogénese NF-kB-dependentes, incluindo os seus aspectos estruturais, apoptose neuronal e a proliferação de células progenitoras, e significância cognitiva, which foi especificamente avaliada através de um giro denteado (DG) dependente teste comportamental, o padrão de separação espacial-Barnes labirinto (SPS-BM). O protocolo SPS-BM poderia ser simplesmente adaptados para uso com outros modelos animais transgênicos destinados a avaliar a influência de genes específicos em neurogênese adulta. Além disso, o SPS-BM poderia ser usado em outras configurações experimentais com vista a investigar e manipular aprendizagem DG-dependentes, por exemplo, por meio de agentes farmacológicos.

Introdução

Ontologicamente, o hipocampo é um dos mais antigos estruturas anatómicas cerebrais conhecidos. Ele é responsável por diversas tarefas complexas, tais como funções fundamentais na regulação da memória de longo prazo, a orientação espacial ea formação e consolidação da respectiva memória. Anatomicamente, o hipocampo é constituído por camadas de células piramidais (estrato piramidal), incluindo o cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3, e CA4) e regiões do giro dentado (gyrus dentatus), que contém as células granulares e alguns progenitores neuronais dentro da sua zona subgranular . As células granulares projectar em direcção à região CA3 através das ditas fibras musgosas (axónios de células granulares).

Até o final do século passado, cérebro de mamíferos adultos se acreditava ser um órgão estático falta plasticidade celular e neurogênese. No entanto, durante as duas últimas décadas, uma quantidade crescente de evidências demonstra claramente a neurogênese adulta ocorrendo em pelo menosduas regiões do cérebro, da zona subventricular (SVZ) e a zona subgranular do hipocampo.

Nossos estudos anteriores, e das de outros grupos, têm mostrado que o fator de transcrição NF-kB é um dos reguladores moleculares cruciais da neurogênese adulta, e que os seus resultados de-regulação em defeitos estruturais do hipocampo graves e deficiências cognitivas ^1-6. NF-B é o nome genérico de um factor de transcrição indutível composto por diferentes combinações diméricos de cinco subunidades de ligação ao ADN: p50, p52, c-Rel, RelB, e p65 (RelA), o último dos quais tem três domínios de transactivação. Dentro do cérebro, a forma mais abundante encontrada no citoplasma é um heterodímero de p50 e p65, que é mantido sob uma forma inactiva, por inibidor de kappa B (IkB)-proteínas.

Para estudar e manipular diretamente neurogênese NF-kB-driven, usamos modelos de camundongos transgênicos para permitir simples inibição de toda a subun NF-kBsua, especificamente no cérebro anterior ⁷ (ver Figura 1). Para este fim, nós Cruzado as seguintes linhas camundongo transgênico, IkB / - e -/tTA. O transgênico IkB / - linha foi gerada usando um mutante negativo trans-dominante do NF-kB-inibidor IκBa (super-repressor IκBa-AA1) ^8. Em contraste com o do tipo selvagem IκBα, IκBα-AA1 tem dois resíduos de serina mutados para alaninas (V32 e V36), os quais impedem a fosforilação e subsequente degradação proteosomal do inibidor. Para prosencéfalo expressão específica do neurônio do IκBa-AA1-transgene, IkB / - ratos foram cruzadas com ratos abrigar uma quinase cálcio-calmodulina-dependente IIα (CAMKIIα)-promotor que pode ser conduzido por tetraciclina trans-ativador (ATT) ^9.

p65 camundongos knock-out ter um fenótipo letal embrionário, devido à maciça apoptose hepática ^10, então a abordagem mostrada aqui fornece um método elegantepara investigar o papel do NF-kB em pós-natal e neurogênese adulta.

O teste comportamental clássica para estudar a aprendizagem espacial ea memória foi descrita em 1980 por Richard Morris, um teste conhecido como a água-labirinto Morris (MWM) ^11. Neste campo aberto água-labirinto, os animais aprendem a escapar da água opaca sobre uma plataforma escondida com base na orientação e extra-labirinto pistas. Uma variante de seco da MWM é o chamado labirinto Barnes (BM) ^12. Este teste utiliza uma placa circular com 20 orifícios circulares dispostas na fronteira de uma placa com um furo definida como uma caixa de fuga, e visuais pistas extra-labirinto de orientação. Ambos os paradigmas experimentais dependem do comportamento de fuga induzido por um roedor `s aversão à água, ou espaços abertos, brilhantemente iluminados. Ambos os testes permitem que uma investigação de orientação espacial, eo desempenho da memória relacionada. Embora o hipocampo desempenha um papel em geral e fundamental na formação da memória espacial, o hipocampo rEGIÕES envolvidos diferem dependendo do teste aplicado. A memória testada em BM surge da atividade neuronal entre o córtex enthorinal (CE) e os neurônios piramidais localizados no CA1-região do hipocampo, sem uma contribuição da DG ^13-16. Em particular, o clássico BM depende principalmente da sua navegação através da via temporo-ammonic monossináptico de CE III CA1 para CE V. Mais importante, o DG é crucialmente envolvido no chamado reconhecimento do padrão espacial ^17, o que implica não só o tratamento de informação visual e espacial, mas também a transformação das representações ou memórias semelhantes em diferentes representações, não sobrepostas. Esta tarefa exige um circuito tri-sináptico funcional do CE II DG para CA3 para CA1 e CE VI, que não podem ser testados na BM ^15.

Para enfrentar esses desafios, nós planejamos SPS-BM como um teste comportamental para testar especificamente o desempenho cognitivo denteado dependente de giro em control animais, e no modelo de super-repressora de IkB / tTA a inibição do NF-kB. Importante, em contraste com a MWM ou o BM, o SPS-BM pode revelar déficits comportamentais sutis resultantes da diminuição da neurogênese. Desde espacial-padrão de separação é estritamente dependentes de um circuito funcional entre EC II e DG e CA3 e CA1 e CE VI, este teste é altamente sensível a mudanças potenciais na neurogênese, modificações da via fibra de musgo ou alterações de homeostase do tecido dentro do DG.

Tecnicamente, a configuração do nosso teste baseia-se no estudo de Clelland et al., Em que o padrão de separação espacial foi testado utilizando uma madeira de 8 braços do labirinto radial do braço (RAM) ^19. Em nossa modificado set-up, os oito braços foram substituídos por sete casas amarelas idênticas alimentos. Em resumo, os métodos mostrados aqui, incluindo a análise de células que expressam doublecortin (DCX +) dentro do hipocampo, as projeções de fibras musgosas, neuronal de células deatletas e, particularmente, o SPS-BM apresentado aqui, pode ser aplicado a investigações de outros modelos de mouse incorporando transgenes que têm um impacto sobre a neurogênese adulta. Outras aplicações podem incluir o estudo de agentes farmacológicos e medir o seu impacto sobre a separação padrão DG e espacial.

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Protocolo

Declaração de Ética

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com os regulamentos do animal e uso de cuidados comitê governamental, LANUV do estado Renânia do Norte-Vestfália, (Düsseldorf, Alemanha). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo LANUV, Düsseldorf sob o número de licença 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento e o número de animais necessários para o estudo.

1. Animal Care e Habitação

1. Todos os animais utilizados nos protocolos aqui descritos devem ser mantidos em condições livres de patógenos específicos, conforme definido pela Associação Federação Europeia Laboratory Animal Science (FELASA).
2. Os ratos devem ser mantidos em gaiolas padrão numa sala de temperatura e humidade controladas (22 ° C) sob condições diurnas (12 horas de luz / escuridão) com ar filtrado HEPA.
3. Comida padronizada e água devem ser fornecidas ad libitum.
4. Se IkB / tTA e IkB / - murganhos de controlo são utilizados, genotipagem baseada em PCR deve ser efectuada para cada animal, tal como descrito em ^{7, 18.}
5. Animais do sexo masculino com uma diferença de idade de menos de quatro dias devem ser usadas para reduzir a variabilidade individual.
6. (Opcional): Para as experiências de reactivação de NF-kB, a doxiciclina pode ser administrado na água de beber (2 mg / ml com 2,5% de sacarose) durante pelo menos 14 dias.

2. Padrão espacial Separação-Barnes Maze (SPS-BM)

1. Todos os testes de comportamento deve ser realizada de acordo com as diretrizes internacionais e locais.
2. IMPORTANTE! Use apenas camundongos machos com idade de seis meses ou mais. A diferença de idade entre os animais de uma série de testes deve ser inferior a quatro dias. O teste deve ser realizado pelo mesmo operador para cada uma das séries. Os ratos devem receber uma dieta padrão antes do teste para aumentar ainda mais a motivação parcialmente conduzido por quantorecompensa alimentar weet.
3. Defina-se uma placa circular branco feito de plástico duro (120 centímetros de diâmetro, ver Figura 5A) em um e humidade ambiente com temperatura controlada (22 ° C), iluminado com pelo menos 4 x 80 W e 3 x 215 lâmpadas fluorescentes W néon . IMPORTANTE! Garantir a iluminação correta é usado, como a motivação dos ratos para entrar nas casas dos alimentos é parcialmente impulsionado por sua aversão a brilhantes, locais expostos.
4. Configure o sistema de vídeo-monitoramento. A câmara deve ser colocado 115 centimetros acima do centro da placa (ver Figura 5A).
5. Anexar multicoloridas pistas extra-labirinto (CEM) em um pano de cor branca em posições facilmente visíveis para os animais, cerca de 100 cm da borda da placa (ver Figura 5A).
6. Limpe cuidadosamente a placa com um desinfectante rápido que pode remover qualquer odor do experimental set-up.
7. Coloque sete casas idênticas amarelas de alimentos (12 cm x 7 cm x 8 cm, ver Figura 5A ) na placa branca. As posições devem ser marcadas de forma inequívoca (ver Figura 5A).
8. Coloque doces recompensas da pelota de alimentos (um quarto de uma casa Froot Curva / comida Kellogs `s) dentro de todas as casas de comida em posições definidas (ver Figura 5A), com apenas uma casa comida definido ser de livre acesso ao animal (localização F, ver figura 5A ). Feche as casas de alimentos não-alvo com folha transparente.
9. Antes do ensaio, realizar habituação (um dia antes de iniciar o trabalho). Fazer todos os estabelecimentos de comida livremente acessível e permitir que os ratinhos a explorar livremente o labirinto e para recuperar uma recompensa alimentar pelete (10 min / animal).
10. Ligue o computador ea câmara e iniciar o software do sistema de vídeo-monitoramento.
11. Inicie a gravação.
12. Colocar o animal no ponto inicial definida na placa circular (Figura 5A, S: a posição de partida) e permitir que os ratinhos procurar a casa comida alvo durante 10 min.
13. Stop-tracking o vídeo.
14. IMPORTANTE! Limpe a placa circular e as casas de comida depois de cada ensaio com desinfectante rápido.
15. Repetir o teste diariamente durante sete dias consecutivos (por cada animal).
16. Analisar os resultados (latência, distância percorrida e erros) usando o software estatísticas apropriadas. Definir erros como se aproximar da casa comida errada e / ou contato com a caixa adequada, sem entrar e recuperar a recompensa pellet alimentos. Para a análise agrupada usar two-way ANOVA com teste post-hoc de Bonferroni.
17. (OPCIONAL) Sacrifício dos ratinhos e analisar o hipocampo, como descrito abaixo.

3. BrdU Labeling

1. Injectar por via intraperitoneal de 50 mg / kg ip de BrdU uma vez por dia durante 3 dias (análise de diferenciação e integração) ou ip de 200 mg / kg para uma única injecção (análise de proliferação).
2. Sacrifício dos animais, dissecar o hipocampo e preparar 40 mM secções, conforme descrito abaixo.
3. Desnaturar asecções com 2 M de HCl durante 10 minutos e incubar em tampão de borato 0,1 M durante 10 min.
4. Rotular uma série de um em doze dos 40 mM secções (240 uM) para além de cada animal imuno-histoquímica, tal como descrito a seguir, utilizando anticorpos dirigidos contra a BrdU.
5. Quantificar as células marcadas por análise de microscopia confocal em toda a extensão do rostro-caudal da camada de células granulares e zona subgranular. Multiplica os números resultantes por 12 para obter o número total estimado de células marcadas com BrdU por hipocampo e dividir por dois, para obter o número total de células marcadas por DG.

4. Remoção dos cérebros e Preparação de Cortes congelados de Nonperfused Animais

1. Observe os procedimentos aprovados localmente para eutanásia de animais. Os ratinhos podem ser directamente submetidos à eutanásia por deslocamento cervical.
2. (Opcional) Os animais podem ser anestesiados antes de eutanásia de acordo com as diretrizes nacionais e internacionais, por exemplo, inje intraperitonealcção de 0,8 ml Avertin para um 33 g de rato (feito recentemente pela mistura de 150 ml de solução estoque feito de 2,2 mg de 2,2,2-tribromoetanol em 1 ml de etanol isoamyl com 1,85 ml de tampão de soro fisiológico ou).
3. Esterilizar a cabeça com Betadine (10% iodopovidona)-gaze embebida e cotonete posteriormente com gaze embebida em álcool 70%.
4. Decapitar o animal usando uma tesoura cirúrgica apropriados e puxar a pele de lado.
5. (Opcional) Fixadores pode ser aplicada para evitar a dobragem para trás da pele retardado.
6. Faça uma incisão na linha média no crânio e puxe cuidadosamente os fragmentos do crânio de lado.
7. Retire cuidadosamente todo o cérebro através de um instrumento cirúrgico apropriado (por exemplo, Moria Colher).
8. Precool 25 ml de 2-metilbutano numa proveta de 50 ml (por exemplo, Duran de Schott) a -30 a -40 ° C em gelo seco.
   Nota: Para a coloração de livre flutuação das seções "grossas", que são ideais para a microscopia confocal a laser, remova cérebro, lavar 3vezes, em tampão e armazenar a 4 ° C em tampão fosfato solução de sacarose a 30% em 50 ml tubo até cérebro afundado para baixo (tipicamente durante a noite).
9. Com cuidado, coloque cérebro em um pedaço de Nescofilm (Parafilm) e cubra com uma ampla quantidade de composto TissueTek outubro, congelar em Nescofilm em 2-metilbutano, armazenar a -80 ° C até o uso.
   Nota: Para o armazenamento de longo prazo a -20 ° C em armazenamento de 9% de sacarose, 7 mM de _MgCl2, 50 mM de tampão fosfato, 44% de glicerol.
10. Corte o cérebro em 10-12 mm de espessura sobre cryomicrotome apropriado.
    Nota: Para, seções flutuantes grossas, congelar cérebro em cryotome fase de cryotome apropriado (por exemplo Reichert Jung, Frigomobil.) E corte 40 mM seções horizontais a -20 ° e - 25 ° C. Colete seções de faca com pincel fino e recolher em tampão ou manter em solução de armazenamento (passo 4.9) a -20 ° C para armazenamento de longo prazo.
11. Monte cuidadosamente duas fatias em lâminas de microscópio simples. A nóse de lâminas Superfrost Ultraplus é altamente recomendado para maximizar a adesão das seções.
12. Secam-se as lâminas durante 5 min à temperatura ambiente. As lâminas podem ser armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

5. Preparação das Seções de perfusão Animais

1. Anestesiar os animais como descrito acima (passo 4.2).
2. Aspergir cuidadosamente o animal transcardialmente com tampão fosfato salino (PBS) contendo heparina (0,025 g/100 ml de PBS) e procaína (0,5 g/100 ml de PBS) durante 2-4 min, seguido por paraformaldeído a 4% em PBS durante 10-15 min . A perfusão é optimamente realizada irrigando através do ventrículo esquerdo e abertura do átrio direito com uma pressão hidrostática de cerca de 1,2-1,4 m ou utilizando uma bomba peristáltica definido para aproximadamente 15 ml / min. Resultados de perfusão ideal em um cérebro branco pálido, sem vasos sanguíneos vermelhos sendo visível.
3. Dissecar e pós-corrigir os cérebros em paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante 24 hr.
4. Cryoproteger os cérebros em 30% de sacarose em PBS a 4 ° C durante pelo menos 24 horas.
5. Congelar os cérebros no palco cryotome.
6. Prepare 40 mM seções horizontais de forebrains inteiras usando uma cryotome apropriado.
7. As lâminas podem ser armazenadas em solução de crioprotector (tampão fosfato 0,1 M, 50% glicerol, 0,14% de MgCl _2, 8,6% de sacarose), a -20 ° C até à sua utilização.

6. Imunohistoquímica de seções do cérebro de Nonperfused Animais

1. Pós-corrigir os criocortes, preparadas como descrito acima, usando -20 ° C metanol frio durante 10 min.
2. Bloco com 5% de soro normal contendo 0,3% de Triton-X (a partir das espécies que foram utilizados para aumentar o anticorpo secundário) durante a noite a 4 ° C.
3. Lavar 3x com PBS 1x e incubar com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C.
4. Lavar 3x com PBS 1x e incubar com anticorpos secundários, à temperatura ambiente durante uma hora.
5. Lavar 3x com PBS 1x
6. Counterstain seção de DNA usando SYTOX verde, ou DAPI (ou um corante DNA alternativa).
7. Lavar 3x com PBS 1x
8. Incorporar as seções em um meio aquoso a incorporação.
9. Deixe o meio incorporar polimerizar por pelo menos 48 horas.

7. Imunohistoquímica de seções do cérebro de animais perfundidos

1. Bloco tal como descrito no passo 6.2 e subsequentemente incuba-se as secções de cérebro fixadas em solução de anticorpo primário diluído em PBS contendo 0,3% de Triton-X (flutuante) durante a noite a 4 ° C.
2. Lavar três vezes com PBS 1x e incubar em solução de anticorpo secundário diluído em PBS contendo 0,3% de Triton-X (livre flutuante) à temperatura ambiente durante 3 hr.
3. Lavar 3x com PBS 1x
4. Contracorante seção de DNA usando SYTOX verde ou DAPI (ou um corante DNA alternativa).
5. Lavar três vezes com PBS 1x
6. Incorporar as seções em um meio aquoso a incorporação.
7. Deixe o meio de fixação para polimerizar umt menos de 48 horas.

8. Investigação de Projeções Mossy Fibra

1. Sacrifício dos animais, preparar 40 mM secções coronais como descritos acima e manchar a secção de hipocampo utilizando o anticorpo para neurofilamento M.
2. Digitalizar as seções no comprimento de onda apropriado, usando um microscópio de varredura a laser confocal para visualizar fibras musgosas e núcleos. Inicie a digitalização em baixa ampliação.
3. Utilize as imagens de baixa ampliação para orientação e atingir o hipocampo com as projeções de fibras musgosas.
4. Digitalize as seções (z-seccionamento) em alta resolução e alta ampliação.
5. Analisar o aspecto morfológico e conectividade das fibras musgosas visualizadas através de coloração para NF-M.
6. (OPCIONAL) Analisar o tamanho e volume de lâminas do hipocampo. Usar o sinal de ADN para as medições.

9. Fluoro-Jade C Assay (Neuronal morte celular)

1. Sacrificar os animais, dissecar o hippocAmpus, e preparar 12 mM secções como descritos acima.
2. Deixe as secções de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
3. Corrigir as seções em PFA 4% por 40 min em temperatura ambiente.
4. Lava-se rapidamente as secções 3 vezes com ddH ₂ O.
5. Incubar as seções com 0,06% de permanganato de potássio (KMnO ₄₎ por 10 min sob contínua agitação suave.
6. Lavar as seções 3x com DDH ₂ O.
7. Incubar as secções com 0,002% Fluoro-Jade solução C, durante 20 minutos à temperatura ambiente.
8. (Opcional) para colorações nucleares simultâneas, uma solução de 0,002% Fluoro-Jade C pode ser suplementado com 10 ug / ml de DAPI.
9. Lava-se rapidamente as secções 3 vezes com ddH ₂ O.
10. Deixe as secções de secar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
11. Incubar as seções com xileno (1 min)
12. Monte as seções usando um meio de montagem com base em xileno (DPX).

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Resultados

-Cruzamento das IkB / - linhas de camundongo transgênico e tTA leva à inibição condicional da atividade de NF-kB no hipocampo.

Para investigar a expressão de a-AA1-IκBα transgene no ratinho transgénico duplo (Figura 1A), os cérebros foram isolados, cryosectioned e coradas utilizando um anticorpo contra a GFP (proteína fluorescente verde). A microscopia de varrimento de laser confocal revelou elevada expressão do transgene nas regiões CA1 e CA3, e...

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Discussão

Neurogênese adulta, ea possibilidade de sua manipulação através da inibição do NF-kB nos neurônios, e sua reativação posterior através doxiciclina, oferece um sistema fascinante para as investigações sobre os neurônios recém-nascidos no cérebro adulto, bem como em neuronal de-e re-geração . A beleza desse sistema é que a inibição de NF-kB via de sinalização nos neurônios não só resulta em mudanças na morte neuronal, proliferação e migração de células progenitoras, e as mudanças estruturai...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining