Методы модуляции и анализа NF-kB-зависимой нейрогенез

Резюме

Методы манипуляции и анализа NF-kB-зависимой взрослых гиппокампа нейрогенеза описаны. Подробный протокол представлен на зубчатой ​​извилине зависит от поведения теста (называется пространственной структуры разделения-Barnes лабиринт) для исследования когнитивного тестирования на мышах. Эта техника также должна помочь разрешить исследования в других экспериментальных установок.

Аннотация

Гиппокамп играет ключевую роль в формировании и консолидации эпизодических воспоминаний, и в пространственной ориентации. Исторически сложилось, что взрослый гиппокамп был просмотрен как очень статического анатомической области мозга млекопитающих. Тем не менее, последние данные показали, что зубчатая извилина гиппокампа является областью огромной пластичности у взрослых, с участием не только модификации существующих нейронных цепей, но и нейрогенез. Эта пластичность регулируется сложных транскрипционных сетей, в которых фактор транскрипции NF-kB играет важную роль. Для изучения и манипулировать нейрогенез, трансгенного модель мыши для переднего мозга конкретных нейронов ингибирования NF-kB деятельности могут быть использованы.

В этом исследовании, способы описаны для анализа NF-kB-зависимой нейрогенеза, в том числе его структурных аспектов, нейронов апоптоза и пролиферации предшественников и познавательного значения, whicч была специально установлена ​​с помощью зубчатой ​​извилине (DG)-зависимого теста поведенческой, пространственная модель сепарации-Барнс лабиринт (SPS-БМ). Протокол SPS-БМ может быть просто адаптированы для использования с другими трансгенных животных моделях, предназначенных для оценки влияния определенных генов на взрослого гиппокампа нейрогенеза. Кроме того, SPS-BM могут быть использованы в других экспериментальных условиях, направленных на изучение и манипулирования DG-зависимую обучения, например, с использованием фармакологических агентов.

Введение

Онтологически, гиппокамп является одним из старейших анатомических структур мозга известных. Он отвечает за различные сложных задач, таких как ключевых функций в регулировании долговременной памяти, пространственной ориентации, а также формирования и консолидации соответствующей памяти. Анатомически, гиппокампа состоит из пирамидальных слоев клеток (слой pyramidale), включая Корню Ammonis (СА1, СА2, СА3 и CA4) регионов и зубчатой ​​извилине (извилина Dentatus), который содержит гранулы клетки и несколько нейронных клеток-предшественников в пределах своей субгранулярной зоне . ЗК проецировать к области СА3 через так называемые моховых волокон (аксонов гранулярных клеток).

До конца прошлого века, взрослый мозг млекопитающих не считается статический орган не хватает сотовой пластичность и нейрогенез. Тем не менее, в течение последних двух десятилетий, все большее количество доказательств ясно демонстрирует нейрогенез, происходящие в по крайней мере,две области мозга, субвентрикулярной зоне (СВЗ) и зернистым зона гиппокампа.

Наши предыдущие исследования, и других групп, показали, что транскрипционный фактор NF-kB является одним из важнейших регуляторов молекулярной взрослого нейрогенеза, и что его результаты де-регулирования в тяжелых структурных гиппокампа дефектов и когнитивных нарушений ^1-6. NF-kB является общее название индуцибельного фактора транскрипции состоит из различных димерных комбинаций пяти ДНК-связывающих субъединиц: p50, p52, с-Rel, RelB и p65 (RelA), последние три из которых имеют трансактивацию домены. В мозге, наиболее распространенная форма находится в цитоплазме является гетеродимером р50 и р65, которая хранится в неактивной форме на ингибитора каппа В (IκB)-белков.

Для изучения и непосредственно управлять NF-kB-приводом нейрогенез, мы используем трансгенных модели мыши для того, чтобы простой ингибирование все subun NF-kBего, в частности, в переднем мозге ⁷ (см. рисунок 1). Для этой цели, мы пересекаем воспитанный следующие трансгенных линий мышей, IκB / - и -/tTA. Трансгенное IκB / - линия была сгенерирована с использованием транс-доминирующее негативное мутант NF-kB-ингибитора IκBa (супер-репрессор IκBa-AA1) ^8. В отличие от дикого типа IκBα, IκBα-AA1 имеет два серина мутировал в аланинов (V32 и V36), которые препятствуют фосфорилирования и последующей протеасомной деградации ингибитора. Для переднего мозга нейрон-специфической экспрессии в IκBa-AA1-трансгена, IκB / - мышей скрещены с мышей укрывательство кальций-кальмодулин-зависимой киназы IIα (CAMKIIα)-промотор, который может управляться тетрациклина транс-активатора (TTA) ^9.

p65 нокаут-мыши имеют эмбриональную смертельную фенотип, в связи с массовым апоптоза печени ^10, поэтому подход показано здесь обеспечивает элегантный методдля исследования роли NF-kB в послеродовом и взрослого нейрогенеза.

Классический поведенческий тест изучать пространственное обучение и память была описана в 1980 году Richard Morris, испытании, известном как вода-лабиринте Морриса (MWM) ^11. В этом открытом поле водяной лабиринт, животные узнать вырваться из непрозрачного воды на скрытой платформе, основанной на ориентации и экстра-лабиринт киев. Сухой вариант MWM является так называемый Barnes лабиринт (BM) ^12. Этот тест использует круглую пластину с 20 круглых отверстий, расположенных на границе пластины, с одной определенной отверстие как бегство окне, и визуальные подсказки экстра-лабиринт для ориентации. Обе экспериментальные парадигмы полагаться на поведение полета индуцированного отвращения грызунов `ы к воде, или открытых, ярко освещенных пространств. Оба теста позволяют расследование пространственной ориентации, и связанное с этим производительность памяти. Хотя гиппокамп играет общее и существенную роль в формировании пространственной памяти, гиппокампа гegions участвующие отличаться в зависимости от теста применяется. Память испытания в BM возникает из нейронной активности между enthorinal коры (ЕС) и пирамидальных нейронов, расположенных в СА1-области гиппокампа без вклада DG ^13-16. В частности, классический BM главным образом зависит от возможности навигации с помощью моносинаптического височно-аммиачной пути от EC III в СА1 к ЕС V. Важно отметить, что DG является решающим, участвующих в так называемой пространственной распознавания образов ^17, что подразумевает не только обработку визуальное и пространственное информация, но и превращение подобных представлений или воспоминаний в разнородных, непересекающихся представлений. Эта задача требует функциональный три-синаптическую цепь от ЕС II к ГД в СА3 к СА1 и ЕС VI, которые не могут быть проверены в BM ^15.

Для решения этих задач, мы разработали SPS-BM в качестве теста поведенческой специально проверить зубчатой ​​извилине зависит от познавательное представление в сотрудничествеуправляете животные, а в IκB / TTA супер-репрессора модели следующем NF-kB торможения. Важно отметить, что в отличие от MWM или BM, СПС-БМ может выявить тонкие поведенческие дефициты в результате обесценения нейрогенеза. С пространственно-шаблон-разделение строго зависит от функциональной цепи между ЕС II и ГД и СА3 и СА1 и ЕС VI, этот тест очень чувствителен к возможным изменениям в нейрогенеза, модификаций моховой волокна пути или изменение тканевого гомеостаза в пределах DG.

Технически, установка нашего теста основан на исследовании Clelland и соавт., В котором пространственная структура разделения был протестирован с помощью деревянного 8-руки радиально лабиринт (RAM) ^19. В нашем модифицированной установки, восемь руки были заменены семь одинаковых желтых пищевых домов. Таким образом, методы показано здесь, в том числе анализ doublecortin-выражения (DCX +) клеток в гиппокампе, прогнозы моховой волокно, нервных клеток деATH и, в частности СПС-БМ, представленные здесь, могут быть применены к исследованию других мышиных моделях, включающих трансгены, которые оказывают влияние на взрослого нейрогенеза. Дальнейшие приложения могут включать в себя изучение фармакологических средств и оценке их влияния на ГД и пространственного разделения образов.

протокол

Заявление Этика

Это исследование было проведено в строгом соответствии с нормативно-правовыми актами правительства животного и аккуратно обращайтесь комитета, LANUV государственной Северный Рейн-Вестфалия, (Дюссельдорф, Германия). Все эксперименты на животных были утверждены LANUV, Дюссельдорф, номер лицензии 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Все усилия были предприняты, чтобы минимизировать стресс и количество животных, необходимых для исследования.

1. Уход животных и жилищного

1. Все животные, используемые в протоколах, описанных здесь, должны находиться под конкретного патогена условиях, как определено Европейским лабораторных животных Ассоциации науки РФ (FELASA).
2. Мыши должны храниться в стандартных клетках в температуре и влажности контролируемой (22 ° C) помещении, в суточных условиях (12 ч свет / темнота цикла) с HEPA фильтрованный воздух.
3. Унифицированная пищи и воды должны быть обеспечены без ограничений.
4. Если IκB / TTA и IκB / - мышей управления используются, на основе ПЦР генотипирование должна быть выполнена для каждого животного, как описано в ^{7, 18.}
5. Кобели с разнице в возрасте менее четырех дней должны быть использованы для уменьшения индивидуальной вариабельности.
6. (По выбору): Для NF-kB реактивации экспериментов, доксициклин должны быть введены в питьевой воде (2 мг / мл 2,5% сахарозы) в течение не менее 14 дней.

2. Пространственная структура Разделение-Барнс Лабиринт (СПС-BM)

1. Все поведенческие испытания должны проводиться в соответствии с международными и местными руководящими принципами.
2. ВАЖНО! Используйте только самцов мышей с шестимесячного возраста и старше. Разница в возрасте между животными одного серии испытаний должно быть не менее четырех дней. Тестирование должно выполняться одним и тем же оператором для каждой серии. Мыши должны получать стандартную диету до тестирования для дальнейшего увеличения мотивации частично приводимый в качествеWeet пищевой наградой.
3. Настройка белый круглую пластину из твердого пластика (диаметр 120 см, см. рисунок 5А) в влажности и температуры контролируемой комнате (22 ° C), с подсветкой, по крайней мере 4 х 80 Вт и 3 х 215 Вт неоновых люминесцентных ламп . ВАЖНО! Убедитесь, что правильно освещение используется, как мотивация мышей ввести продовольственные домов частично обусловлено их отвращение к ярких, открытых местах.
4. Настройте систему видео-слежения. Камера должна быть помещена 115 см выше центра пластины (см. фиг.5А).
5. Прикрепите разноцветные экстра-лабиринт сигналы (ЭМС) к белому тканью в позициях легко видимых для животных, около 100 см от границы пластины (см. рисунок 5а).
6. Тщательно очистите пластину с быстрым дезинфицирующим, что может удалить любой запах от экспериментальной установки.
7. Поместите семь одинаковых желтых пищевых домов (12 см х 7 см х 8 см, см. рис 5а ) на белой тарелке. Позиции должны быть однозначно отмечено (см. рисунок 5А).
8. Наведите сладкой пищи гранул награды (четверть Froot Loop / пищевой дома Kellogs `ы) внутри всех пищевых домов на определенные позиции (см. рисунок 5А) только с одним определены дома еды быть в свободном доступе для животных (места нахождения F, см. Рисунок 5a ). Закройте нецелевых пищевые дома с прозрачной пленкой.
9. Перед испытанием, выполните привыкание (за один день до начала выполнения задачи). Сделать все пищевые дома в свободном доступе и позволит мыши исследовать лабиринт свободно и получить награду пищи гранул (10 мин / животное).
10. Переключите компьютер и камеру и начать системную видео-слежения программного обеспечения.
11. Начните запись.
12. Место животное на определенной начальной точки на круглой пластины (фиг. 5A, S: начальное положение) и позволить мыши для поиска пищевой дом целевого течение 10 мин.
13. Стор видео-слежения.
14. ВАЖНО! Очистите круглую пластину, и еда дома после каждого испытания с быстрым дезинфицирующим средством.
15. Повторите тест в день в течение семи дней подряд (для каждого животного).
16. Проанализируйте результаты (Задержка, пройденное расстояние и ошибки), используя соответствующие статистические программного обеспечения. Определите ошибки по мере приближения неправильное питание дом и / или контакта с правильной коробке без ввода и извлечения пищевого подкрепления гранул. Для сгруппированных анализа использовать двустороннюю ANOVA с Бонферрони после специальной теста.
17. (По выбору) Жертвоприношение мышей и анализировать гиппокампа, как описано ниже.

3. BrdU маркировки

1. Введите внутрибрюшинно 50 мг / кг внутрибрюшинно BrdU один раз в день в течение 3 дней (анализ дифференциации и интеграции) или 200 мг / кг внутрибрюшинно для одной инъекции (анализ пролиферации).
2. Жертвоприношение животных, препарировать гиппокамп и подготовить 40 мкм разделы, как описано ниже.
3. Денатурациисекций с 2 ​​М HCl в течение 10 мин и инкубируют в 0,1 М боратного буфера в течение 10 мин.
4. Этикетка серию один к двенадцати 40 мкм секций (240 мкм друг от друга) от каждого животного иммуногистохимическое, как описано ниже с использованием антител, направленных против BrdU.
5. Количественно меченых клеток с помощью конфокальной микроскопии анализа по всему ростро-каудальной степени слоя гранулярных клеток и зернистым зоне. Умножение полученные числа на 12, чтобы получить оценочную общее количество BrdU-меченых клеток в гиппокамп и разделить на два, чтобы получить общее количество меченых клеток на DG.

4. Удаление интеллектов и подготовка криосрезы из Nonperfused Животные

1. Соблюдайте локально утвержденные процедуры для эвтаназии животных. Мыши могут быть непосредственно подвергнуты эвтаназии путем смещени шейных позвонков.
2. (Опционально) Животные могут быть под наркозом перед euthanization в соответствии с местными и международными рекомендациями, например, путем внутрибрюшинного Injeводств 0,8 мл Avertin для 33 г мыши (свежеприготовленный путем смешивания 150 мл маточного раствора, сделанный из 2,2 мг 2,2,2-tribromoethanol в 1 мл изоамилового этанола с 1,85 мл физиологического раствора или физиологическом буфере).
3. Стерилизовать голову Бетадин (10% повидон-йода) пропитанной марли и тампон впоследствии марлей, смоченной в 70% этанола.
4. Обезглавить животное с использованием соответствующих хирургические ножницы и потяните кожу в сторону.
5. (Опционально) Фиксаторы могут быть применены, чтобы избежать спинка заднего запаздывающей кожи.
6. Сделайте срединный разрез в черепе и осторожно вытащите фрагменты черепа в сторону.
7. Осторожно снимите весь мозг с помощью соответствующего хирургический инструмент (например Мория Spoon).
8. Предварительного охлаждения 25 мл 2-метилбутана в 50 мл химический стакан (например Schott Duran) до -30 до -40 ° С в сухом льду.
   Примечание: Для свободно плавающего окрашивания "толстых" секций, которые идеально подходят для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, удалить мозг, мыть 3раз в буфере и хранят при температуре 4 ° С в забуференном фосфатом 30% раствора сахарозы в 50 мл пробирку, пока мозг не запал вниз (как правило, на ночь).
9. Аккуратно положите мозг на части Nescofilm (Parafilm) и накрыть достаточное количество TissueTek октября соединения, заморозить на Nescofilm в 2-метилбутан, хранить при температуре -80 ° С до использования.
   Примечание: Для длительного хранения при температуре -20 ° C магазине в 9% сахарозы, 7 мм MgCl _2, 50 мМ фосфатного буфера, 44% глицерина.
10. Разрежьте мозг в 10-12 мкм толстых секций по соответствующим cryomicrotome.
    Примечание: Для толстых, свободно плавающих секций, заморозить мозг на замораживающий микротом этапе соответствующей замораживающий микротом (например Райхерта Юнг, Frigomobil.) И сократить 40 мкм горизонтальные участки на -20 ° до - 25 ° С. Сбор разделы из ножа с тонкой кистью и собирать в буфере или держать в растворе для хранения (шаг 4,9) при температуре -20 ° С в течение длительного хранения.
11. Осторожно установите два ломтика на отдельных слайдов микроскопа. Наме Superfrost Ultraplus слайдов настоятельно рекомендуется, чтобы максимизировать сцепление секциях.
12. Высушите слайды в течение 5 мин при комнатной температуре. Слайды можно хранить при -80 ° С до использования.

5. Подготовка разделов из перфузии животных

1. Обезболить животных, как описано выше (шаг 4.2).
2. Осторожно заливать животное транскардиально забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), содержащим гепарин (0,025 г/100 мл PBS) и прокаина (0,5 г/100 мл PBS) в течение 2-4 мин, а затем 4% параформальдегида в PBS в течение 10-15 мин . Перфузии оптимально выполнены перфузии через левый желудочек и открытия правого предсердия с использованием гидростатическое давление приблизительно 1,2-1,4 м или с использованием перистальтического насоса установлен в примерно 15 мл / мин. Оптимальные результаты перфузии в бледно-белой мозга с не будучи видимым не красные кровяные сосуды.
3. Проанализируйте и после исправить мозги в 4% параформальдегида при 4 ° С в течение 24 часов.
4. Криогенныйзащитить мозг в 30% сахарозы в PBS при 4 ° С в течение не менее 24 часов.
5. Замораживание мозги на сцене замораживающий микротом.
6. Подготовка 40 мкм горизонтальных участков из целых переднего мозга с помощью соответствующего замораживающий микротом.
7. Слайды можно хранить в криопротекторов раствора (0,1 М фосфатный буфер, 50% глицерина, 0,14% MgCl _2, 8,6% сахарозы) при -20 ° С до использования.

6. Иммуногистохимия срезах мозга Nonperfused Животные

1. После фиксации криосрезов, полученный как описано выше, с использованием -20 ° C холодным метанолом в течение 10 мин.
2. Блок 5% нормальной сыворотки, содержащей 0,3% Triton-X (от вида, который был использован для повышения вторичного антитела) в течение ночи при 4 ° С.
3. Промыть 3 раза с 1x PBS и инкубируют с первичными антителами в течение ночи при 4 ° С.
4. Промыть 3 раза с 1x PBS и инкубировали с вторичными антителами при комнатной температуре в течение одного часа.
5. Промыть 3 раза с 1x PBS
6. Кулоновскогоnterstain разделе для ДНК с использованием Sytox зеленый, или DAPI (или альтернативный краситель ДНК).
7. Промыть 3 раза с 1x PBS
8. Вставить разделы в водной вложение среды.
9. Пусть вложение среднего полимеризации, по крайней мере 48 часов.

7. Иммуногистохимия срезах мозга перфузии животных

1. Блок как описано на стадии 6.2, и затем инкубируют фиксированные срезы головного мозга в растворе первичного антитела, разведенного в PBS, содержащий 0,3% Triton-X (свободно плавающих) в течение ночи при 4 ° С.
2. Промыть три раза 1x PBS и инкубируют в растворе вторичного антитела, разведенного в PBS, содержащем 0,3% Тритон-X (свободно плавающих) при комнатной температуре в течение 3 часов.
3. Промыть 3 раза с 1x PBS
4. Контрастирующая раздел для ДНК с использованием Sytox зеленый или DAPI (или альтернативный краситель ДНК).
5. Промыть три раза 1x PBS
6. Вставить разделы в водной вложение среды.
7. Пусть вложение среднего полимеризации длят мере 48 ч.

8. Исследование прогнозам Мшистые Fiber

1. Жертвоприношение животных, подготовить 40 мкм корональные разделы, как описано выше, и окрашивает гиппокампа раздел использованием антитела для нейрофиламентов М.
2. Сканирование разделы на соответствующей длине волны с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для визуализации замшелые волокна и ядра. Запустите сканирование при малом увеличении.
3. Используйте изображения низкой кратности для ориентации и целевой гиппокамп с прогнозами моховой волокна.
4. Сканирование разделы (Z-секционирования) с высоким разрешением и большим увеличением.
5. Анализ морфологического внешний вид и связность мшистых волокон визуализированных с помощью окрашивания для NF-М.
6. (По выбору) Проанализируйте размер и объем гиппокампа лопастей. Используйте сигнал ДНК для измерения.

9. Фтор-Джейд C Анализ (нервных клеток Смерть)

1. Жертвоприношение животных, рассекают hippocAmpus и подготовить 12 мкм секций, как описано выше.
2. Пусть секции высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Fix разделы в 4% PFA в течение 40 мин при комнатной температуре.
4. Кратко мыть секции 3x с DDH ₂ O.
5. Инкубируйте разделы с 0,06% перманганата калия (KMnO ₄₎ в течение 10 мин при непрерывном, осторожном встряхивании.
6. Вымойте разделы 3x с DDH ₂ O.
7. Инкубируйте разделы с 0,002% Фтор-Джейд С раствору в течение 20 мин при комнатной температуре.
8. (По выбору) для одновременного ядерных окрашивания, решение 0,002% Фтор-Джейд С можно с добавлением 10 мкг / мл DAPI.
9. Кратко мыть секции 3x с DDH ₂ O.
10. Пусть секции высохнуть в течение 30 мин при комнатной температуре.
11. Инкубируйте секций с ксилолом (1 мин)
12. Установите секции с использованием ксилола основе монтажное среды (DPX).

Результаты

Скрещивание из IκB / - и TTA трансгенных линий мышей приводит к условной ингибирования NF-kB активности в гиппокампе.

Чтобы исследовать экспрессию IκBα-AA1-трансгена в двойной трансгенной мыши (фиг.1А), мозги были изолированы, cryosectioned и окрашивали с использован?...

Обсуждение

Взрослый нейрогенез, а также возможность его манипуляции через ингибирование NF-kB в нейронах, и его последующего возобновления через доксициклин, предлагает увлекательные систему для расследования новорожденных нейронов в головном мозге взрослых, а также в нейронной де-и повторного п...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Moria MC17 Perforated Spoon	FST	10370-18	removal of the brains
Dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi SV8	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14084-08	removal of the brains
Surgical scissors	FST	14381-43	removal of the brains
Dumont #5 forceps	FST	11254-20	removal of the brains
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879	slides for immunohistochemistry
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	fixative
TissueTek OCT compound	Sakura Finetek	1004200018	embedding of the brains
Normal Goat Serum	Jackson Immunolabs	005-000-001	blocking in IHC
Normal Rabbit Serum	Jackson Immunolabs	011-000-001	blocking in IHC
Normal Donkey Serum	Jackson Immunolabs	017-000-001	blocking in IHC
anti-Neurofilament-M antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	2H3	IHC, Dilution 1:200
anti-Doublecortin antibody	sc-8066	Santa Cruz	IHC, Dilution 1:800
anti-GFP antibody	Abcam	ab290	IHC, Dilution 1:2,000
anti-BrdU antibody	OBT0030G	Accurate Chemicals	IHC, Dilution 1:2,000
Fluoro-Jade C	FJ-C	HistoChem	Determination of neuronal cell death
Betadine	Mundipharma	D08AG02	disinfectant
Cryomicrotome	Leica	CM1900	preparation of brain slices
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393	perfusion
Circular plate made from hard-plastic (diameter 120 cm)	lab made	none	plate for SPS-BM, diameter 120 cm
Buraton rapid disinfectant	Schülke Mayr	113 911	disinfectant
Video-tracking system TSE VideoMot 2 with Software Package VideoMot2	TSE Systems	302050-SW-KIT	tracking and analysis of SPS-BM
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	permeabilization/IHC
Cryotome	Reichert Jung/Leica	Frigomobil 1206	preparation of 40 µm brain slices
Mowiol 4-88	Carl Roth	Art.-Nr. 0713	embedding of the slides
SYTOX green	Invitrogen	S7020	Nuclear staining
Food pellets (Kellog`s Froot Loops)	Kellog`s		SPS-BM
Prism, Version 3.0	Graph Pad Software, San Diego, USA		Statistical evaluation of SPS-BM
Zen 2008 or Zen 2011 Software	Carl Zeiss		Software (Confocal microscope)
D.P.X	Sigma-Aldrich	317616	mounting medium for Fluoro-Jade C staining