VIGS介导的正向遗传学筛选参与非寄主抗性基因鉴定

摘要

病毒诱导的基因沉默是一个有用的工具，用于识别植物非寄主抗性基因参与。我们演示了如何使用中表达GFPuv的识别基因沉默植株易受非寄主病原体的细菌病原体。这种做法是方便，快捷，有利于大规模筛选和类似协议可以应用到其他各种植物与微生物相互作用研究。

摘要

非寄主植物对细菌病原体的抗病能力控制复杂的防御途径。了解这一机制是非常重要开发耐用的抗病植物对病原体的广泛。病毒诱导的基因沉默（VIGS）基于正向遗传学筛选是用于识别赋予非寄主抗性植物防卫基因的一个有用的方法。 烟草脆裂病毒 （TRV）的沉默载体是最有效的VIGS载体和有效地使用已内源性靶基因沉默在烟草 。

在这篇稿件中，我们展示了一个正向遗传学筛选方法沉默单个克隆cDNA文库在N本生和评估对非寄主病原体损害非寄主抗性基因沉默植株的响应， 野火病菌番茄T1，P.丁香甘油 PV。成人教育学院，和X油菜叶斑病病菌。这些细菌病原体设计到快递GFPuv蛋白质和绿色荧光的菌落肉眼可以看出，如果在非寄主植物病原体接种在紫外光下沉默目标基因参与传授非寄主抗性。这有利于可靠和更快的识别基因沉默植株易受非寄主病原体。此外，有希望的候选基因的信息可以被称为TRV载体序列的植物基因插入。在这里，我们展示了VIGS介导的正向遗传学的高吞吐能力，以确定基因参与非寄主抗性。大约100个​​cDNA可以在约2至3周，对一些非寄主细菌病原体的非寄主抗性的相关个别沉默可以研究在其后的一个星期。在这篇稿件中，我们列举参与筛查的具体步骤。 VIGS介导的正向遗传学甄选NG方法不仅可以延长参与非寄主抗性基因鉴定，但也研究基因传授各种植物物种的一些生物和非生物胁迫公差。

引言

非寄主抗性是对一个特定的病原体^1,2种族的所有植物物种的阻力。这赋予广谱和持久抗病植物中^2,3。然而，其作用机制，尤其是对细菌病原体，没有得到很好的理解^。妥协非寄主抗性，高通量转录分析识别差异表达的基因在非寄主抗性^5-9有两种主要方法，以前用于解剖细菌非寄主抗性的突变体或沉默植株的筛选。因为非寄主抗性是由一个复杂的机制^（S）4与许多基因的参与，高通量功能基因组学方法进行基因识别控制，是为更好地理解非寄主抗性机制（S）的关键。

病毒诱导的基因沉默（VIGS）已成功地用于植物内源沉默基因在许多植物物种^10,11。 烟草（Nicotiana benthamiana）是最适合的植物病毒诱导的基因沉默^10,12和它的基因组序列草图，现已^13。 烟草脆裂病毒 （TRV）基于VIGS技术已被广泛用作反向遗传学工具表征基因参与非寄主抗性^2,4,14。这VIGS载体及衍生产品现已通过拟南芥生物资源中心（ABRC， http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ）。 VIGS也被用来确定参与植物免疫力^15-17，特别是^6,18非寄主抗性基因作为一个正向遗传学工具。评估过敏性反应（HR）介导的细胞死亡由一个特定的非寄主植物对病原体引起和评估疾病诱导的细胞死亡，是两个主要检测主要用于identifyin的克易感基因沉默植株。然而，HR细胞死亡不仅对II型非寄主病原体引起的，而不是针对I型非寄主病原体^2。因此，人力资源分析不能被普遍用来识别非寄主抗性被植物所利用的策略，特别是针对广泛的I型非寄主病原体。此外，在基因沉默的植物非寄主抗性的部分损失并不总是导致疾病的症状，因此不能用来确定损害非寄主抗性的植物疾病的得分。相反，评估非寄主病原体的基因沉默植株的增长是一个更好的方法研究非寄主抗性基因沉默植株的损失。

以往的生长测定^6,19，更快速的方法，以评估非寄 ​​主细菌生长的基因沉默的植物相比，可以缩短在正向遗传学筛选所需的时间。我们此前报道的方法观察细菌升病原体生长在紫外线（UV）光叶肉眼使用细菌表达绿色荧光蛋白^{（GFP）19。}在这篇稿件中，我们表现出的实用性表达GFPuv的非寄主细菌病原体受到损害非寄主抗性基因沉默植株易于识别。这种方法是准确识别敏感的植物，适合高通量筛选。

研究方案

1。植物生长与靶基因沉默

1. 植物生长的条件：
   1. 母猪N.本生种子无土盆栽混合物，地铁混合350和发芽的种子在生长室。任何其它也可用于土壤或土壤的介质，而不是对新城混合。
   2. 移植三周龄的苗成单个盆种植在温室中保持在21±2℃以及与其他的生长条件，详细的在以前的文献^12。移栽后的两到三天，植物可以用来为TRV接种。
2. 成长TRV2克隆：
   TRV是一个双向的病毒，其基因组由RNA1和RNA2。 RNA1编码的RNA依赖性RNA聚合酶的运动蛋白^20,21。 RNA2编码外壳蛋白（CP）和两个非结构蛋白的亚基因组RNA ^21。双方RNA1和RNA2需要形成成熟VIR我们粒子及其传播^20,21。构建cDNA文库在TRV2载体在以前的文献^22,23。简单地说，在本研究中使用的VIGS库构建从从暴露于各种生物和非生物诱导子的叶组织中提取的RNA。
   1. 取出根癌农杆菌 GV2260菌株含有的cDNA克隆（96孔板），从冷冻库在TRV2矢量。逐渐解冻后，培养物达到室温，接种个体的根癌农杆菌培养利福平（10微克/毫升）和卡那霉素（50微克/毫升）的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，用96针复制器。
   2. 在28°C孵育板两天。我们通常生长四个复制殖民地每个克隆，以便有足够的农杆菌接种接种两种植物刺。无菌条件下执行所有步骤。
3. VIGS：
   1. 增长农杆菌 （GV2260）携带TRV1在28°C与上述抗生素的LB液体培养基中。从过夜生长的培养物通过离心收获细胞，重新悬浮在接种缓冲液（pH为5.5的10mM MES，200μM的乙酰丁香酮），在振荡器上以50rpm在室温下孵育3小时。
   2. 通过离心收集细胞，并重新悬浮在5mM的MES缓冲液（pH值5.5），接种量（OD ₆₀₀ = 0.3）到3-4 N.背面的边叶本生使用无针注射器。详细的接种程序是体现在以前的文献^24。后来，在现场的TRV1接种，接种各自TRV2菌落用牙签刺的叶子。
   3. 保持足够的营养生长旺盛的植物是非常重要的高效沉默^12。大约两个星期后接种靶基因的转录将开始减少，植物病原体接种到准备ulation TRV接种后三个星期。

2。非寄主病原文化的准备和植物接种

1. 在本研究中所用的病原体的详情：
   野火病菌粉虱，P.番茄斑点病菌。T1，P.斑点病菌glycinea和野油菜黄单胞菌叶斑病病菌。用于此项研究。成长P.丁香株在King的B（KB）与利福平（10微克/毫升），卡那霉素（50微克/毫升）的液体培养基，在28℃12小时。成长十油菜叶斑病病菌。在LB液体培养基中16小时。所有病原体怀有质粒可以表达GFPuv的在以前的文献^19。
2. 制备植物接种病原体培养：
   1. 通过离心收获细菌细胞，并确认绿色荧光的存在下，使用长娃velength紫外灯在黑暗中。两次用无菌水清洗细胞，重新悬浮，用无菌水稀释至所需浓度。
   2. 接种相应的病原体（次）目标基因沉默点（约1.5厘米直径）叶（5 ^日至8 ^日 ），背面的边。几个非寄主病原体可以同时测试它们的生长中的靶基因沉默的植物。同时接种宿主病原体，因为这可以用来作为阳性对照，用于查看在植物中的细菌生长。接种矢量控制（TRV :: 00）植物。

3。 在植物生长的细菌病原体的观察

1. 公开接种叶长波长的紫外线灯在黑暗中。可以被看作是在背景中的表面发出的红色荧光叶叶子的背面的边的绿色荧光点的细菌菌落。
2. 观察病原体生长后2天接种（dpi）的5 dpi的。在这个时间间隔期间的日常生活观察是必要的。
3. 后的第一个画面，短名单的克隆其沉默的一个或多个非寄主病原体的生长结果。
4. 重复VIGS所选克隆和再次测试非寄主病原体的基因沉默植株的响应。这种二级筛选做是为了消除过程中获得的第一个画面的误报。

4。确认入围植物非寄主抗性受损的

1. 沉默如上所述的从屏幕上选择的cDNA克隆。接种的整个非寄主植物与病原体的浸没与相应的病原体培养的植物，具有0.01％（体积/体积）的Silwet L-77和水中植物经受真空为3 - 5分钟。通过常规的生长测定^6,18,19量化细菌的生长（如下文所述）。
2. 在0小时接种后（HPI），3 dpi和5 dpi的两个叶片样品，收集五生物复制为每个非寄主病原体（次）接种叶用叶冲（0.5厘米^2）。研磨叶样品，串行稀板块SAP KB琼脂​​培养基上辅以适当的抗生素和孵化，在28°C，2天。用菌落计数器计数的细菌菌落，并计算以前的文献⁶中所描述的叶片中的细菌的生长。
3. 植物易受非寄主病原体（次），应该表现出较高的数目相比，矢量控制病原体的生长。

5。靶基因序列的插入和鉴定

1. 选定的克隆经重组和attB2引物的使用或使用的引物侧翼克隆网站在TRV2载体，进行菌落PCR。运行PCR产物在凝胶上，并检查是否为单一的条带的扩增。
2. 植物基因插入可测序在TRV2载体的使用attB位侧翼克隆位点的引物或引物。
3. 使用序列进行BLAST和识别基因详情。
4. 随着非翻译区（非编码区）获取全长基因序列。
5. 优先选择300-400 bp的片段，来自三个不同区域的序列和克隆到TRV2载体。独立执行VIGS使用所有三个VIGS结构和确认在所有三个基因沉默植物非寄主抗性的妥协。

结果

这项研究的主要目的是要证明的方法，方便，准确识别基因沉默N. benthamiana植物非寄主抗性受到损害。这种方法有四个主要步骤。第一个步骤是个别地大量使用TRV-VIGS基因沉默。我们已经沉默了大约5000个基因^6,18过了一段约1.5年的使用协议， 如图1所示。部分的基因沉默的植物表现出各种表型的改变，包括生长发育迟缓，泛黄和光漂白的表型（ 图2）。

讨论

植物免疫力限制非寄主病原体的生长，因此，很少或根本没有发出绿色荧光矢量控制植物的叶子接种非寄主病原体在长波长紫外光灯（ 图3D）。然而，当在非寄主抗性有关的基因沉默，基因沉默的植物有利于生长的非寄主的病原体和绿色荧光出现（ 图3E）。这是这个手稿中所描述的方法中所涉及的基本原理。这种方法有两个主要的优点，在人力资源为基础的检测。 在?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30