유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여

요약

바이러스에 의한 유전자 침묵은 식물의 nonhost 저항성에 관련된 유전자를 식별하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 nonhost 병원균에 감염 유전자 침묵 식물을 식별 GFPuv을 표현 세균성 병원체의 사용을 보여줍니다. 이 방법은 빠르고, 간단하고 대규모 검사와 유사한 프로토콜이 다양한 식물 미생물 상호 작용을 연구에 적용 할 수있는 용이하게합니다.

초록

세균성 병원균에 대한 식물의 Nonhost 질병 저항은 복잡한 방어 경로에 의해 제어됩니다. 이 메커니즘을 이해하는 것은 병원균의 넓은 범위에 대한 내구성이 질병 저항성 식물 개발을위한 중요합니다. 바이러스에 의한 유전자 침묵 (VIGS) 기반의 앞으로 유전학 검사는 nonhost 저항을 부여 식물의 방어 유전자의 식별을위한 유용한 방법입니다. 담배 딸랑이 바이러스 (TRV) 기반 VIGS 벡터 날짜에 가장 효율적인 VIGS 벡터이며가 효율적으로 사용되었습니다 은 Nicotiana benthamiana에서 내생 대상 유전자를 침묵합니다.

이 논문에서, 우리는 N.에서의 cDNA 라이브러리에서 개별 클론의 침묵에 대해 앞으로 유전학 검사 방식을 보여 benthamiana와 nonhost 병원균에 대한 노출 nonhost 저항을 유전자 침묵 식물의 반응을 평가, 모나스 syringae pv를. 토마토 T1, P. syringae pv를. GLYCinea, 그리고 X. campestris pv를. vesicatoria. 이러한 세균성 병원균 표현 GFPuv 단백질을 설계하고 침묵 표적 유전자가 nonhost 저항을 부여에 관여하는 경우 그들의 녹색 형광 식민지가 nonhost 병원균 접종 공장에서 UV 빛의 밑에 육안으로 볼 수 있습니다. 이 nonhost 병원균에 감염 유전자 침묵 식물의 믿을 수있는 빠른 식별을 용이하게합니다. 또한, 유망 후보 유전자 정보는 TRV 벡터 식물 유전자 삽입 순서에 의해 알 수있다. 여기에 우리가 nonhost 저항성에 관련된 유전자를 식별하는 VIGS 매개 앞으로 유전학의 높은 처리 능력을 보여줍니다. 약 100 cDNA를 개별적 이후 주에서 공부 할 수있는 약 2~3주 여러 nonhost 세균성 병원균에 대한 nonhost 저항의 관련성에 침묵 할 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는이 검사에 관련된 자세한 단계를 열거합니다. VIGS 매개 앞으로 유전학 screeniNG 접근 방식은 nonhost 저항에 관여 식별 유전자뿐만 아니라 다양한 식물 종의 다양한 생물과 비 생물 적 스트레스 공차를 부여 유전자를 공부하는뿐만 아니라 확장 할 수 있습니다.

서문

Nonhost 저항은 특정 병원체 ^1,2 인종에 대한 모든 식물 종의 저항이다. 이 넓은 스펙트럼과 식물 ^2,3 튼튼한 질병 저항을 부여. 그러나 특히 세균성 병원균에 대한 기전은 잘 ⁴ 이해되지 않습니다. 타협 nonhost 저항 및 nonhost 저항 ^5-9시 차등 발현 유전자의 식별을위한 높은 처리량 성적 프로파일은 이전 세균 nonhost 저항을 해부에 사용되는 두 가지 주요 방법임을 돌연변이 또는 침묵 식물 검사. nonhost 저항은 많은 유전자, 유전자 식별을위한 높은 처리량 기능 게놈 접근법의 참여와 복잡한 메커니즘 (들) ^4에 의해 제어되기 때문에 nonhost 저항 메커니즘 (들)을보다 잘 이해 중요합니다.

바이러스에 의한 유전자 침묵 (VIGS)가 성공적으로 내생 식물 침묵하는 데 사용되었습니다많은 식물 종 ^10,11의 유전자.은 Nicotiana benthamiana는 VIGS ^10,12하고 초안 게놈 시퀀스에 대한 가장 적합한 식물 중 하나입니다 지금 ¹³ 사용할 수 있습니다. 담배 딸랑이 바이러스 (TRV) 기반 VIGS 널리 역 유전학 도구로 사용되었다 nonhost 저항 ^2,4,14에 관련된 유전자의 특성을. 이 VIGS 벡터 및 파생 상품은 애기 장대 생물 자원 센터 (ABRC를 통해 지금 사용할 수 있습니다 http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS는 식물의 면역 ^15-17, 특히 nonhost 저항 ^6,18에 관련된 유전자를 식별 앞으로 유전학 도구로 사용되었습니다. 과민 반응 (HR) 매개 특정 nonhost 병원균에 대한 식물에 의해 유도 된 세포 죽음을 평가하고 질병에 의한 세포 죽음을 평가하는 것은 주로 identifyin에 사용되는 두 가지 주요 분석입니다G 감수성 유전자는 식물을 침묵. 그러나 HR 세포의 죽음이 유일한 유형-II nonhost 병원균에 대한 유도가 아닌 타입-I nonhost 병원균 ^2에 대하여. 따라서, HR의 분석은 보편적 특히 타입 I nonhost 병원체의 넓은 범위에 식물에 의해 사용 nonhost 저항 전략을 파악하는 데 사용할 수 없습니다. 또한, 유전자 침묵 공장에서 nonhost 저항의 부분적인 손실이 항상 질병의 증상 ⁶ 따라서 질병 점수가 nonhost 저항을 저하 식물을 식별하는 데 사용할 수 없습니다 이어질하지 않습니다. 반면에, 유전자 침묵 식물 nonhost 병원균의 성장을 평가하는 유전자 침묵 식물 nonhost 저항의 손실을 공부하기위한 좋은 방법입니다.

기존의 성장 분석 ^6,19, 유전자 침묵 식물에 nonhost 박테리아의 성장을 평가하기위한 빠른 방법에 비해 앞으로 유전학 검사에 필요한 시간을 단축 할 수 있습니다. 우리는 이전에 박테리아를 관찰하는 방법을보고자외선 아래에서 육안으로 잎에 L 병원균의 성장 (UV)는 밝은 녹색 형광 단백질 (GFP) ^19를 표현하는 박테리아를 사용하여. 이 논문에서 우리는 nonhost 저항을 손상하는 유전자 침묵 식물의 쉽게 식별 nonhost 세균성 병원체를 표현 GFPuv의 유용성을 보여줍니다. 이 방법은 감염 식물의 식별을위한 정확하고 높은 처리량 검사에 대한 의무이다.

프로토콜

1. 식물 성장 및 타겟 유전자 침묵

1. 식물의 성장 조건 :
   1. N.를 뿌리다 토양 덜 포팅 혼합물 메트로 믹스 350 성장 챔버에서 씨앗을 발아에 benthamiana 씨. 다른 토양 토양 적은 매체는 메트로 - 믹스 대신 사용할 수 있습니다.
   2. 이식 3 주 오래된 개별 화분에 모종 21 유지 온실에서 그들을 성장 ± 2 ° C 이전의 문헌 ^12에 설명 된 다른 성장 조건과 함께. 두 사흘 이식 후, 식물 TRV 접종에 사용할 수 있습니다.
2. TRV2 클론을 성장 :
   TRV는 양자 바이러스 및 게놈 RNA1 및 RNA2으로 구성되어 있습니다. RNA1는 RNA 의존 RNA 중합 효소와 운동 단백질 ^{20,21 인코딩합니다.} RNA2는 외피 단백질 (CP) 및 subgenomic RNA를 ²¹ 개의 비 구조 단백질을 인코딩합니다. RNA1 및 RNA2 모두 성숙 비르의 형성에 필요한우리 입자들의 확산 ^20,21. TRV2 벡터의 cDNA를 라이브러리 건설 이전의 문학 ^22,23에 설명되어 있습니다. 간단히, 본 연구에서 사용 VIGS 라이브러리는 다양한 생물과 비 생물 적 elicitors에 노출 된 잎 조직에서 추출한 RNA에서 건설되었다.
   1. 냉장고에서 TRV2 벡터의 cDNA를 클론 (96 - 웰 플레이트)가 포함 된 아그로 박테 리움을 (GV2260 변형) 꺼냅니다. 점차적를 해동하고 문화가 실내 온도에 도달 한 후, 96 핀 Replicator를 사용하여 리팜피신 (10 ㎍ / ㎖) 및 카나마이신 (50 ㎍ / ㎖)과 루리아 - 베르 타니 (LB) 한천 배지에 각각의 아그로 박테 리움 문화를 접종.
   2. 이틀 동안 28 ° C에서 번호판을 품어. 그 적절한 아그로 박테 리움의 접종이 두 식물의 찌르기 접종 사용할 수 있도록 우리는 일반적으로 각 복제에 대한 네 가지 복제 식민지를 성장. 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다.
3. VIGS :
   1. 성장28에 TRV1을 들고 아그로 박테 리움 (GV2260) ° 위에서 언급 한 항생제와 LB 액체 배지에서 C. 하룻밤 성장 문화에서 원심 분리하여 수확 세포는 (10 MM MES, 산도 5.5, 200 μM의 acetosyringone) 접종 버퍼에 다시 일시 중지, 50 rpm으로 진탕, 실온에서 3 시간 동안 배양한다.
   2. 원심 분리하여 세포를 수확하고 5 밀리미터 MES 버퍼 (산도 5.5) 및 접종 (OD ₆₀₀ = 0.3)에 다시 일시 중지합니다 3-4 N.의 배축면에 benthamiana는 needleless 주사기를 사용 둡니다. 자세한 접종 절차는 이전의 문헌 ^24에 나와 있습니다. 나중에 TRV1 접종의 사이트에서, 이쑤시개와 잎을 찔러서 각각의 TRV2 식민지를 접종.
   3. 활발한 성장을 효율적으로 VIGS ¹² 중요하기 ​​때문에 충분한 영양과 식물을 유지합니다. 2 주간 포스트 접종에 대한 표적 유전자의 전사가 감소하기 시작하고 식물 병원균 INOC을위한 준비TRV 접종 후 3 주에 ulation.

2. Nonhost 병원체 문화 및 식물 접종의 준비

1. 본 연구에 사용 된 병원균의 세부 사항 :
   모나스 syringae pv를. tabaci, P. syringae pv를. 토마토 T1, P. syringae pv를. glycinea과 크 산토 모나스 (Xanthomonas) campestris pv를. vesicatoria 본 연구에 사용됩니다. P. 성장 왕의 B (KB) 12 시간 동안 28 ° C에서 리팜피신 (10 ㎍ / ㎖), 카나마이신 (50 ㎍ / ㎖)를 첨가 액체 배지에 syringae 변종. X. 성장 16 시간 동안 LB 액체 배지에서 campestris pv를. vesicatoria. 모든 병원균 이전 문헌 ^19에서 설명한대로 GFPuv을 표현할 수있는 플라스미드를 항구.
2. 식물의 접종에 대한 병원체 배양의 준비 :
   1. 원심 분리하여 세균 세포를 수확 긴 주를 사용하여 녹색 형광의 존재를 확인어둠 속에서 velength UV 램프. 멸균 수로 두 번 세포를 씻으하고는 멸균 물을 사용하여 원하는 농도에 다시 일시 중지합니다.
   2. 반점 (약 1.5 cm 직경)와 같은 표적 유전자 침묵 잎 (5 ^일 ~ 8 ^일)의 배축면에 각각의 병원체 (들)을 접종한다. 여러 nonhost 병원체를 동시에 표적 유전자 침묵 식물에서의 성장을위한 테스트 할 수 있습니다. 이것은 란타 박테리아의 성장에서 볼 수있는 양성 대조군으로 사용 할 수있는 동시에 호스트 병원체를 접종. 또한 접종 벡터 제어 (TRV :: 00) 식물.

3. 세균성 병원균의 란타 성장의 관찰

1. 어둠 속에서 긴 파장 자외선에 접종 잎을 노출합니다. 세균성 식민지 잎 표면에서 방출되는 적색 형광 배경에 잎의 배축 측면에서 녹색 형광 점으로 볼 수 있습니다.
2. 병원균의 성장을 관찰이일 포스트 접종 (dpi)로부터 5 DPI. 이 시간 간격 동안 매일 관찰이 필요합니다.
3. 후 첫 번째 화면, 짧은 명단 침묵 하나 이상의 nonhost 병원체 (들)의 성장 결과 클론.
4. 선택한 클론 VIGS를 반복하고 다시 nonhost 병원체 (들) 유전자 침묵 식물의 반응을 테스트합니다. 심사의 두 번째 레벨은 첫 번째 화면 중에 얻은 잘못된 반응을 제거하기 위해 수행됩니다.

4. 변조 된 Nonhost 저항을 위해 선발 된 식물의 확인

1. 위에서 설명한대로 화면에서 선택의 cDNA 클론을 침묵. 5 분 - 0.01 % (v / v)의 Silwet L-77 3 진공 청소기로 청소하기 위하여 침수 식물을 복종과 각각의 병원체 문화와 식물을 잠수하여 nonhost 병원체 (들)과 전체 공장을 접종한다. 아래에 설명 된대로 기존의 성장 분석 ^{6,18,19하여} 박테리아의 성장을 계량.
2. 0 시간 후 접종 (HPI)에서,3 dpi로 5부터, 잎 펀치 (0.5 cm ^2)를 사용하여 다섯 개의 생물 각 nonhost 병원체 (들) 복제 접종 잎에서 두 잎 샘플을 수집합니다. 잎 샘플 2 일 동안 28 ° C에서 적절한 항생제와 부화로 보충 KB 한천 배지에 시리얼 희석 판 수액을 갈기. 식민지 카운터를 사용하여 세균성 식민지를 계산하고 이전의 문헌 ^6에 설명 된 잎 박테리아의 성장을 계산합니다.
3. nonhost 병원체 (들)에 민감한 식물 벡터 제어에 비해 병원균의 성장의 높은 숫자를 표시해야합니다.

5. 대상 유전자의 삽입 및 확인을 시퀀싱

1. attB1 및 attB2 프라이머를 사용하거나 TRV2 벡터에 클로닝 사이트를 측면에서는 프라이머를 사용하여 선택한 복제에 대한 식민지 PCR을 수행합니다. 겔에 PCR 제품을 실행하고 단일 대역의 증폭을 확인합니다.
2. TRV2 벡터의 식물 유전자 삽입은 attB를 사용하여 염기 서열 할 수 있습니다프라이머하거나 복제 사이트를 측면에서는 프라이머.
3. 시퀀스를 사용하여 BLAST를 수행하고 유전자의 세부 사항을 확인합니다.
4. 유엔 번역 된 지역 (UTRs)와 함께 전체 길이 유전자 서열을 구하십시오.
5. 시퀀스의 세 가지 영역 300-400 bp의 단편을 선택하고 TRV2 벡터로 그들을 복제. 독립적 세 VIGS 구문을 사용하여 VIGS을 수행하고 세 가지 유전자 침묵 식물 nonhost 저항의 타협을 확인합니다.

결과

본 연구의 주요 목적은 N. 침묵을 지켰 유전자의 쉽고 정확하게 식별하는 방법을 보여주는 것입니다 nonhost 저항을 손상하는 benthamiana 공장. 이 방법의 네 가지 주요 단계가 있습니다. 첫 번째 단계는 개별적으로 TRV-VIGS를 사용하여 유전자의 다수를 침묵하는 것입니다. 우리는 그림 1에 묘사 된 프로토콜을 사용하여 약 1.5 년의 기간 동안 약 5,000 유전자에게 ^{6,18 침묵을}

토론

식물 면역 거의 또는 전혀 녹색 형광 벡터 제어 공장에서 방출되지 않는, 따라서 nonhost 병원균의 성장을 제한하고 장파장 자외선 (그림 3D)에 따라 nonhost 병원균 접종 둡니다. 그러나 nonhost 저항에 관련된 유전자가 침묵 할 때, 유전자 침묵 식물 nonhost 병원균과 녹색 형광의 성장 (그림 3E) 볼을 선호. 이것은이 논문에 설명 된 방법에 관련된 기본 원칙이다. 이 방법은 HR-기반?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30