非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニング

要約

ウイルス誘発性遺伝子サイレンシングは、植物の非宿主抵抗性に関与する遺伝子を同定するための便利なツールです。私たちは、非宿主病原体に感受性遺伝子沈黙植物を識別するのにGFPuvのを表現する細菌の病原体の使用方法を示しています。このアプローチは速く、容易であり、大規模なスクリーニングと同様のプロトコルは、様々な他の植物、微生物の相互作用を研究に適用することができる容易にする。

要約

細菌性病原体に対する植物の非宿主病抵抗性は、複雑な防御経路によって制御される。このメカニズムを理解することは、病原体の広い範囲に対して耐久性のある病害抵抗性植物を開発するために重要である。ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）ベースのフォワード遺伝スクリーニングは、非宿主抵抗性を付与する植物防御遺伝子の同定に有用なアプローチである。 タバコガラガラウイルス （TRV）ベースVIGSベクトルは、現在までに、最も効率的なVIGSベクトルでかつ効率的に使用されていベンサミアナタバコにおける内因性標的遺伝子をサイレンシングする。

本稿では、我々はNのcDNAライブラリーからの個々のクローンのサイレンシングのために前方の遺伝スクリーニングアプローチを実証ベンサミと非宿主病原体に対する妥協非宿主抵抗性の遺伝子沈黙植物の応答を評価し、 シュードモナスシリン PV。 トマトT1、P. syringaeのPV。glycinea、およびX.白葉。vesicatoria。これらの病原菌は、GFPuvのタンパク質を発現するように設計されており、標的遺伝子サイレンシングが非宿主性を付与に関与している場合、それらの緑色蛍光コロニーを接種した植物の非宿主病原体にUV光の下で肉眼で見ることができる。これは、非宿主病原体に感受性遺伝子沈黙植物の安定した高速の識別を容易にします。さらに、有望な候補遺伝子情報はTRVベクター中の植物遺伝子挿入物を配列決定することによって知ることができる。ここでは、非宿主抵抗性に関与する遺伝子を同定するためVIGS媒介フォワード遺伝学の高スループット能力を示しています。およそ、100 cDNAを個別に約2〜3週間で沈黙することができ、いくつかの非宿主細菌の病原体に対する非宿主抵抗性との関連性は、その後、週に研究することができる。本稿では、このスクリーニングに関わる詳細な手順を列挙。 VIGS媒介フォワード遺伝screeningのアプローチは、非宿主抵抗性に関与する遺伝子を特定するだけでなく、様々な植物種のいくつかの生物と非生物的ストレスの許容範囲を付与する遺伝子を研究するだけでなく、拡張することができます。

概要

非宿主抵抗は、特定の病原体^1,2のレースに対するすべての植物種の抵抗である。これは、広いスペクトルおよび植物^2,3における耐久性耐病性を付与する。しかし、特に細菌の病原体に対するそのメカニズムは、ウェル^4を理解されていない。変異または沈黙植物その妥協非宿主抵抗性、および非宿主抵抗^5-9間に差次的に発現する遺伝子を同定するためのハイスループット転写プロファイリングのためのスクリーニングは以前に細菌の非宿主抵抗性を解剖するために使用される2つの主要なアプローチである。非宿主抵抗が多くの遺伝子、遺伝子同定のためのハイスループット機能的ゲノムアプローチの関与を持つ複雑なメカニズム^（S）4によって制御されているので、非宿主抵抗機構（s）を理解し、より良いために重要です。

ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）が成功裏に内因性の植物を沈黙するのに使用されています多くの植物種の遺伝子^10,11。 ベンサミアナタバコは VIGS ^10,12に最適な植物の一つで、そのドラフトゲノム配列は現在¹³入手可能です。 たばこガラガラウイルス （TRV）ベースVIGSが広く逆遺伝学ツールとして使用されてきた非宿主抵抗^2,4,14に関与する遺伝子を特徴づける。このVIGSベクトルと誘導体はシロイヌナズナの生 ​​物遺伝資源センター（ABRCを通じて利用可能になりましたhttp://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ）。 VIGSはまた、植物免疫^15-17、特に非宿主抵抗^6,18に関与する遺伝子を同定するための順方向遺伝学ツールとして使用されている。過敏感反応（HR）媒介性の非宿主特異的病原体に対する植物によって誘導される細胞死を評価し、疾患誘発される細胞死を評価することidentifyin主に使用される2つの主要なアッセイであるgの影響を受けやすい遺伝子は、植物を沈黙。しかし、HR細胞死は、タイプ-IIの非宿主病原体に対するとしないタイプ-I非宿主病原体²に対して誘導される。したがって、HRアッセイは普遍的に、特に、I型非宿主病原体の広い範囲に対して、プラントで使用される非宿主抵抗戦略を識別するために使用することができない。また、遺伝子の沈黙植物における非宿主抵抗性の部分的な損失は、常に病気の症状⁶ひいては病気のスコアが非宿主抵抗性を損なう植物を識別するために使用することはできないにつながるものではない。逆に、遺伝子沈黙植物の非宿主病原体の成長を評価する遺伝子沈黙植物の非宿主抵抗性の損失を研究するための良い方法です。

従来の増殖アッセイ^6,19に比べて、遺伝子サイレンシング植物に非宿主細菌の増殖を評価するための高速な方法は、フォワード遺伝スクリーニングに要する時間を短縮することができる。我々は以前にバクテリアを観察するための方法を報告紫外線の下で肉眼での葉の上にL病原体の成長（UV）は、ライトグリーン蛍光タンパク質（GFP） ^を発現している¹⁹細菌を用いた。この原稿では、非宿主抵抗を侵害された遺伝子沈黙植物の識別を容易にするための非宿主細菌性病原体を表現GFPuvのの有用性を実証する。この方法は、感受性植物を同定するための正確かつハイスループットスクリーニングに適している。

プロトコル

1。植物の成長とターゲット遺伝子サイレンシング

1. 植物の成長条件：
   1. Nをまくbenthamianaのは、土壌レスポッティング混合、メトロミックス350上の種と成長室に種を発芽。他の土壌または土壌レス媒体はまた、メトロミックスの代わりに使用することができる。
   2. 移植3週齢の個々のポットに苗と21で維持温室でそれらを成長±2℃以前の文献¹²に記載されているような他の成長条件と一緒に。 2〜3日移植後に、植物をTRV接種に使用することができる。
2. TRV2クローンを育てる：
   TRVは二部ウイルスであり、そのゲノムはRNA1とRNA2から構成されています。 RNA1は、RNA依存性RNAポリメラーゼおよび移行タンパク質^をコードする^20,21。 RNA2は、コートタンパク質（CP）とサブゲノムRNAを²¹から2非構造タンパク質をコードしている。 RNA1とRNA2両方が成熟VIRの形成のために必要とされる私たちは、粒子とそのまん延^20,21。 TRV2ベクター中のcDNAライブラリーの構築は、以前の文献^22,23に記載されている。簡単に述べると、本研究で用いたVIGSライブラリは、様々な生物及び非生物的エリシターに露出葉組織から抽出したRNAから構築された。
   1. 冷凍庫からTRV2ベクトル（96ウェルプレート）でcDNAクローンを含むアグロバクテリウム （GV2260ひずみ）を取り出す。徐々にそれを解凍し、文化が室温に達した後、96ピンレプリケータを使用リファンピシン（10μgの/ ml）とカナマイシン（50μgの/ ml）でルリア-ベルターニ（LB）寒天プレート上に個々のアグロバクテ文化を接種する。
   2. 二日間28℃でプレートをインキュベートする。十分なアグロバクテリウムの接種が2植物のプリック接種のために利用可能ですので、我々は通常、各クローンのための4つの複製コロニーを成長させる。無菌条件下ですべての手順を実行します。
3. VIGS：
   1. 育つ28でTRV1を運んでアグロバクテリウム （GV2260）°上記の抗生物質を含むLB液体培地でC。一晩増殖させ培養液から遠心分離により細胞を回収し、接種緩衝液（10mM MES、pHが5.5; 200μMアセトシリンゴン）に再停止し、50 rpmでシェーカー上で、室温で3時間インキュベートする。
   2. 遠心分離により細胞を回収し、5 mMのMES緩衝液（pH 5.5）及び接種（OD ₆₀₀ = 0.3）に再懸濁する3-4 Nの背軸側へbenthamianaのは、無針注射器を使用して残します。詳細な手順は、接種前の文献²⁴に示されている。その後、TRV1接種部位で、つまようじで葉を刺すことによって、それぞれのTRV2コロニーを接種する。
   3. 活発な成長が効率的VIGS ¹²のために重要であるとして、十分な栄養と植物を維持する。約2週間、標的遺伝子の転写産物を減らすために開始され、植物が病原菌INOCの準備ができているポスト接種TRV接種後3週でulation。

2。非宿主病原体培養と植物接種の調製

1. 本研究で用いた病原体の詳細：
   シュードモナスシリン PV。 コナジラミ、P.シリン PV。 トマトT1、P. syringaeのPV。glycineaと白葉。vesicatoria、本研究で使用されています。 P.を育てるキングスB（KB）12時間28℃でリファンピシン（10μgの/ ml）を、カナマイシン（50μgの/ ml）で補足液体培地でシリン系統。 X.を育てる16時間LB液体培地で白葉。vesicatoria。すべての病原体は以前の文献¹⁹に記載されているようにGFPuvのを表現することができるプラスミドを抱く。
2. 植物の接種のために病原体培養液の調製：
   1. 遠心分離により菌体を採取し、長いWAを使って緑色蛍光の存在を確認暗闇の中でvelength UVランプ。滅菌水で2回細胞を洗浄し、それらは、滅菌水を使用して所望の濃度に再懸濁する。
   2. スポット（約1.5cm直径）として標的遺伝子サイレンシングの葉（ ^第 5〜8 ^番目 ）の背軸側にそれぞれの病原体（複数可）を接種する。いくつかの非宿主病原体が同時に標的遺伝子サイレンシング植物におけるそれらの成長のために試験することができる。これは植物体細菌の増殖を表示するための陽性コントロールとして用いることができると同時に、ホスト病原体を接種する。また、ベクトル制御（TRV :: 00）植物を接種。

3。細菌性病原体の植物体の成長での観察

1. 暗闇の中で長波長のUV光に接種葉を公開します。細菌のコロニーを葉の表面から放出される赤色蛍光のバックグラウンドでの葉の背軸側に緑色蛍光ドットとして表示することができます。
2. 病原体の成長を観察する2日後に接種（dpi）で5〜解像度。この時間間隔の間、毎日観察が必要である。
3. 後の最初の画面、短いリストサイレン一つ以上の非宿主病原体（複数可）の成長の結果クローン。
4. 選択されたクローンのためVIGSを繰り返し、再び非宿主病原体（S）への遺伝子沈黙植物の応答をテストします。スクリーニングのこの第二のレベルは、最初の画面の間に得られた偽陽性を取り除くために行われます。

4。危殆非宿主抵抗のため選考植物の確認

1. 上記のような画面から選択されたcDNAクローンを沈黙。 5分 - 0.01％とそれぞれの病原体培養（v / v）のシルウェットL-77と植物を沈めると、3のために真空に沈水植物を施すことにより非宿主病原体（S）と植物全体に接種。後述するように、従来の増殖アッセイ^6,18,19により細菌の増殖を定量化する。
2. 0時間後に接種（HPI）で、3解像度と5円から、リーフパンチ（0.5 cm ^2で ）を使って5生物学的には、各非宿主病原体（s）のために複製接種葉から2葉のサンプルを収集。葉のサンプルを、2日間28℃で適切な抗生物質やインキュベートを補っKB寒天培地上のシリアル希釈し、プレート樹液を挽く。コロニーカウンターを用いて細菌のコロニーをカウントし、前の文献⁶に記載されているように葉の中の細菌の成長を計算します。
3. 非宿主病原体（S）の影響を受けやすい植物は、ベクトル制御に比べて病原体の成長より高い数値を示すべきである。

5。標的遺伝子の挿入と識別をシーケン

1. attB1とattB2プライマーを用いたりTRV2ベクター内クローニング部位に隣接するプライマーを使用して、選択したクローンについてコロニーPCRを行います。ゲル上でPCR産物を実行し、単一バンドの増幅を確認してください。
2. TRV2ベクター中の植物遺伝子インサートのattBを用いて配列決定することができるプライマーまたはクローニング部位に隣接するプライマー。
3. シーケンスを使用してBLASTを実行し、遺伝子の詳細情報を識別します。
4. 非翻訳領域（UTRを）とともに完全長遺伝子配列を取得します。
5. シーケンスの三つの異なる領域が300から400 bpの断片を選択し、TRV2ベクターにそれらのクローンを作成。独立して3つのすべてのVIGSコンストラクトを使用してVIGSを実行し、すべての3つの遺伝子の沈黙植物の非宿主抵抗性の妥協点を確認してください。

結果

本研究の主要な目的は、Nを沈黙遺伝子を容易かつ正確に同定するための方法を実証することである非宿主抵抗性のために妥協しているベンサミ工場 。この方法論の4つの主要なステップがあります。最初のステップは、個別にTRV-VIGSを使用して多数の遺伝子を沈黙させることである。我々は、 図1に示されているプロトコルを使用して、約1.5年間にわたり約5,000遺伝?...

ディスカッション

植物免疫はほとんどまたは全く緑色蛍光がベクトル制御プラントから放出されていない、したがって、非宿主病原体の成長を制限し、長波長のUV光（ 図3D）の下で非宿主病原体を接種した葉。しかし、非宿主抵抗性に関与する遺伝子が沈黙したとき、遺伝子沈黙植物は非宿主病原体と緑色蛍光の成長（ 図3E）見られているを好む。これは、この原稿に記載された方法?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30