VIGS-Mediated Forward Genetica screening per la identificazione di geni coinvolti nella resistenza Nonhost

Riepilogo

Indotta da virus silenziamento genico è uno strumento utile per identificare geni coinvolti nella resistenza nonhost delle piante. Dimostriamo l'uso di agenti patogeni batterici che esprimono GFPuv nell'identificazione di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Questo approccio è semplice, veloce e facilita lo screening su larga scala e di protocollo simili possono essere applicati a studiare varie altre interazioni pianta-microbo.

Abstract

Nonhost resistenza alle malattie delle piante contro i batteri patogeni è controllato da meccanismi di difesa complessi. La comprensione di questo meccanismo è importante per lo sviluppo di piante resistenti alle malattie durevoli contro un'ampia gamma di patogeni. Indotta da virus silenziamento genico (VIGS) a base di genetica diretta screening è un approccio utile per l'identificazione di geni di difesa delle piante imprimere resistenza nonhost. Virus sonaglio tabacco (TRV) a base di VIGS vettore è il più efficiente VIGS vettore ad oggi ed è stato utilizzato in modo efficiente per silenziare geni bersaglio endogeni in Nicotiana benthamiana.

In questo manoscritto, dimostriamo un approccio prospettico di screening genetico per il silenziamento di singoli cloni da una libreria di cDNA in N. benthamiana e valutare la risposta del gene piante silenziate per resistenza nonhost compromessi contro i patogeni nonhost, Pseudomonas syringae pv. pomodoro T1, P. syringae pv. glycINEA, e X. campestris pv. vesicatoria. Questi agenti patogeni batterici sono progettati per esprimere proteine ​​GFPuv e le loro colonie verde fluorescenti possono essere visti ad occhio nudo sotto la luce UV in nonhost piante inoculate patogeni se il gene bersaglio tacere è coinvolto in impartire resistenza nonhost. Questo facilita l'identificazione affidabile e più veloce di geni silenziati piante suscettibili ai patogeni nonhost. Inoltre, promettente informazioni gene candidato può essere conosciuto con il sequenziamento del gene inserto centrale in TRV vettore. Qui mostriamo la capacità di throughput elevato di VIGS-mediate genetica avanti per identificare i geni coinvolti nella resistenza nonhost. Approssimativamente, 100 cDNA possono essere messi a tacere singolarmente in circa due o tre settimane e la loro rilevanza nella resistenza nonhost contro diversi batteri patogeni nonhost può essere studiato in una settimana dopo. In questo manoscritto, annoveriamo i passaggi dettagliati coinvolti in questo screening. VIGS-mediata genetica diretta screening approccio può essere esteso non solo ai geni coinvolti nella resistenza identificativi nonhost ma anche per studiare geni impartendo diverse tolleranze di stress biotico e abiotico in diverse specie vegetali.

Introduzione

Nonhost resistenza è la resistenza di tutte le specie vegetali da anelli di un particolare agente patogeno ^1,2. Questo conferisce ampio spettro e durevole resistenza alle malattie nelle piante ^2,3. Tuttavia, il suo meccanismo, in particolare contro batteri patogeni, non è ben compreso ^4. Screening per mutanti o piante tacere che la resistenza nonhost compromesso, e l'alta velocità trascrizione profiling per l'identificazione di geni differenzialmente espressi durante la resistenza nonhost ^5-9 sono due principali approcci precedentemente utilizzati per sezionare batterica resistenza nonhost. Perché la resistenza nonhost è controllato da un complesso meccanismo (s) ⁴ con il coinvolgimento di molti geni, un approccio genomica funzionale di throughput elevato per l'identificazione di geni è fondamentale per una migliore comprensione del meccanismo di resistenza nonhost (s).

Indotta da virus silenziamento genico (VIGS) è stato utilizzato con successo per mettere a tacere pianta endogenageni in molte specie vegetali ^10,11. Nicotiana benthamiana è una delle migliori piante adatte per VIGS ^10,12 e il suo progetto di sequenza del genoma è ora disponibile ^13. virus sonaglio tabacco (TRV) basati VIGS è stato ampiamente utilizzato come strumento di genetica inversa per caratterizzare i geni coinvolti nella resistenza nonhost ^2,4,14. Questo VIGS vettori e derivati ​​sono ora disponibili attraverso Arabidopsis Centro di Risorse Biologiche (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS è stato utilizzato anche come strumento di genetica in avanti per identificare geni coinvolti nella immunità pianta ^15-17, resistenza soprattutto nonhost ^6,18. Valutare la risposta ipersensibile (HR)-mediata morte cellulare indotta da piante contro uno specifico agente patogeno nonhost e valutare la malattia la morte cellulare indotta sono due importanti saggi utilizzati principalmente per identifying gene suscettibile tacere piante. Tuttavia, la morte delle cellule umane è indotta solo contro di tipo II nonhost patogeni e non contro le tipo-I nonhost patogeni ^2. Quindi, le analisi delle risorse umane non può essere usato universalmente per identificare strategie di resistenza nonhost utilizzati dalle piante, in particolare contro un'ampia gamma di tipo-I nonhost patogeni. Inoltre, la perdita parziale della resistenza nonhost in un gene silenziato impianto non sempre porta a sintomi di malattia ⁶ e quindi di punteggio malattia non può essere utilizzato per identificare le piante compromettenti resistenza nonhost. In contrario, valutare la crescita dei patogeni nonhost nelle piante silenziate gene è un metodo migliore per studiare la perdita di resistenza nonhost nel gene piante silenziate.

Rispetto al saggio di crescita convenzionale ^6,19, un metodo più veloce per valutare la crescita batterica nonhost sulle piante silenziate gene può ridurre il tempo richiesto per genetica diretta screening. Abbiamo precedentemente riportato un metodo per osservare i batteril crescita patogeno su foglie da occhio nudo sotto ultravioletta (UV) utilizzando batteri esprimenti proteina fluorescente verde (GFP) ^19. In questo manoscritto si dimostra l'utilità di GFPuv esprimere patogeni batterici nonhost per una facile identificazione di geni silenziati piante che sono compromesse per la resistenza nonhost. Questa metodologia è accurata per l'identificazione delle piante sensibili e suscettibili di screening ad alto rendimento.

Protocollo

1. Crescita delle piante e Target silenziamento genico

1. Condizioni di crescita delle piante:
   1. Seminare N. semi benthamiana sul suolo-meno miscela invasatura, Metro-Mix 350 e germinare i semi in una camera di crescita. Qualsiasi altro suolo o fuori suolo medio può anche essere usato al posto di Metro-Mix.
   2. Trapianto di tre settimane vecchie piantine in singoli vasi e farli crescere in una serra mantenuta a 21 ± 2 ° C insieme ad altre condizioni di crescita, come descritto nella letteratura precedente ^12. Due o tre giorni dopo il trapianto, le piante possono essere utilizzati per TRV inoculazione.
2. Crescere TRV2 cloni:
   TRV è un virus bipartito e il suo genoma è costituito da RNA1 e RNA2. RNA1 codifica un RNA polimerasi RNA-dipendente e una proteina movimento ^20,21. RNA2 codifica una proteina di rivestimento (CP) e due proteine ​​non strutturali provenienti dai RNA subgenomici ^21. Sia RNA1 e RNA2 sono necessari per la formazione di vir maturatonoi particelle e la loro diffusione ^20,21. costruzione della libreria di cDNA in TRV2 vettore è descritto nella letteratura precedente ^22,23. Brevemente, biblioteca VIGS utilizzato in questo studio è stato costruito dagli RNA estratto da tessuti fogliari esposti a vari elicitori biotici e abiotici.
   1. Estrarre Agrobacterium (GV2260 ceppo) contenente i cloni di cDNA in TRV2 vettore (una piastra a 96 pozzetti) dal freezer. A poco a poco li scongelare e dopo le culture a temperatura ambiente, inoculare la cultura Agrobacterium individuale su Luria-Bertani (LB) piastra di agar con rifampicina (10 mg / ml) e kanamicina (50 mg / ml) utilizzando un replicatore 96-pin.
   2. Incubare le piastre a 28 ° C per due giorni. Noi di solito crescono quattro colonie repliche per ogni clone in modo adeguato Agrobacterium inoculo è disponibile per pungere l'inoculazione dei due impianti. Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili.
3. VIGS:
   1. CrescereAgrobacterium (GV2260) portante TRV1 a 28 ° C in terreno liquido LB con antibiotici summenzionati. Celle di raccolta per centrifugazione di culture cresciute durante la notte, risospendere nel buffer di inoculazione (10 mM MES, pH 5.5, 200 mM acetosyringone), e incubare per 3 ore a temperatura ambiente su un agitatore a 50 rpm.
   2. Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere in 5 mM MES tampone (pH 5,5) e inoculare (OD ₆₀₀ = 0,3) nel lato abaxial di 3-4 N. benthamiana lascia utilizzando una siringa senza ago. Procedura di inoculazione dettagliato è dimostrato nella letteratura precedente ^24. Più tardi, nella sede di inoculazione TRV1, inoculare rispettivi TRV2 colonie, pungendo le foglie con uno stuzzicadenti.
   3. Mantenere le piante con una nutrizione adeguata, come la crescita vigorosa è importante per VIGS efficienti ^12. Circa due settimane dopo l'inoculazione le trascrizioni dei geni mirati cominceranno a diminuire e le piante sono pronte per INOC patogenomento a tre settimane dopo l'inoculazione TRV.

2. Preparazione di Nonhost Culture patogeno e inoculazione impianto

1. Dettagli di agenti patogeni utilizzati in questo studio:
   Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. pomodoro T1, P. syringae pv. glycinea e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria sono utilizzati in questo studio. Crescere P. syringae in B Re (KB) mezzo liquido integrato con rifampicina (10 mg / ml), kanamicina (50 mg / ml) a 28 ° C per 12 ore. Crescere X. campestris pv. vesicatoria in LB liquido per 16 ore. Tutti gli agenti patogeni harbor un plasmide che può esprimere GFPuv come descritto nella letteratura precedente ^19.
2. Preparazione delle colture di agenti patogeni per l'inoculazione impianto:
   1. Raccogliere le cellule batteriche mediante centrifugazione e confermare la presenza di fluorescenza verde tramite lunghe walampada UV velength al buio. Lavare le cellule due volte con acqua sterile e risospendere alla concentrazione desiderata con acqua sterile.
   2. Seminare il rispettivo agente patogeno (s) sul lato abaxial di geni silenziati foglie di destinazione (5 ^all'8) come macchie (circa 1,5 cm diametro). Diversi patogeni nonhost possono essere testati simultaneamente per la loro crescita nel gene piante silenziate bersaglio. Contemporaneamente inoculare il patogeno host come questo può essere usato come controllo positivo per la visualizzazione in planta crescita batterica. Inoculare anche il controllo vettoriale (TRV :: 00) piante.

3. Osservazione in planta di crescita di batteri patogeni

1. Esporre le foglie inoculate ad una lunga luce UV di lunghezza d'onda nel buio. Colonie batteriche possono essere visualizzate come punti verdi fluorescenti nella parte abassiale della foglia sullo sfondo di fluorescenza rossa emessa dalla superficie della foglia.
2. Osservare la crescita dei patogeniDa 2 giorni dopo l'inoculazione (dpi) a 5 dpi. L'osservazione quotidiana durante questo intervallo di tempo è necessario.
3. Dopo la prima schermata, breve elenco dei cloni il cui silenziamento risultati in crescita di uno o più agenti patogeni nonhost (s).
4. Ripetere VIGS per i cloni selezionati e nuovamente valutare la risposta dei geni di piante silenziate patogeno nonhost (s). Questo secondo livello di screening è fatto per rimuovere i falsi positivi ottenuti nel primo schermo.

4. Conferma di piante selezionate per resistenza Nonhost compromessa

1. Tacere i cloni di cDNA selezionate dalla schermata come descritto sopra. Inoculare l'intera pianta con nonhost patogeno (s) immergendo le piante con rispettive culture patogeno con 0,01% (v / v) Silwet L-77 e sottoponendo le piante sommerse per aspirare per 3 - 5 min. Quantificare la crescita batterica mediante saggio di crescita convenzionale ^6,18,19 come descritto di seguito.
2. A 0 ore post inoculazione (HPI),3 dpi e 5 dpi, raccolgono due campioni di foglie da cinque biologico repliche per ciascun patogeno nonhost (s) foglie inoculate con un pugno foglia (0,5 cm ^2). Macinare i campioni di foglie, di serie diluito e piatto il SAP su KB agar addizionato con antibiotici e incubare appropriate a 28 ° C per 2 giorni. Contare le colonie batteriche utilizzando un contatore di colonie e calcolare la crescita batterica nelle foglie, come descritto nella letteratura precedente ^6.
3. Piante sensibili al nonhost patogeno (s) dovrebbero mostrare maggiore numero di crescita dei patogeni rispetto al controllo vettoriale.

5. Sequenziamento Inserisci e Identificazione di Target Gene

1. Eseguire colonia PCR per il clone selezionato utilizzando attB1 e attB2 primer o utilizzando i primer fiancheggianti il ​​sito di clonaggio nel vettore TRV2. Eseguire il prodotto di PCR sul gel e controllare l'amplificazione della singola banda.
2. Inserto gene vegetale nel vettore TRV2 può essere sequenziato usando attBprimer o primer fiancheggianti il ​​sito di clonazione.
3. Eseguire BLAST utilizzando la sequenza e identificare i dettagli gene.
4. Ottenere piena sequenza genica lunghezza insieme con le regioni non tradotti (UTR).
5. Selezionare 300-400 bp frammenti provenienti da tre diverse regioni della sequenza e li clonare in TRV2 vettore. Indipendentemente eseguire VIGS utilizzando tutti e tre i VIGS costrutti e confermare il compromesso di resistenza nonhost in tutte e tre le piante silenziate gene.

Risultati

Scopo principale di questo studio è quello di dimostrare un metodo per l'identificazione facile e precisa di gene silenziato N. piante benthamiana che sono compromesse per la resistenza nonhost. Ci sono quattro fasi principali di questa metodologia. Il primo passo è quello di mettere a tacere individualmente gran numero di geni che utilizzano TRV-VIGS. Avevamo silenziato circa 5.000 geni ^6,18 su un periodo di circa 1,5 anni usando il protocollo illustrato nella Figura 1.

Discussione

Immunità impianto limita la crescita di patogeni nonhost e, quindi, poca o nessuna fluorescenza verde è emessa da impianti di controllo vettoriale foglie inoculate con patogeni nonhost sotto luce UV di lunghezza d'onda lunga (Figura 3D). Tuttavia, quando un gene coinvolto nella resistenza nonhost viene messo a tacere, le piante silenziate gene favoriscono la crescita di nonhost fluorescenza patogeno e verde è visto (Figura 3E). Questo è il principio di base coinvolti nel metodo ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30