VIGS mediada por delante de detección genética para la identificación de genes implicados en la resistencia no huésped

Resumen

Inducida por el virus de silenciamiento génico es una herramienta útil para la identificación de genes implicados en la resistencia de las plantas hospedantes. Se demuestra el uso de patógenos bacterianos que expresan GFPuv en la identificación de genes silenciados plantas susceptibles a los agentes patógenos no hospedantes. Este método es fácil, rápido y facilita la detección a gran escala y protocolo similar se puede aplicar al estudio de otras interacciones planta-microorganismo.

Resumen

No hospedantes resistencia a las enfermedades de las plantas frente a patógenos bacterianos es controlado por las vías de defensa complejas. La comprensión de este mecanismo es importante para el desarrollo de plantas resistentes a las enfermedades duraderas contra la amplia gama de patógenos. Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) basado en la detección genética hacia adelante es un enfoque útil para la identificación de genes que confieren resistencia a la defensa de las plantas no huésped. Virus del cascabel del tabaco (TRV) vector basado en VIGS es el vector más eficiente VIGS hasta la fecha y se ha utilizado de manera eficiente para silenciar genes diana endógenos en Nicotiana benthamiana.

En este manuscrito, se demuestra un método de detección genética adelante para el silenciamiento de clones individuales de una biblioteca de ADNc de N. benthamiana y la evaluación de la respuesta de las plantas silenciadas de genes para la resistencia no huésped frente a patógenos comprometida no hospedantes, Pseudomonas syringae pv. tomate T1, P. syringae pv. glycINEA y X. campestris pv. vesicatoria. Estos patógenos bacterianos están diseñados para expresar proteínas GFPuv y sus colonias fluorescentes verdes se pueden ver a simple vista bajo luz UV en las plantas inoculadas no hospedantes de patógenos si el objetivo de genes silenciados está implicado en la difusión de la resistencia no huésped. Esto facilita la identificación fiable y más rápida de las plantas de genes silenciados no hospedantes susceptibles a los agentes patógenos. Además, la información gen candidato prometedor puede ser conocido por la secuenciación del inserto de genes de plantas en TRV vectorial. Aquí se demuestra la capacidad de alto rendimiento de la genética hacia adelante VIGS mediadas para identificar los genes implicados en la resistencia no hospedante. Aproximadamente, 100 ADNc pueden ser silenciados individualmente en alrededor de dos a tres semanas y su importancia en la resistencia de no huésped frente a varios patógenos bacterianos no hospedantes pueden ser estudiados en una semana a partir de entonces. En este manuscrito, enumeramos los pasos detallados que participan en esta prueba. Adelante VIGS mediada genética Screening enfoque se puede extender no sólo a la identificación de los genes implicados en la resistencia no huésped, sino también para el estudio de los genes que imparten varias tolerancias de estrés biótico y abiótico en varias especies de plantas.

Introducción

Resistencia no hospedantes es la resistencia de todas las especies de plantas contra razas de un patógeno en particular ^1,2. Esto imparte amplio espectro y resistencia a las enfermedades en las plantas duradera ^2,3. Sin embargo, su mecanismo, en particular contra patógenos bacterianos, no se entiende bien ^4. La detección de mutantes o plantas silenciadas que la resistencia de no huésped de compromiso, y de alto rendimiento de perfiles de transcripción para la identificación de genes expresados ​​diferencialmente durante la resistencia no hospedante ^5-9 son dos enfoques principales usados ​​anteriormente para la disección de la resistencia no hospedante bacteriana. Debido a que la resistencia no huésped es controlada por un complejo mecanismo (s) ⁴ con la participación de muchos genes, un enfoque genómico funcional de alto rendimiento para la identificación de genes es esencial para una mejor comprensión del mecanismo de resistencia no hospedante (s).

Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) ha sido utilizado con éxito para silenciar vegetal endógenoAhora genes en muchas especies de plantas. ^10,11 Nicotiana benthamiana es una de las mejores plantas adecuados para VIGS ^10,12 y su proyecto de secuencia del genoma está disponible ^13. virus del cascabel del tabaco (TRV) basados ​​en VIGS ha sido ampliamente utilizado como herramienta genética inversa para caracterizar los genes implicados en la resistencia no hospedante ^2,4,14. Esto VIGS vectores y derivados ya están disponibles a través del Centro de Recursos Biológicos Arabidopsis (ABRC, http://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ). VIGS también se ha utilizado como una herramienta genética hacia delante para la identificación de genes implicados en la inmunidad planta de ^15-17, especialmente la resistencia no hospedante ^6,18. La evaluación de la respuesta hipersensible (HR) mediada por la muerte celular inducida por las plantas contra un patógeno no hospedante específica y la evaluación de la muerte celular inducida por la enfermedad son dos ensayos principales que se utilizan principalmente para IDENTIFICAgen susceptibles g silenciada plantas. Sin embargo, la muerte celular HR se induce sólo contra los agentes patógenos de tipo II no hospedantes y no contra los de tipo I patógenos no hospedantes ^2. Por lo tanto, los ensayos de recursos humanos no se pueden usar universalmente para identificar estrategias de resistencia no hospedantes utilizados por las plantas, especialmente contra la amplia gama de agentes patógenos de tipo I no hospedantes. Además, la pérdida parcial de la resistencia no hospedante en una planta silenciada gen no siempre conduce a síntomas de la enfermedad ⁶ y por lo tanto de puntuación enfermedad no se puede utilizar para la identificación de plantas comprometer la resistencia no hospedante. Por el contrario, la evaluación de la proliferación de patógenos no hospedantes en las plantas silenciadas de genes es un mejor método para el estudio de la pérdida de resistencia en las plantas no huésped de genes silenciados.

En comparación con el ensayo de crecimiento convencional de ^6,19, un método más rápido para evaluar el crecimiento bacteriano no hospedante en las plantas silenciadas de genes puede acortar el tiempo requerido para la detección genética hacia adelante. Nos han informado de un método de observación de bacteriasluz de l crecimiento de patógenos en las hojas por simple vista bajo la luz ultravioleta (UV) con bacterias que expresan la proteína verde fluorescente (GFP) ^19. En este manuscrito se demuestra la utilidad de GFPuv expresando bacterias patógenas no hospedantes para facilitar la identificación de los genes silenciados plantas que están comprometidos para la resistencia no huésped. Esta metodología es precisa para la identificación de las plantas sensibles y susceptibles de cribado de alto rendimiento.

Protocolo

1. Crecimiento de las plantas y Target Silenciador del Gen

1. Las condiciones de crecimiento de las plantas:
   1. Siembre N. semillas benthamiana en suelo-menos mezcla para macetas, Metro-Mix 350 y germinar las semillas en una cámara de crecimiento. Cualquier otro suelo o suelo-menos medio también se pueden utilizar en lugar de Metro-Mix.
   2. Trasplante de tres semanas de edad plantas de semillero en macetas individuales y crecer en un invernadero mantenido a 21 ± 2 ° C junto con otras condiciones de crecimiento, como se detalla en la literatura anterior ^12. Dos a tres días después del trasplante, las plantas se pueden utilizar para TRV inoculación.
2. Creciendo TRV2 clones:
   TRV es un virus bipartito y su genoma consta de ARN1 y ARN2. ARN1 codifica una ARN polimerasa dependiente de ARN y una proteína de movimiento ^20,21. ARN2 codifica una proteína de cubierta (CP) y dos proteínas no estructurales de los RNAs subgenómicos ^21. Se requieren dos ARN1 y ARN2 para la formación de vir maduradosomos partículas y su propagación ^20,21. construcción de la biblioteca de ADNc en el vector TRV2 se describe en la literatura previa ^22,23. Brevemente, la biblioteca VIGS utilizado en este estudio se construyó a partir del ARN extraído de tejidos de las hojas expuestas a diferentes elicitores bióticos y abióticos.
   1. Tome cabo por Agrobacterium (cepa GV2260) que contiene los clones de ADNc en el vector TRV2 (una placa de 96 pocillos) del congelador. Poco a poco descongelarlos y después de los cultivos alcancen la temperatura ambiente, inocular el cultivo de Agrobacterium individuo en medio Luria-Bertani (LB) placa de agar con rifampicina (10 mg / ml) y kanamicina (50 mg / ml) utilizando un replicador de 96 pines.
   2. Incubar las placas a 28 ° C durante dos días. Por lo general, crecen cuatro colonias idénticas para cada clon para que adecuada inóculo Agrobacterium está disponible para pinchar la inoculación de dos plantas. Realice todos los pasos bajo condiciones estériles.
3. VIGS:
   1. CrecerAgrobacterium (GV2260) llevar a TRV1 a 28 ° C en medio líquido LB con los antibióticos mencionados anteriormente. Células de la cosecha por centrifugación a partir de cultivos desarrollados durante una noche, volver a suspender en el tampón de inoculación (MES 10 mM, pH 5,5, 200 mM de acetosiringona), y se incuba durante 3 horas a temperatura ambiente en un agitador a 50 rpm.
   2. Recoger las células por centrifugación y se vuelve a suspender en tampón MES 5 mM (pH 5,5) e inocular _(DO600 = 0,3) en el lado abaxial de 3-4 N. benthamiana hojas usando una jeringa sin aguja. Procedimiento de inoculación detallada se demuestra en la literatura anterior ^24. Más tarde, en el sitio de inoculación TRV1, inocular respectivos TRV2 colonias mediante un pinchazo en las hojas con un palillo.
   3. Mantener las plantas con una nutrición adecuada ya que el crecimiento vigoroso es importante para VIGS eficientes ^12. Alrededor de dos semanas después de la inoculación de las transcripciones de genes específicos se empiezan a reducir y las plantas están listas para patógenos inoculadosblación a las tres semanas después de la inoculación TRV.

2. Preparación de los cultivos no hospedantes de patógenos y la inoculación Plant

1. Detalles de los agentes patógenos utilizados en este estudio:
   Pseudomonas syringae pv. Tabaci, P. syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea y Xanthomonas campestris pv. vesicatoria se utilizan en este estudio. Crecer P. cepas syringae en King B (KB) medio líquido suplementado con rifampicina (10 mg / ml), kanamicina (50 mg / ml) a 28 º C durante 12 horas. Crecer X. campestris pv. vesicatoria en medio líquido LB durante 16 horas. Todos los patógenos albergan un plásmido que puede expresar GFPuv como se describe en la literatura anterior ^19.
2. Preparación de los cultivos para la inoculación de patógenos de plantas:
   1. Cosecha de las células bacterianas por centrifugación y confirmar la presencia de fluorescencia verde usando largo walámpara UV velength en la oscuridad. Lavar las células dos veces con agua estéril y se las vuelve a suspender a la concentración deseada con agua estéril.
   2. Se inocula el patógeno correspondiente (s) al envés de las hojas de genes diana silenciadas (5 ^º a 8 ^º) como puntos (alrededor de 1,5 cm diámetro). Varios agentes patógenos no hospedantes se pueden probar simultáneamente para su crecimiento en el gen diana plantas silenciadas. Simultáneamente inocular el patógeno host que ésta se puede utilizar como un control positivo para la visualización en el crecimiento bacteriano planta. También el control de vectores inocular (TRV :: 00) plantas.

3. La observación de in planta crecimiento de patógenos bacterianos

1. Exponer las hojas inoculadas a una larga luz ultravioleta de longitud de onda en la oscuridad. Las colonias bacterianas se pueden ver como puntos fluorescentes verdes en el lado abaxial de la hoja en el fondo de la fluorescencia roja emitida por la superficie de la hoja.
2. Observar el crecimiento de patógenosde 2 días después de la inoculación (dpi) a 5 dpi. La observación cotidiana durante este intervalo de tiempo es necesario.
3. Después de la primera pantalla, la lista corta de los clones cuya silenciamiento resultados en el crecimiento de uno o más patógenos no hospedante (s).
4. Repita VIGS para los clones seleccionados y otra vez probar la respuesta de las plantas de genes silenciados para no hospedante patógeno (s). Este segundo nivel de detección se lleva a cabo para eliminar los falsos positivos obtenidos en la primera pantalla.

4. Confirmación de Plantas preseleccionados para la Resistencia no hospedantes Comprometida

1. Silenciar los clones de ADNc seleccionados de la pantalla como se describe anteriormente. Inocular toda la planta con el patógeno no hospedante (s) por inmersión de las plantas con los respectivos cultivos de patógenos con 0,01% (v / v) Silwet L-77 y sometiendo las plantas sumergidas a vacío durante 3 - 5 min. Cuantificar el crecimiento bacteriano mediante ensayo de crecimiento convencional ^6,18,19 como se describe a continuación.
2. A 0 h después de la inoculación (hpi),3 ppp y 5 dpi, recogen dos muestras de hojas de cinco repeticiones biológica para cada patógeno no hospedante (s) hojas inoculadas con un punzón de hoja (0,5 cm ^2). Moler las muestras de hojas, serie diluido y placa de la savia en el KB medio de agar suplementado con antibióticos y se incuba correspondientes a 28 ° C durante 2 días. Contar las colonias bacterianas utilizando un contador de colonias y calcular el crecimiento de bacterias en las hojas como se describe en la literatura anterior ^6.
3. Las plantas no hospedantes susceptibles a patógenos (s) deben mostrar un mayor número de crecimiento de patógenos en comparación con el control de vectores.

5. La secuenciación del inserto e identificación de gen diana

1. Realizar la PCR de colonias para el clon seleccionado utilizando att B1 y attB2 cebadores o utilizando los cebadores que flanquean el sitio de clonación en el vector de TRV2. Ejecute el producto de PCR en el gel y se les presentarán para la amplificación de la banda única.
2. Inserción de genes de plantas en el vector TRV2 puede ser secuenciado usando attBcebadores o cebadores que flanquean el sitio de clonación.
3. Realizar BLAST usando la secuencia e identificar los detalles de genes.
4. Obtener la secuencia génica de longitud completa junto con las regiones sin traducir (UTR).
5. Seleccione 300-400 bp fragmentos de tres regiones diferentes de la secuencia y clonar ellos en TRV2 vector. Independientemente realizar VIGS utilizando los tres VIGS construcciones y confirmar el compromiso de la resistencia de no huésped en las tres plantas de genes silenciados.

Resultados

Objetivo principal de este estudio es demostrar un método para la identificación fácil y precisa de genes silenciados N. benthamiana plantas que están comprometidos para la resistencia no huésped. Hay cuatro pasos principales en esta metodología. El primer paso es silenciar individualmente gran número de genes utilizando TRV-VIGS. Habíamos silenciada alrededor de 5.000 genes de ^6,18 durante un período de alrededor de 1,5 años utilizando el protocolo representado en la Figura 1.

Discusión

Planta de inmunidad limita el crecimiento de patógenos no hospedantes y por lo tanto, poco o nada de fluorescencia verde se emite desde la planta de control de vectores de hojas inoculadas con patógenos no hospedante bajo luz UV de longitud de onda larga (Figura 3D). Sin embargo, cuando un gen implicado en la resistencia de no huésped es silenciada, las plantas de genes silenciados favorecen el crecimiento de la fluorescencia verde y no hospedante patógeno se ve (Figura 3E). Este es...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well U-bottom plates	Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA)	35-3077
96-pin replicator stainless steel	Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA)	250520
High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap	Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA)	6283K50	Manufacturer ID 95-0127-01
Stuart SC6 colony counter	Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK	SC6PLUS
Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350	SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA)
Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)	Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA)	Custom synthesized
MES, Monohydrate	VWR international (Radnor, PA, USA)	CAS No. 145224-94-8
Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	D134406
Vac-In-Stuff (Silwet L-77)	Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA)	VIS-30