神经干/祖细胞在小鼠EAE的慢性全身性注射

摘要

神经干/祖细胞（的NPC）的移植持有再生神经内科伟大的应许。全身交付的NPC已经变成有效的，低侵入性的，而且治疗非常有效的协议，提供干细胞在大脑和受中枢神经系统的实验性慢性炎症性损害啮齿类动物和灵长类动物的脊髓。

摘要

神经干/祖细胞（的NPC）是一种很有前途的干细胞来源，移植方法，旨在大脑修复或修复再生神经内科。该指令已产生的大量证据显示，大脑修复局灶性或全身性鼻咽癌移植后实现了神经系统疾病的几种临床前模型。

这些实验数据已经确定了细胞传递路线为恢复性干细胞疗法的脑部疾病，需要紧急评估的主要障碍之一。脑实质内干细胞移植术代表逻辑态度来对待这些特点是孤立的和可访问的脑病变，如脊髓损伤和帕金森氏病的病症。不幸的是，这个原则是很差适用特点是多灶性，炎症和传播（无论是在时间和空间）性质，包括多发性硬化症（MS）的条件。因此，脑是由系统·瞄准主位NPC交付已经成为一种低侵入性治疗有效协议，提供细胞到大脑，影响中枢神经系统（CNS）的实验性慢性炎症性损害啮齿类动物和灵长类动物的脊髓。

小区交付这种替代方法依赖于人大pathotropism，特别是他们与生俱来的能力（一） 通过感知功能细胞黏附分子和炎症细胞因子和趋化因子受体的环境; （二）交叉后静脉注射（IV）的泄漏解剖障碍或脑室内（ICV）注射液; （ⅲ）积聚在炎性脑和脊髓损伤血管周围的多个位点（S）的水平;及（iv）发挥卓越组织营养及免疫调节作用到不同的主机的靶细胞在体内 。

在这里，我们描述了我们已经开发了IV的方法。和<em>的同基因的NPC对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）侧脑室递送，作为慢性中枢神经系统炎性脱髓鞘模型，并设想全身干细胞递送作为有价值的技术发炎的大脑中神经再生的选择性靶向。

引言

强有力的证据已经出现从体内研究，证明在中枢神经系统疾病^1-8的动物模型中的体细胞的神经干/祖细胞（的NPC）的移植的治疗效果。不过，也有一些与干细胞输送到主机的问题需要仔细考虑之前，这些实验结果可以转化为临床应用。向的（非造血）恢复性干细胞疗法对于多灶性，慢性炎症性脑疾病的发展的一个特别重大的障碍是怪物注射的理想的路径的识别。目标疾病的病理生理学有相当的了解（焦或多灶性;主要炎症或退行性小学），以及与交付相关的技术可行性和风险问题谨慎的分析是在确定干细胞传递最优协议。

而焦点（ 如。进入神经 ​​系统实质）造血干细胞移植是一种合理的方法为特征的破坏空间狭窄的区域中枢神经系统疾病的治疗（ 如帕金森氏症和亨廷顿氏病，脑和脊髓外伤和中风），同样的方法可以证明是几乎不可行的，如MS，其中多灶性，慢性的，空间上传播中枢神经系统损伤会随时间积累的条件。在后一种情况下，针对局灶性细胞注射到病变的个体，也阻碍了移植的NPC的能力有限迁移的中枢神经系统实质内长的距离，从而促使中枢神经系统的替代，更合适的方法识别与微创全国人大针对移植。

从小鼠的NPC针对颅内肿瘤（ 例如 ，神经胶质瘤）观测了很大的希望出现的CNS9外血管内注射时。根据这一开创性在干细胞pathotrophism ¹⁰的体内证据，大量的数据被积累有关实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验动物的可行性和NPC的全身移植的治疗功效，作为模型的炎性中枢神经系统损伤， 通过静脉内（iv）或侧脑室（ICV）全国人大注射^{1,2,5,6,8 ......}我们首先证明，这是依赖于移植的NPC的能力为目标，进入中枢神经系统发炎，并随后参与多间在体内 ^11项具体的微环境中的通信程序。为了特异性靶向中枢神经系统，的NPC被直接输送到脑脊髓液（CSF）中通过侧脑室注射循环，或到通过静脉注射的血液。一旦进入无论是血液或脑脊液，移植的NPC积极互动血脑屏障（BBB）或血脑脊液（BCSFB）壁垒和进入CNS实质。这人大移植和血脑屏障（或BCSFB）之间的相互作用是通过特定的NPC表面细胞粘附分子（CAMS）的监管，并通过高水平的CAM反配体对活化的内皮/室管膜细胞^12-14的表达提供便利。这些凸轮的例子包括受体，透明质酸，CD44和胞间粘附分子（ICAM）-1配体很迟抗原（VLA）-4 ^5,15,16（即，在白细胞，负责与活化室管膜的相互作用细胞和内皮细胞），并以一个低得多的程度淋巴细胞功能相关抗原（LFA）-1和P-选择素糖蛋白配体（PSGL）-1。的NPC也表达多种趋化因子受体，包括CCR1，CCR2，CCR5，CXCR3和CXCR4（但不表达CCR3和CCR7），它在功能上是积极的，无论是在体外和体内 ^5,16。因此，systemica莱注入的NPC用这些凸轮，以及G-蛋白偶联受体（GPCR的），积累在发炎的中枢神经系统的电平。相反，注入的NPC进入全身健康小鼠不通过血管或脑脊髓液空间的路由²进入中枢神经系统。中枢神经系统炎症，或内皮/室管膜细胞活化之后的全身细胞因子或lypopolisaccharide（LPS）注射作为化学诱导的脑炎的模型，因此，有必要对全身注射的NPC积累到大脑和脊髓^2。因此，中枢神经系统的成功定位与全身治疗鼻咽癌是依赖于机会（胡）的一种疾病特定的窗口中，大脑和脊髓的环境，有利于积累和NPC的跨内皮迁移的鉴定。这种情况一般出现在急性和亚急性炎症¹⁷的范围内。一旦已经进入中枢神经系统，移植未分化的NPC已经显示出改善的小鼠的临床病理特征以及更大的，非人灵长类动物与EAE。这已被描述为依赖从最小的细胞替代²和内血管周围的CNS ^2,5,6,18免疫调节和神经保护性旁分泌因子与非CNS发炎的区域^19,20（ 例如淋巴结）显着分泌响应于炎性细胞信号引起了浸润的免疫细胞^5。

在这里，我们描述成慢性EAE的小鼠模型的全身注射体细胞的NPC的关键方法问题。更具体地说，我们定义我们已经建立了以（i）本协议派生，扩展和移植体的NPC准备从成年C57BL / 6小鼠的脑室下区（SVZ）; （ⅱ）引起的慢性EAE在这种小鼠及（iii）进行治疗有效的全身性（ⅳ或ICV）怪物移植我NTO EAE小鼠。

研究方案

所有涉及动物的程序是根据实验室动物护理的动物（科学程序）根据批准的英国内政部的原则行事1986（80 PPL号/ 2457至SP）进行。

1，推导从成年小鼠大脑的脑室下区（SVZ）躯体神经干/祖细胞（的NPC）的

1. 解剖仪器和媒体的制备
   注：这两个解决方案必须准备1-2小时前解剖仪器准备和预热在37℃至少20〜30分钟后再使用（它有助于淡化木瓜蛋白酶和优化酶的活性）。
   
   1. 高压灭菌一条直线锋利的剪刀，一个小小的手术剪刀和两个小弯锯齿钳。
   2. '消化​​'解决方案：准备两个单独的50ml试管有：
      溶液＃1：25毫升Earle氏平衡盐溶液（EBSS）+ 10毫克乙二胺四乙酸（EDTA）+ 10毫克的L-半胱氨酸;和
      解决方案2：25毫升EBSS + 50毫克木瓜蛋白酶。
   3. 制备“完全生长培养基”（CGM）：完整小鼠的基础培养基用鼠标增殖补充剂，肝素0.002％，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF; 10毫微克/毫升），表皮生长因子（EGF; 20纳克/毫升），和抗生素（PEN /链球菌）。
2. 大脑解剖
   注意：颞骨的切除可以很容易损坏，因为它们的锐度的组织。为了避免这种情况，牢牢固定骨头用钳子拉出，直到整个骨已被删除。
   
   1. 对于颈椎脱位N = 5-7，4-8周龄C57BL / 6小鼠各项准备工作的NPC，扑杀的。
   2. 用70％乙醇（在水中）的剔除小鼠的头发和切断后面与直剪锋利的耳朵移除的头部清洗;
   3. 使用一个小的外科剪刀切开皮肤在颅骨中线切口。使用镊子，折叠起来皮肤的两个补丁博览会e为头骨。
   4. 与小的手术剪刀进行两个小切口在颅底和下删除脑桥/延髓（腹头骨）的骨头。通过拉出颞骨进行。用相同的剪刀进行剪切均沿头骨，从基部开始的灯泡，而不会损伤大脑表面。此外，执行额骨和眼睛之间的切割，便于清除顶骨的。用两个镊子开始拉各顶骨向外侧移除头骨。同时拉动，注意脑膜，当要被删除的骨头，可能会损坏大脑。
   5. 一旦头骨已被删除，滑动的大脑和颅骨之间的镊子完全分离脑膜离开了。轻轻地从头骨抬起大脑。切断视神经释放大脑，最后在管与冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）收集大脑。
   6. 保持管上的冰d重复相同的步骤对所有的老鼠。
3. 在SVZ的解剖，神经球形成和维护检测
   单元×平均数稀释倍数×10 ⁴
   
   其中10 ⁴表示的血细胞计数室（总体积= 0.1 ^立方毫米- > 10-4厘米³ - > 10-4毫升）的总体积的转化率。当考虑稀释因子，无论是1与CGM完成并与活力染色必须予以考虑。作为一个例子，如果160细胞已在4个角的正方形被计数，最终浓度的细胞悬浮液（细胞/ ml）为：
   
   四分之一百六×5（稀释CGM）×2（稀释活力染色）×10 ⁴
   
   1. 打开一个夹层罩配备在解剖显微镜。
   2. 清洁所有的表面用70％乙醇（在水中），和喷用抗支原体溶液，以降低污染的风险。
   3. 盖用无菌纱布的烧杯的底部（以保留削尖的工具）中，用70％乙醇（在水中）进行填充。浸泡在烧杯中两对镊子，一对微型剪刀，手术刀片。
   4. 将整个大脑的脑切片矩阵。
   5. 使用两种刀片执行从大脑的前极冠状切片2mm时，不包括光纤束，和3mm后部到前一个切口;并把组织放在一个干净的培养皿。
   6. 根据解剖显微镜隔离SVZ组织切成利用虹膜切除术剪刀1毫米³件。重复所有的大脑。
      1. 拌匀上述两种溶液（1.1.2节）以上，并通过0.22微米的过滤器过滤的大脑解剖和SVZs准备被消化之后。
   7. 传输部分分成30毫升'消化'的解决方案，轻轻毫升吸管A10悬浮孵育30分钟，在3_{7℃，5％CO2。}每15分钟轻轻摇动试管2-3倍。
   8. 离心机在300×g离心10分钟。
   9. 去除上清，重悬沉淀在200μl的CGM通过先用P1000，然后移液用P200移液管（每个10-20X），直到获得单细胞悬浮液。
   10. 采取暂停长达5毫升CGM和转移到T25厘米²瓶。
   11. 经过5-7天在体外 （DIV）神经球会形成。收集悬浮液到一个15ml试管中，离心10分钟，在150×g下。
   12. 去除上清，重悬沉淀到200微升的CGM。
       机械解离的神经球传代的细胞100-150X用P200移液管，直到获得单细胞悬浮液，并把它高达1毫升的CGM。
   13. 稀释细胞悬液， 如 10微升细胞悬液，在40微升的CGM获得1:5稀释，并搅拌均匀。将10微升的dilut的Ë细胞悬液，用10微升的一个重要污点，拌匀。
   14. 填写血球计数板用10微升1:1的细胞悬液：活力染色的解决方案。分别计数活（白色）和死（蓝色）的细胞在4角的正方形的数目。为了确定细胞/ ml数，适用下列计算：
   15. 重悬2×10 ⁵个细胞在5ml的CGM并转移到一个T25厘米²烧瓶中;
   16. 重复部分1.3.11-1.3.12每4-5 DIV。从扩张的第二通道开始，通过活力染色排除评估细胞活力，并开始建立一个持续的增长曲线通过在克隆密度（8,000 cells/cm2）电镀的NPC，描述^21。保持细胞数量并重复上述步骤，每4-5格。要生成一个连续的生长曲线，进行如下操作：
       注：为了有一个良好的细胞制剂，经过4-5 DIV领域应该已经达到了一个直径为150-200微米。有T的一个很好的估计他的细胞密度，以找到一个最佳的稀释倍数，以便在整个血细胞计数具有均匀分布的，不重叠的细胞是重要的。理想情况下，应该有50-200总细胞之间。计数时，只包含在正方形的细胞不接触的边界必须被考虑。此外，细胞的生存力是有一个健康的制剂的重要因素。重要的是，它应大于90％。线性增长曲线是一条健康的细胞制备的另一个指标。
       
       1. 计数活细胞和死细胞的数目（ 例如，1.3×10 ⁶个）。
       2. 定义增长率除以活细胞的数目由镀细胞的数量（ 例如，1.3×10 ^{6/2×10 5} = 6.5）。
       3. 通过乘以增长率细胞存在于前一时间点（在开始= 2×10 ^5）的总数计算细胞总数。
       4. 报告的平均7;标准偏差建立一个线性趋势线。
   17. 从通道6起，机械分离被替换酶解。离心分离，在150×g离心10分钟后，除去上清液，沉淀重悬在200μl的细胞聚集的解离溶液，悬浮7-8倍速用P200孵育10分钟，在37℃，5％CO _2。
   18. 重悬7-8倍速用P200以获得单细胞悬浮液，并加入800微升的CGM。计数细胞（包括活的和死的），并建立自己的生存能力。重悬2×10 ⁵个细胞在5ml的CGM并转移到一个T25厘米²烧瓶中。
4. 的NPC的体内细胞示踪病毒转导
   注意：要验证病毒转导效率，建立与转导和nontransduced的NPC平行生长曲线。此外，克隆效率，即神经球形成细胞的绝对数量内的细胞制剂，本化或通过​​DNA含量（用碘化丙啶，PI）的细胞周期分析，也可使用作为电池状态进一步指示。如果受感染的细胞的百分比不应该是良好的，病毒转导的协议可以被重复第二次与细胞相同的人口。一旦感染水平是令人满意的，生长曲线相似，与野生型细胞中获得，转导的NPC可扩展和/或移植。
   
   1. 收获的神经球并获得单细胞悬液。镀在10ml CGM细胞以高密度（1.5×10 ⁶个细胞在T75厘米²烧瓶）。
   2. 后12小时增加第三代慢病毒载体pRRLsin 3×10 ⁶ TU /毫升。地产人巨细胞病毒设计与大肠杆菌大肠杆菌衍生β-半乳糖苷酶（lacZ），或绿色荧光蛋白（GFP）。
   3. 48小时后，收获细胞，离心分离机，在300×g离心10分钟，并replate的细胞以1:1的比率。
   4. 后3通道在体外验证感染的效率。流式细胞仪是常用来测试感染的功效，和感染的理想水平是普遍接受的是在阳性细胞的75-95％的范围内。再次检查的感染效率后扩张的3通道进一步验证标志物表达的维护。
5. 神经球冻结
   1. 从T25厘米²的烧瓶中，离心分离机，在300×g离心10分钟收获的神经球，弃去上清液。
   2. 重悬沉淀用1毫升冷冻培养基（CGM用10％二甲基亚砜（DMSO）中。
   3. 将冷冻管在-80℃范围内的冷冻集装箱。
   4. 在至少24小时之后将细胞到cryobox并储存在-80℃下六个月，或带来的液体氮（N _2），用于再存储。
6. 神经球解冻
   注意：要避免长时间接触邻的毒性作用f的NPC用DMSO，解冻过程必须尽可能快。
   
   1. 从取出冻存管在-80°C / N _2，并保持它的干冰。
   2. 迅速解冻小瓶在水浴中，直到几乎所有的细胞悬浮液解冻，并只有一小片冰冻悬浮液的存在。
   3. 重悬的细胞悬浮液用5ml预热的新鲜的CGM。
   4. 离心机在300×g离心10分钟。
   5. 用5毫升的新鲜CGM轻轻地除去上清，重悬和板的细胞悬浮液在一个干净的，未处理的T25厘米²烧瓶中。
7. 1.7）全国人大表征
   NB：最后冲洗的PBS可以和0.05％叠氮化钠-PBS中进行更换，以防止真菌生长或污物，并coverslides被储存在4℃下进行2-3周。
   
   注意：要染色的细胞内标记添加渗透剂，以PBS中封闭液。如果初级抗体的来源是山羊，牛血清albumiN（BSA）或血清山羊比其他的应该被使用。
   
   注意：为了染色用于细胞内标记物的透化剂中的第一抗体溶液。
   
   1. 放置在24孔板的底部13毫米玻璃coverslide。加入150μl的每个coverslide创建一小滴的顶部涂层解决方案。孵育至少30分钟，在37℃，5％CO _2。
   2. 收获的神经球和离解，获得单细胞悬液。
   3. 计数活细胞，并稀释至获得80,000 cells/35微升。轻轻吸从coverslide除去多余的涂料解决方案，和板的35微升细胞悬液。
   4. 孵育25分钟，在37℃，5％CO _2。快速检查在相差显微镜细胞是否已经开始坚持。
   5. 通过将基底鼠标介质以适当的补充剂（ 见表1）和抗生素（PE制备的分化培养基中Ñ​​/链球菌）。
   6. 添加400微升分化培养基中，并置于37℃，5％CO _2。
   7. 经过3格，用新鲜的分化培养基介质的变化一半。
   8. 经过6格，取出培养基，用PBS洗一次。在化学罩取下PBS加300微升预热的4％多聚甲醛（PFA）4％的蔗糖。孵育5分钟，在室温（RT）。除去PFA和用PBS洗3次。
   9. 进行免疫细胞化学，除去PBS，用PBS 10％正常山羊血清（NGS）（封闭溶液）块，并孵育1小时，在室温下。
   10. 除去封闭溶液，并加入用PBS 1％NGS稀释所需的初级抗体。孵育在4℃的CO / N，或者，120分钟，在室温。
   11. 培养后，用PBS洗2倍。孵育用PBS 1％NGS稀释适当的二级抗体。孵育60分钟，在RT。
   12. 洗涤2X，用PBS和反染色用4核'，6 - 二脒基2 - 苯基吲哚（DAPI）稀释1:20,000以PBS渗透剂3分钟在室温下在黑暗中。用PBS和一次用蒸馏水洗两次。
   13. 放一滴安装介质上的玻璃组织滑动并与钳安装coverslide与面对该安装介质中的细胞。轻轻按下coverslide挤出多余的安装介质。离开coverslide在黑暗中于室温直至安装介质干燥并存放于4℃。

在C57BL / 6小鼠2。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）诱导实验性自身免疫

1. 乳液的制备
   1. 在玻璃烧杯中制备[另有定义为完全弗氏佐剂（CFA）]和200微克MOG（35-55肽），考虑到含结核分枝杆菌的4毫克/毫升的不完全弗氏佐剂组成的乳液是乳液的总金额每只小鼠将300微升。
      注：Appropria在终审法院MOG免疫小鼠的TE控制是免疫终审法院只小鼠。在MOG免疫小鼠发病的期望方差为11.3（±1.8）dpi的。
      
      注意：当计算所需乳液的总体积，可以考虑两倍体积的小鼠进行免疫接种的次数。玻璃器皿应首选塑料器皿，以尽量减少乳液的一部分的浪费。
      
      1. 用玻璃注射器保持一个19号针头混合约30分钟，始终保持在冰上的乳液。
      2. 要验证乳液是准备好了，滴上少量水乳液。该乳液是准备要注射仅当压降保持原样，并且不散开。
      3. 免疫小鼠的对照组与终审法院只。治疗实验性小鼠（MOG免疫）与MOG的终审法院。在MOG发病的预期方差免疫小鼠为11.3（±1.8）dpi的。
   2. 19号针头转移到1毫升的塑料注射器第二抽吸该乳液。避免气泡，更改与25克针，离开注射器上的冰。注射器充满乳液随时可以使用，应保持在冰上的一对夫妇小时的。
2. 免疫
   1. 将小鼠（6-8周龄，雌性）进入一个变暖的框中，等待约10分钟，使尾静脉扩张。
   2. 从气候变暖箱传送一个鼠标，一个鼠标限制器。关闭限制器，避免鼠标的任何移动。
   3. 补1毫升胰岛素注射器用100μl百日咳毒素（5微克/毫升）的避免使气泡。慢慢地在尾静脉注射液。取下针头，然后按几秒钟用一张纸堵塞出血。
   4. 将小鼠放回笼子，并重复相同的步骤对所有的小鼠。
   5. 麻醉小鼠连续吸入异氟烷（1-2％，2升/分钟），并注入100μl的乳剂皮下注射于水平两个侧面和尾部（300微升乳液/小鼠）的基部。慢慢取出注射器，避免了乳化液的泄漏。
   6. 纪念鼠标用耳朵穿孔，放置老鼠在笼子里，检查直到完全恢复。重复所有的老鼠。
   7. 48小时后（后2天接种，DPI）重复第2.2.3节。
3. EAE小鼠的行为分析
   1. 从5 dpi的开始，每日称重小鼠并通过使用表1中记载的尺度评分系统监测他们的运动表现。

3，注射神经干/祖细胞到尾静脉（ⅳ）

1. 细胞制备
   1. 收获的神经球通过离心，在300×g离心10分钟。
   2. 除去上清，加入200微升细胞聚集的解离溶液。孵育10分钟，在37℃，5％CO _2。
   3. 轻轻悬浮10-12X（avoidin克气泡）用P200直到获得单细胞悬浮液，并采取以800微升用基础培养基不含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +。}
   4. 通过使用活力染色以测定细胞存活力和稀悬浮液用基础培养基不含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +}的取得10 ⁶ cells/150微升的最终密度计数细胞。保持细胞悬液在冰上直至使用。
2. 全国人民代表大会静脉注射
   注：理想的解离成单细胞悬液，并没有气泡是考虑到减少对栓子形成，这可能会导致静脉阻塞和随之而来的死亡或者团块/聚集的风险两个关键方面。
   
   1. 在疾病（16-18 DPI）的高峰期，权衡和得分老鼠。根据他们的得分分布的小鼠，以具有均匀的组。
   2. 将小鼠成暖箱，等待约10分钟，使尾静脉扩张。
   3. 从气候变暖箱传送一个鼠标，一个鼠标限制器。关闭限制器，避免鼠标的任何移动。
   4. 填写1毫升的胰岛素注射器150μL细胞悬液，并确保消除所有的泡沫。慢慢地将溶液注入到尾静脉。用一张纸堵塞出血（ 图6A和6B）取下针头，然后按几秒钟。
   5. 将鼠标放置在笼子里，并检查，直至康复为止。重复同样的步骤对所有的老鼠。

4，注射神经干/祖细胞的枕大池（ICV）

1. 细胞制备
   1. 收获的NPC通过在300×g离心离心10分钟。
   2. 除去上清，加入200微升细胞聚集的解离溶液。孵育10分钟，在37℃，5％CO _2。
   3. 轻轻重悬10〜12倍的有P200，直到获得一个CELL悬挂，并采取到800微升与基础培养基不含Ca ^{2 +，Mg 2 +}的。
   4. 计数细胞并稀释该悬浮液用基础培养基不含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +，}以获得所需的细胞密度。保持细胞悬液在冰上直至使用。
2. 4.2）全国人大侧脑室注射
   1. 在疾病（16-18 DPI）的高峰期，权衡和得分老鼠。根据他们的得分分布的小鼠，以具有均匀的组。
   2. 将鼠标放置在立体定向仪下持续吸入异氟醚（1-2％，2升/分钟）。确保鼠标的头部与耳酒吧。然后调整双方的嘴和鼻子件。确保鼠标的头部是平的和固定的。
   3. 拭小鼠头部与聚维酮碘（PVP-I）和做一个切口切开皮肤在头的后部，以暴露颅骨。
   4. 用显微操作器，插入一个微升的前端ITER注射器插入穿过完整的肌肉和韧带在中线在颈后枕骨和寰椎之间的裂隙。针的弯曲部分保持与枕部的整个长度的内表面紧密接触，如所描述^22。
   5. 慢慢地将针并等待几秒钟。运营商是为了学习认识的针是“上钩”，以鼠标头骨，开始注入细胞制备前的感觉。慢慢地注入细胞的体积（3-5分钟）。留在原地的针额外的几秒钟，注射后慢慢取下注射器。
   6. 缝合了皮肤，然后将鼠标放到恢复笼，直到完全康复。

5，组织处理

1. 深麻醉的小鼠为0.5ml氯胺酮（100毫克/毫升），0.25毫升甲苯噻嗪（23.32毫克/毫升）和4.25毫升无菌水的混合物中，并transcardically灌注，瓦特灰化用生理盐水-EDTA并用4％PFA固定。在4℃下12小时在4％PFA中取出椎柱和大脑和两个后缀在PBS中洗涤组织，从骨骼中移除脊髓和离开所述组织的至少48小时，在30％蔗糖（在PBS中）在4℃下嵌入组织中最佳切割温度（OCT）的化合物和急速冷冻液态氮，描述^2。
2. 用切片机切组织在10-12微米厚的切片。
3. 另外，嵌入新鲜组织在琼脂糖和使用vibratome 50-80微米厚的薄片切割组织。
4. 在这两种情况下，孵育O / N在37℃下在5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基-βD-吡喃半乳糖苷（X-gal的）溶液，以检测核的β-半乳糖苷酶的活性。
5. 重新酶切含有β-半乳糖苷酶+细胞分化为5μm的切片和双染色用antiglial纤维酸性蛋白（GFAP）为星形胶质细胞（50微克/毫升），antineuronal细胞核抗原（神经元核抗原）对神经元的部分（1＆＃956;克/毫升）和antiNestin针对未分化的神经细胞（10微克/毫升）。
6. 请按照在第1.7.11和1.7.12描述。对于多个染色请务必使用与结合不同的荧光第二抗体。
7. 对于含有绿色荧光蛋白标记的细胞组织中的步骤5.1-5.3所得款项作为解释，并进行多重染色。
8. 安装介质的一些滴添加到幻灯片，盖上盖玻片组织。
9. 对于沾有部分生物素标记的抗体制备抗生物素蛋白生物素复合物溶液（美国广播公司的解决方案，请参阅表2），并在搅拌离开45分钟。
10. 孵育切片5分钟，用1％H _{2 O 2}以阻断内源性过氧化物酶的活性。
11. 用PBS洗两次。
12. 孵育在室温下1小时ABC溶液。
13. 用PBS洗两次。
14. 孵育3,3' -二氨基联苯胺溶液和0.3％H _{2 O 2。}监控反应未DER显微镜和一旦切片开始得到棕色（通常约5-10分钟），用PBS洗涤。
15. 用PBS洗两次，并继续按照步骤5.7中所述。

的原料和试剂全面的列表显示在表2中 。

结果

全国人大推导和表征
SVZ解剖是由机械和酶解（ 图1A）方法为在池进行6-8周龄C57BL / 6小鼠（n = 5-7只小鼠/池）。经过培养的CGM几天，自由浮动的神经球开始形成（ 图1A和1B）。主球被收集和机械传代，每4-5格。传代后，活细胞和死细胞的数目是确定的和累积的细胞数作图以生成生长曲线（ 图1C）。这使传播速率的指示，从而提供了一个间接的参...

讨论

成体干细胞的疗法正在成为最有希望的策略，用于治疗慢性炎性CNS疾病如MS2 ¹¹中的一个。同时维持其治疗作用的机制仍有待完全阐明，全国人大移植在神经退行性疾病的不同的实验模型的显著影响，已经引起了几分挑衅的信念，干细胞可能很快被应用到人类的研究。然而，设想我们需要面对的一些关键问题，并解决一些悬而未决的问题，如理想的干细胞来源的移植（自体与异体，?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
EBSS	Sigma	E2888
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7352
Papain	Worthington	30H11965
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult proliferation supplements	Stem Cell Technologies	05701
Heparin	Sigma	H3393
Basic fibroblast growth factor	Peprotech	100-18B-1000
Epidermal growth factor	Peprotech	AF-100-15-1000
Pen/Strep	Invitrogen	1514012
Matrigel (coating solution)	BD Biosciences	354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse)	Stem Cell Technologies	05704
Accumax	eBioscience	00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg	PAA Laboratories	H15-011
Myco trace	PAA Laboratories	Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum	PAA Laboratories	B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether	Sigma Aldrich	T8787
Mouse anti Nestin	Abcam	ab11306
Rabbit anti GFAP	DAKO	203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)	Abcam	ab14955
Rabbit anti MAP-2	Abcam	ab32454
Rat anti MBP	AbD SEROTEC	MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345	Millipore	MAB345
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting solution	DAKO	S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete	Sigma Aldrich	F5506
Mycobacterium tuberculosis	DIFCO	H37Ra
MOG(35–55)	Espikem
Pertussis toxin	List Biological Laboratories	181
Tissue processing
Iris scissor straight	Fine Sciences Tools	14060-09
Blunt/bended forceps	Fine Sciences Tools	11080-02
Brain slicer	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Surgical blades	Swann-Morton	324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar)	Boehringer Ingelheim	01LC0030
Xylazine (Rompun)	Bayer	32371
Stereotaxic frame	KOPF	Model 900
Hamilton syringe	Hamilton	7762-04
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100