Kronik EAE ile Fare nöral kök / progenitör hücrelerinin sistemik enjeksiyonundan

Özet

Nöral kök / progenitör hücreler (NPC) nakli rejeneratif nöroloji büyük vaatlerde tutar. NPC sistemik teslimi, beyin ve merkezi sinir sistemi hasarı deney kronik enflamatuar etkilenen kemirgen ve insan olmayan primatların omurilikteki kök hücrelerini sunmak için etkili invazif düşük, ve terapötik açıdan etkili, çok protokol dönüşmüştür.

Özet

Nöral kök / öncül hücreler (NPC) rejeneratif nöroloji, beyin onarım veya restorasyon amaçlayan nakli yaklaşımlar için umut verici bir kök hücre kaynağıdır. Bu yönerge beyin onarım nörolojik hastalıklar, çeşitli klinik öncesi modellerde, fokal ya da sistemik olarak NPC nakli sonrasında elde edilir, geniş kanıtlar doğmuştur.

Bu deneysel veriler acil değerlendirmeyi gerektirir beyin hastalıkları için restoratif kök hücre tedavilerinin önemli engellerden biri olarak hücre teslim rota belirledik. İntraparenkimal kök hücre aşılama gibi omurilik yaralanmaları ve Parkinson hastalığı gibi izole edilmiş ve erişilebilir beyin lezyonları ile karakterize olan patolojiler için mantıklı bir yaklaşımı temsil etmektedir. Ne yazık ki, bu ilke, multipl skleroz (MS) gibi a, multifokal enflamatuar ve (zaman ve mekan hem de) yaygın doğası ile karakterize edilen koşullara kötü uygulanabilir. Gibi, beyin Sist tarafından hedef olarakemik NPC teslim beyin ve merkezi sinir sistemi (CNS) Deneysel kronik inflamatuar zarar etkilenen kemirgen ve insan olmayan primatların omurilik hücreleri sağlamak için düşük bir invaziv ve terapötik açıdan etkili bir protokol haline gelmiştir.

Hücre teslimat Bu alternatif yöntem, NPC pathotropism (i) fonksiyonel hücre yapışma molekülleri ve enflamatuar sitokin ve kemokin reseptörleri üzerinden çevreye anlamda özel olarak doğuştan gelen bir kapasiteye dayanır; (Ii) sızıntı anatomik intravenöz sonra bariyerleri (. Iv) veya intraserebrovantriküler (icv) enjeksiyonu çapraz; (Iii) de iltihabik beyin ve omurilik hasarı çok perivasküler yer (ler) seviyesinde birikir; ve (iv) in vivo olarak farklı konakçı hedef hücrelerin üzerine kayda değer bir doku trofik ve bağışıklık düzenleyici etkilerini uygularlar.

Burada biz iv için geliştirilmiş olan yöntemler açıklanmaktadır. ve <em> icv kronik CNS inflamatuar demiyelinasyon bir model olarak, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) ile farelerde singeneik NPC teslim, ve rejeneratif nörolojide iltihaplı beyin seçici hedeflemesi için değerli bir teknik olarak sistemik kök hücre teslim öngörmektedir.

Giriş

Güçlü kanıtlar CNS bozukluklarının ^1-8 hayvan modellerinde, somatik sinir kök / öncü hücreler (NPC) transplantasyonunda terapötik etkinliği doğrulayan vivo çalışmalarda doğmuştur. Bu deneysel sonuçlar, klinik uygulamalara tercüme edilebilir önce Bununla birlikte, konak içine kök hücrelerin teslimi ile ilgili bir takım konularda dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Multifokal, kronik inflamatuar beyin hastalıkları için (hematopoetik olmayan) restoratif kök hücre tedavilerinin geliştirilmesine yönelik özellikle önemli bir engel NPC enjeksiyon ideal bir rota tanımlanmasıdır. Hedeflenen hastalığın patofizyolojisi bir firma anlayışı (fokal veya multifokal; primer inflamatuar veya primer dejeneratif), ve dağıtım teknikleri ile ilgili fizibilite ve risk konularında ihtiyatlı analiz kök hücre teslimat için optimum protokolünü belirlemek bulunmaktadır.

Birlikte odak ( Örneğin. sinir sistemi parankimi içine) kök hücre nakli hasarının uzamsal kapalı alanlara karakterize CNS hastalıklarının tedavisi için mantıklı bir yaklaşım (örneğin, Parkinson ve Huntington hastalığı, beyin ve omurilik travmatik yaralanmalar ve inme), aynı yaklaşım olduğu kanıtlanabilir Böyle bir multifokal kronik ve mekansal olarak yaygın sinir sistemi hasarı zamanla biriken MS, gibi durumlarda pratik olarak mümkün olmadığı için. Bu son durumda, bireysel lezyonların fokal hücre enjeksiyonları hedeflemesi de böylece daha az invazif NPC nakli ile hedef MSS alternatif, daha uygun yöntemlerin belirlenmesini isteyen, CNS parankimi içinde uzun mesafelerde göç nakledilen NPC kapasitesi sınırlı tarafından engellendiği .

CNS9 dışında damardan enjekte edildiğinde büyük vaadi farelerde NPC intrakranial tümör (örn.. Glioma) hedef gözlemlerden ortaya çıktı. Bu seminal ardındankök hücre pathotrophism ¹⁰ in vivo kanıt, geniş veri, deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) ile laboratuvar hayvanlarında fizibilite ve NPC sistemik nakli terapötik etkinliğine ilişkin birikmiş olan intravenöz ya yoluyla inflamatuvar MSS hasar bir model olarak (iv) veya intraserebrovantriküler (icv.) NPC enjeksiyon ^{1,2,5,6,8 ..} Biz ilk olarak bu hedef ve girmek iltihaplı MSS ve sonradan birden hücrelerarası meşgul nakledilen NPC yeteneği bağlı olduğunu göstermiştir ^11, in vivo olarak belirli bir mikro ortamlar içinde iletişim programları. Özel olarak MSS hedef için, NPC beyin omurilik sıvısı (CSF) icv enjeksiyon ile dolaşım, veya iv enjeksiyon yoluyla kan akışına doğrudan verilir. Bir kez kan dolaşımına veya CSF girilerek, nakledilen NPC aktif etkileşimkan beyin (BBB) ​​veya kan beyin omurilik sıvısı (BCSFB) engeller ve CNS parankimi girin. NPC greft ile BBB (veya BCSFB) arasındaki bu etkileşim, NPC yüzey hücre yapışma molekülleri (CAMlar) spesifik grubu ile düzenlenir ve aktive edilmiş endotel / ependimal hücreler ^12-14 CAM kontra-ligandları yüksek seviyelerinin ifadesi ile kolaylaştırılır. Bu CAM'lar örnekleri hiyalüronat için reseptörü, CD44, ve hücreler arası yapışma molekülü (ICAM) -1 ligand çok geç antijen (VLA) -4 ^5,15,16 (yani, lökositler de, aktive edilmiş ependim ile etkileşim sorumludur içerir ve endotel hücreleri), ve daha düşük bir ölçüde Lenfosit fonksiyonu ile ilişkili antijen (LFA)-1 ve p-selektin glikoprotein ligandı (PSGL) -1. NPC da CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, CXCR4 ve şunları içeren çeşitli kemokin alıcılarının, geniş bir yelpazede belirtir (ama CCR3'ü ve CCR7 ifade yoktur), in vitro ve in vivo ^5,16 hem de işlevsel açıdan aktif olan,. Bu nedenle, systemically enjekte NPC iltihaplı merkezi sinir sisteminin seviyesinde birikir, G-protein kenetli reseptör (GPCR) ile birlikte, bu CAM'lar kullanın. Tersine, NPC vasküler veya beyin omurilik sıvısı alan yolları ² üzerinden MSS girmeyin sağlıklı farelere içine sistemik enjekte. Kimyasal olarak bağlı ensefalit, bir model olarak ya da sistemik sitokin lypopolisaccharide (LPS) enjeksiyonu takip CNS enflamasyonu, veya endotelyal / ependim hücre aktivasyonu, beyin ve omurilik ² içine sistemik olarak enjekte NPC birikimi için gereklidir. Bu nedenle, sistemik tedavileri ile NPC CNS başarılı bir şekilde hedefleme, beyin ve omurilik ortam birikimi ve NPC transendoteliyal taşınması için elverişli olduğu bir fırsat (WoO) bir hastalığa özgü pencerenin tanımlanmasına bağlıdır. Bu tür durumlar, genellikle erken ve geç inflamasyon ¹⁷ bağlamında ortaya çıkmaktadır. Bir kez farklılaşmamış NPCleri nakledilen, CNS'yi girmiş olanFarelerin klinik-patolojik özelliklerin yanı sıra daha büyük EAE, insan olmayan primatlar iyileştirilmesi için gösterilmiştir. Bu da karşılık olarak hücre yer değiştirmesi üzerinde çok az ² olan ve olmayan sinir sistemi iltihaplı bölgelerde ^19,20 (örneğin, lenf düğümleri) vs perivasküler CNS ^2,5,6,18 olan bağışıklık düzenleyici ve nöro-koruyucu parakrin faktörler dikkate değer salgılanması bağımlı olduğu tarif edilmiştir enflamatuar hücre sinyal bağışıklık hücreleri ⁵ süzülmesiyle ortaya çıkarmıştır.

Bu yazıda kronik EAE bir fare modeli içine somatik NPC sistemik enjeksiyon kilit metodolojik yönlerini açıklar. Daha spesifik olarak, biz genişletmek ve yetişkin C57BL / 6 farelerin subventricular bölgesi (SVZ) den nakli somatik NPC hazırlamak, biz (i) kurduk protokolleri türeterek tanımlamak; (Ii) bu tür farelerde kronik EAE neden ve (iii) terapötik olarak etkili sistemik (iv veya icv) NPC nakli gerçekleştirmek iNto EAE fareler.

Protokol

Hayvanları içeren tüm uygulamalar 1986 (SP PPL No 80/2457) hareket hayvanlar (bilimsel prosedürleri) kapsamında İngiltere İçişleri Bakanlığı tarafından onaylı laboratuvar hayvan bakım esaslarına göre yapılır.

Yetişkin Farelerde Beyin bölge subventricular (SVZ'una) somatik Nöral kök / progenitör hücrelerin (NPC) 1. Türetilmesi

1. Diseksiyon aletleri ve medya hazırlanması
   NB: diseksiyonlar araçlar kullanılmadan önce (o papain sulandırmak için yardımcı olur ve enzim aktivitesini optimize) hazır ve 37 º C'de en az 20-30 dk önceden ısıtılmış olan önce bu iki çözümler 1-2 saat hazır olmalıdır.
   
   1. Bir düz keskin makas, bir küçük cerrahi makas ve iki küçük kavisli tırtıllı forseps otoklavlayın.
   2. 'Sindirim' çözüm: iki ayrı 50 ml tüpler hazırlayın:
      Çözelti 1: 25 ml Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) + 10 mg etilendiamintetraasetik asit (EDTA) + 10 mg L-sistein;ve
      Çözüm # 2: 25 ml EBSS + 50 mg papain.
   3. , Epidermal büyüme faktörü (EGF, 20 ng / ml) ve antibiyotikler,% 0.002, bazik fibroblast büyüme faktörü (10 ng / ml bFGF) heparin, fare çoğalma takviyesi ile birlikte fare bazal ortam: 'tam büyüme ortamında' (CGM) hazırlanması (Pen / Strep).
2. Beyin diseksiyonu
   NB: Temporal kemik kaldırma kolayca nedeniyle netlik dokusuna zarar verebilir. Bunu önlemek için, sıkıca forseps ile kemiklerini güvenli ve tüm kemik kaldırıldı kadar çekin.
   
   1. Servikal dislokasyon n = 5-7, 4-8 haftalık C57BL / 6 fareler ile NPC, itlaf her hazırlanması için.
   2. % 70 etanol (suda) itlaf farelerin saç ve baş kaldırmak için düz keskin bir makas ile kulakların arkasında kesilmiş ile temizlemek;
   3. Kafatası üzerinde deri kesmek için küçük bir cerrahi makas kullanarak bir orta hat kesi olun. Forseps kullanarak, tanitima deri yamaları iki kat yukarıkafatası e.
   4. Küçük cerrahi makas ile kafatasının dibinde iki küçük kesikler gerçekleştirmek ve pons / medulla (ventral kafatası) altında kemikleri çıkarın. Temporal kemikleri çekerek devam edin. Aynı makas ile beyin yüzeye zarar vermeden, ampuller tabanından başlayarak tüm kafatası boyunca bir kesim yerine. Ayrıca, parietal kemik çıkarılmasını kolaylaştırmak için, frontal kemik ve gözler arasında bir kesim yerine. Iki forseps dışarıya doğru parietal kemiklerin her çekerek kafatasını kaldırarak başlamak ile. Çekerken, kemikleri çıkarılır olan zaman beyin hasarı, hangi meninkslerde dikkat.
   5. Kafatası çıkarıldıktan sonra, tam olarak sol zarları ayırmak için, beyin ve kafatası arasında forseps kaydırın. Yavaşça kafatası beyni yukarı kaldırın. Beyin serbest bırakmak ve son soğuk fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile birlikte bir tüpün içinde beyin toplamak için optik sinirler kesilir.
   6. Ice üzerinde tüp tutunTüm fareler için aynı işlemi tekrarlayın d.
3. SVZ'unda diseksiyonu, neurosphere oluşumu ve bakım deneyleri
   Hücreler x ortalama sayısı seyreltme faktörü x 10 ⁴
   
   10 ⁴ hematositometre bölmesi (-> 10-4 cm ³ -> 10-4 ml toplam hacim = 0.1 mm ³⁾ toplam hacminin dönüşümünü temsil etmektedir. Seyreltme faktörü, CGM ile yapılan bir hayati ve leke ile her iki göz önüne alındığında dikkate alınması gerekir. 160 hücreleri, 4 köşe meydanlarda sayılır edilmiş ise, bir örnek olarak, hücre süspansiyonu nihai yoğunluğu (hücre / ml) olacaktır:
   
   160/4 x 5 (CGM'nin ile seyreltme) x 2 (önemli bir leke ile seyreltme) 10 x ⁴
   
   1. Bir mikroskop ile donatılmış bir diseksiyon başlık açın.
   2. % 70 etanol (suda) ile tüm yüzeyleri temizlemek, ve bulaşma riskini azaltmak için anti Mycoplasma solüsyonu ile sprey.
   3. Kapaksteril bir gazlı bez ile bir kaba alt (bilenmiş aletleri sağlamak için) ve% 70 etanol (su içinde) ile doldurun. Beher forseps iki çift, bir mikro makas çifti ve bir cerrahi bıçak batırın.
   4. Beyin-dilimleyici matris üzerinde tüm beyni yerleştirin.
   5. Iki Jilet optik yolları hariç, beynin ön direğe yerden bir koronal kesit 2 mm gerçekleştirmek ve önceki kesim 3 mm posterior kullanma; ve temiz Petri tabağına doku yerleştirin.
   6. Mikroskop altında SVZ'una doku izole ve makas iridektomi kullanılarak 1 mm ³ parçaya kesilir. Tüm beyinleri için tekrarlayın.
      1. De yukarıdaki iki çözüm (bölüm 1.1.2) karıştırın ve beyinleri ve SVZs sindirmek hazır hemen sonra 0.22 mikron filtre ile filtre.
   7. 'Sindirim' çözeltisi 30 ml bölümleri transfer hafifçe a10 ml pipet ile yeniden süspanse edin ve 3 de 30 dakika inkübe% 5 _CO2 içinde 7 ° C. Her 15 dakika hafifçe tüp 2-3x sallayın.
   8. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
   9. Süpernatant kaldırmak ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar, bir P200 pipet (10-20x her biri) ile ilk P1000 ile ve daha sonra pipetleme CGM 200 ul pelletini.
   10. CGM, 5 ml süspansiyon sürebilir ve bir T25 cm ² şişeye aktarın.
   11. In vitro 5-7 gün sonra (DIV) neurospheres oluşturacak. 150 x g de 15 ml santrifüj tüpü ve 10 dakika içine süspansiyon toplayın.
   12. Süpernatantı ve CGM 200 ul içine pelletini.
       Tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar, bir P200 pipet ile hücreler 100-150X pasajlanarak mekanik neurospheres ayırmak ve CGM ile 1 ml kadar sürer.
   13. Bir 1:05 seyreltme elde etmek için CGM 40 ul hücre süspansiyonu, örneğin, hücre süspansiyonu, 10 ul seyreltilmiş ve iyice karıştırın. Zaman dilüe olabilme 10 ul karıştırıne hücre önemli bir leke 10 ul süspansiyon ve iyice karıştırın.
   14. Canlı bir boya çözeltisi: 1:1 'lik bir hücre süspansiyonu, 10 ul bir hemositometre sayım odası doldurun. Ayrı 4 köşe kareler canlı (beyaz) ve ölü (mavi) hücre sayısını. Hücre / ml sayısını belirlemek için, aşağıdaki hesaplama geçerlidir:
   15. 5 CGM üzerine ilave edildi ve bir T25 ^cm2 şişeye transfer süspanse 2 x 10 ⁵ hücre;
   16. Bölümleri 1.3.11-1.3.12 her 4-5 DIV tekrarlayın. Itibaren genişleme ikinci geçitten, hayati leke dışlama tarafından hücresel canlılığını değerlendirmek ve ²¹ anlatıldığı gibi, klonal yoğunluğu (8.000 hücre/cm2) de NPCleri kaplama tarafından sürekli bir büyüme eğrisini yukarı oluşturmaya başlayabilirsiniz. Hücre sayıları tutmak ve prosedür her 4-5 DIV tekrarlayın. Aşağıdaki gibi sürekli bir büyüme eğrisi oluşturmak için, devam:
       Not: 4-5 DIV küreleri 150-200 um bir çapa ulaştığı olmalıdır sonra, iyi bir hücre preparatının sahip olmak. T iyi bir tahmin varO hücre yoğunluğu, bu hematositometre boyunca iyi dağıtılmış, örtüşmeyen hücreleri elde etmek için bir optimum seyreltme faktörü bulmak için önemlidir. İdeal olarak, 50-200 total hücreler arasında olmalıdır. Sayarken, sınırları dokunmadan kare içinde oluşan tek hücreler olarak kabul edilmesi gerekir. Aynı zamanda, hücrelerin canlılığı sağlıklı bir hazırlık için çok önemli bir faktördür. Önemli olarak, bu daha fazla% 90 olması gerekir. Doğrusal bir büyüme eğrisi sağlıklı hücre hazırlama başka bir göstergesidir.
       
       1. Canlı ve ölü hücrelerin sayısını (örneğin 1,3 x 10 ⁶⁾ saymak.
       2. Kaplama hücre sayısı (örneğin, 1.3 x 10 ^6/2 x 10 ⁵ = 6.5) ile canlı hücre sayısına bölünmesi büyüme oranını tanımlamak için kullanılır.
       3. (= 2 x 10 ⁵ başlangıcındaki) önceki bir zaman noktasında mevcut hücrelerin toplam sayısı için büyüme çarpılarak toplam hücre sayısını hesaplayın.
       4. Ortalama bildir7; Bir doğrusal eğilim hattı inşa standart sapma.
   17. Geçit 6 başlayarak, mekanik ayırma, enzimatik ayrılma ile değiştirilir. 10 dakika boyunca 150 x g'de santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak toplam hücre ayrışma çözeltisi 200 ul pelletini, bir P200 ile 7-8X tekrar süspansiyon ve 37 ° C,% 5 _CO2 de 10 dakika inkübe _edilir.
   18. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve CGM 800 ul eklemek için P200 ile 7-8x süspanse edin. (Canlı ve ölü) hücreleri saymak ve onların canlılığı kurmak. 5 CGM üzerine ilave edildi ve bir T25 ^cm2 şişeye transfer süspanse 2 x 10 ⁵ hücre.
4. In vivo hücre takibi için NPC viral transdüksiyon
   Not:, viral transdüksiyon verimliliğini doğrulamak Transdüksiyona ve nontransduced NPC ile paralel bir büyüme eğrisi oluşturmak için. Buna ek olarak, bu neurosphere oluşturan hücrelerin mutlak sayısı, hücre içinde mevcut hazırlama i klonal verimliliktirtion veya (propidyum iyodür, PI) ile DNA içeriği ile, bir hücre döngüsü analizi, hücre durum da diğer endikasyonlar olarak kullanılabilmektedir. Enfekte olmuş hücrelerin yüzdesi iyi olmamalıdır ise, viral transdüksiyon protokol hücre aynı nüfusu ile bir kez daha tekrarlanabilir. Enfeksiyon düzeyi tatmin edici olan ve büyüme eğrisi vahşi tip hücreleri ile elde edilene benzer bir kez, transduse NPC genişletilmiş ve / veya transplante edilebilir.
   
   1. Neurospheres hasat ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek. 10 ml CGM yüksek yoğunluklu (a T75 ^cm2 şişe içinde 1.5 x 10 ⁶ hücre) seviyesinde hücreleri Plate.
   2. 12 saatte bir, bir üçüncü nesil lentiviral vektör pRRLsin 3 x 10 ⁶ TU / ml ekledikten sonra. PPT-hCMV E ile tasarlanmış β-galaktosidaz (LacZ) veya yeşil floresan proteini (GFP) ile coli türevi.
   3. 48 saat sonra, 10 dakika boyunca 300 xg'de hücreler, santrifüj hasat ve bir 1:1 oranında hücreleri replate.
   4. SonraIn vitro 3 pasajlar enfeksiyonun etkinliğini doğrulamak. Akış sitometrisi yaygın bir enfeksiyondur etkinliğini test etmek için kullanılır ve enfeksiyonun yeterli düzeyde yaygın pozitif hücre% 75-95 aralığında olduğu kabul edilmektedir. Markör ifade bakım doğrulamak için genişleme 3 daha ileri pasajlar sonra yeniden enfeksiyonun etkinliğini kontrol edin.
5. Neurosphere dondurma
   1. 10 dakika boyunca 300 xg'de T25 cm ² şişesi, santrifüj neurospheres hasat ve süpernatant atın.
   2. % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile ortamı (CGM dondurma 1 ml ile pelet yeniden süspanse edin.
   3. Bir dondurma kap içinde -80 ° C de cryovials yerleştirin.
   4. En az 24 saat sonra ay boyunca -80 ° C 'de bir cryobox ve saklamak için hücreleri hareket veya daha uzun depolama için sıvı azot (N, ₂₎ getirir.
6. Neurosphere çözdürme
   Not: uzun süreli temas o toksik etkilerini önlemek içinDMSO ile f NPC, çözülme süreci mümkün olduğunca hızlı olmalıdır.
   
   1. Dan cryovial çıkarın -80 C / N ₂ ° ve kuru buz üzerinde tutmak.
   2. Hemen hemen tüm hücre süspansiyonu çözüldü ve buzlu süspansiyonun sadece küçük bir parça olarak kalır kadar hızlı bir şekilde bir su banyosu üzerinde şişeyi eritin.
   3. Prewarmed taze CGM, 5 ml hücre süspansiyonu süspanse edin.
   4. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
   5. Taze CGM 5 ml hafifçe süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın ve temiz, muamele edilmemiş T25 ^cm2 şişe içinde hücre süspansiyonu plaka.
7. 1.7) NPC karakterizasyonu
   Not: Son yıkama PBS mantar büyümesini veya kirletmesini önlemek için% 0.05 sodyum azid, PBS ile ikame edilmiş olabilir, ve coverslides 2-3 hafta boyunca 4 ° C'de saklanır.
   
   Not: hücre içi işaretleri için leke için, bloklama çözeltisi PBS için bir su-geçirimli madde ekleyin. Birincil antikorun kaynak keçi, inek serumu albumi isen (BSA) ya da keçi dışında serum kullanılmalıdır.
   
   Not: hücre içi işaretleyiciler birincil antikor çözeltisi içinde bir su-geçirimli madde kullanım için lekelemeye.
   
   1. , 24 kuyulu plakanın altındaki bir 13 mm cam coverslide yerleştirin. Küçük bir düşüş oluşturmak için her coverslide üstüne kaplama çözeltisi 150 ul ekle. 37 ° C'de en az 30 dakika boyunca inkübe,% 5 _CO2.
   2. Neurospheres hasat ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek üzere ayrışır.
   3. Canlı hücrelerin sayısı ve 80.000 cells/35 ul elde sulandırmak. Hafif aspirasyonla coverslide ikinci kaplama solüsyonu fazlalığını kaldırmak ve hücre süspansiyonu 35 ul plaka.
   4. 37 ° C'de 25 dakika inkübe,% 5 _CO2. Hücreler yapışmaya başladı eğer hızlı bir kontrast faz mikroskobunda kontrol edin.
   5. Uygun katkı (bkz. Tablo 1) ve antibiyotik (Pe sahip fare bazal ortamı karıştırılması ile farklılaşma ortamı hazırlayınn / Strep).
   6. Farklılaştırma ortamının 400 ul ilave edin ve 37 ° C'de inkübe edilir,% 5 _CO2.
   7. 3 SAYI sonra, taze farklılaşma ortam ile orta yarım değiştirin.
   8. 6 DIV sonra, orta kaldırmak ve bir kez PBS ile yıkayın. Kimyasal bir başlık altında PBS kaldırmak ve önceden ısıtılmış% 4 paraformaldehid (PFA)% 4 sukroz 300 ul ekleyin. Oda sıcaklığında (RT), 5 dakika boyunca inkübe edin. PFA çıkarın ve 3 kez PBS ile yıkayın.
   9. Immunositokimya ile devam etmek için, PBS kaldırmak ve PBS,% 10 normal keçi serumu (NGS) (bloke edici çözelti) ile bloke edildi ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir.
   10. Bloke çözeltisini ayırın ve PBS% 1 NGS ile seyreltildi, istenen birincil antikor ekleyin. Alternatif olarak, 120 dakika oda sıcaklığında, 4 ° CO / veya N, inkübe edin.
   11. İnkübasyondan sonra, 2x PBS ile yıkayın. PBS% 1 NGS ile seyreltildi, uygun ikincil antikor ile inkübe edin. Oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.
   12. Yıkama PBS ile 2x ve 4 ile çekirdek karşı leke ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) PBS, karanlıkta, oda sıcaklığında 3 dakika boyunca geçirimli madde ile 1:20,000 seyreltilmiştir. PBS ile ve bir kez damıtılmış su ile iki kere yıkayın.
   13. Bir cam slayt üzerine monte doku ortamının bir damla koyun ve forseps ile montaj orta bakan hücreleri ile coverslide monte edin. Yavaşça montaj orta aşırı sıkmak için coverslide basın. Montaj ortamı kuruyuncaya kadar, oda sıcaklığında karanlıkta coverslide bırakın ve 4 ° C'de saklayın

C57BL / 6 fareleri 2. Myelin oligodendrosit Glikoprotein (MOG) kaynaklı Experimental Autoimmunity

1. Emülsiyonun hazırlanması
   1. Bir cam kap üzerinde [aksi Tam Freund katkı maddesi (CFA) gibi tanımlanmıştır] ve MOG (peptid 35-55), 200 ug, dikkate Mycobacterium tuberculosis 4 mg / ml içeren Eksik Freund katkı maddesi oluşan bir emülsiyonun hazırlanması ki emülsiyonun toplam miktarı başına fare 300 ul olacaktır.
      NB: ÖDENEKCFA içinde MOG-bağışıklık kazandırılmış farelerin te kontrol sadece CFA ile bağışıklaştırılan fareler bulunmaktadır. MOG-aşılanmış farelerde hastalık başlangıcı beklenen varyans 11.3 (± 1.8) dpi.
      
      Not: gerekli emülsiyonun toplam hacmi hesaplanırken, bağışıklık kazandırmak için farelerin sayısı olarak iki kat daha fazla hacim düşünün. Züccaciye emülsiyonun bir parçası olan atık plastik malzeme, en aza indirmek için tercih edilmelidir.
      
      1. Bir cam şırınga her zaman buz üzerinde emülsiyonu tutarak, yaklaşık 30 dakika için bir 19 G iğne ile bir karışım tutma.
      2. Emülsiyon hazır olup olmadığını doğrulamak su emülsiyonu bir miktar bırakın. Bu ve dağıtmak etmez olarak düşürmek kalır sadece emülsiyon enjekte edilecek hazırdır.
      3. Sadece CFA ile farelerin kontrol grubu bağışıklık kazandırır. Deney fareleri, CFA içinde tedavi MOG ile (MOG immünize). MOG hastalık başlangıç ​​beklenen varyans fareler 11.3 (1.8 ±) dpi bağışıklı.
   2. Bir 1 ml plastik şırınga A 19 G iğne aktarmand emülsiyonu aspire. , Kabarcıkları önlemek 25 G iğne değiştirmek ve buz üzerinde şırınga bırakın. Emülsiyon ile dolu şırıngalar kullanılmak üzere hazır olan ve bir kaç saat için buz üzerinde tutulmalıdır.
2. Aşılama
   1. Bir ısınma kutuya (dişi 6-8 haftalık) fareler yerleştirin ve yaklaşık 10 dakika kuyruk ven genişletmek için izin için bekleyin.
   2. Bir fare süzgeç için ısınma kutusundan bir fare aktarın. Fare herhangi bir hareketini önlemek için koruyucularını kapatın.
   3. Kabarcıklar hale kaçınarak pertussis toksini (5 ug / ml) 100 ul bir 1 ml şırınga insülin doldurun. Yavaşça kuyruk damarı içinde çözelti enjekte edilir. Kanamayı takmak için bir kağıt parçası ile bir kaç saniye için iğne ve basın çıkarın.
   4. Geri kafeste fare yerleştirin ve tüm fareler için aynı işlemi tekrarlayın.
   5. Sürekli izofluran teneffüs (% 1-2, 2 L / dak) ile bir fare anestezi ve seviyesinde, emülsiyon, deri altından 100 ul enjekteiki kanat ve kuyruk (300 ul emülsiyon / fare) tabanının. Yavaş yavaş emülsiyonun sızıntısını önlemek, şırınga çıkarın.
   6. , Bir kulak zımba ile fareyi işaretleyin kafes fareler yerleştirin ve tam iyileşme kadar kontrol edin. Tüm fareler için tekrarlayın.
   7. 48 saat sonra (2 gün sonrası bağışıklama, dpi) tekrar bölüm 2.2.3.
3. EAE farelerin davranış analizi
   1. 5 dpi başlayarak her gün fareler tartmak ve Tablo 1 'de açıklanan ölçekli bir skorlama sistemi kullanarak, lokomotor performansları izlemek.

Kuyruk damarına Nöral Kök / Progenitör Hücre 3. Enjeksiyon (iv)

1. Hücre hazırlama
   1. 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hasat neurospheres.
   2. Süpernatantı ve hücre agrega ayrışma çözeltisi 200 ul ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika inkübe,% 5 _CO2.
   3. Yavaşça 10-12x (avoidin tekrar süspansiyong tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar P200 ile kabarcıklar) ve Ca ^{2 +} ve Mg ^{2 +} olmadan bazal ortamı ile 800 ul almak.
   4. Hücre canlılığı deneyi ve 10 ⁶ cells/150 ul bir son yoğunluk elde etmek için Ca ^{2 +} ve ^{Mg2 +} olmayan bazal ortam maddesi ile süspansiyon sulandırmak için önemli bir leke kullanarak hücreleri sayın. Kullanılana kadar buz üzerinde tutun hücre süspansiyonu.
2. NPC iv enjeksiyon
   NB: tek hücre süspansiyonu içine ideal bir ayrışma ve hava kabarcıklarının olmaması damar tıkanıklığı ve buna bağlı olarak ölüme neden olabilir emboli oluşumu vs yığınları / agrega ya riskini azaltmak için dikkate alınması gereken iki önemli yönü vardır.
   
   1. Hastalığı (16-18 dpi) zirvesinde, tartmak ve fareler puan. Homojen gruplar elde etmek için aldıkları puanlara göre fareler dağıtın.
   2. Bir ısınma kutuya fareler yerleştirin ve yaklaşık 10 dakika kuyruk ven genişletmek için izin için bekleyin.
   3. Bir fare süzgeç için ısınma kutusundan bir fare aktarın. Fare herhangi bir hareketini önlemek için koruyucularını kapatın.
   4. Hücre süspansiyonu 150 ul ile 1 ml insülin şırınga doldurun ve tüm kabarcıklar kaldırmak için emin olun. Yavaş yavaş kuyruk damarına solüsyonu enjekte edilir. Kanama (Şekil 6A ve 6B) takmak için bir kağıt parçası ile bir kaç saniye için iğne ve basın çıkarın.
   5. Kafeste fare yerleştirin ve kurtarma kadar kontrol edin. Tüm fareler için aynı işlemi tekrarlayın.

4.. Cisterna Magna (ICV) içine Nöral Kök / Progenitör Hücreler Enjeksiyon

1. Hücre hazırlama
   1. 10 dakika boyunca 300 x g santrifüj ile hasat NPC.
   2. Süpernatantı ve hücre agrega ayrışma çözeltisi 200 ul ekleyin. 37 ° C'de 10 dakika inkübe,% 5 _CO2.
   3. Yavaşça bir tek c elde edilinceye kadar bir P200 ile 10-12x tekrar süspansiyonell süspansiyon ve Ca ^{2 +} ve Mg ^{2 +} olmadan bazal ortamı ile 800 ul almak.
   4. Hücre sayımı ve istenen hücre yoğunluğu elde etmek için Ca ^{2 +} ve ^{Mg2 +} olmadan bazal ortamı ile süspansiyon seyreltin. Kullanılana kadar buz üzerinde tutun hücre süspansiyonu.
2. 4.2) NPC Icv enjeksiyon
   1. Hastalığı (16-18 dpi) zirvesinde, tartmak ve fareler puan. Homojen gruplar elde etmek için aldıkları puanlara göre fareler dağıtın.
   2. Sürekli izofluran inhalasyonu (% 1-2, 2 L / dk) altında steryotaksik cihaz üzerinde fare yerleştirin. Kulak çubukları ile fare baş elde edin. Sonra ağız ve burun parçaları hem de ayarlayın. Fare baş düz ve sabit olduğundan emin olun.
   3. Povidon-iyot (PVP-I) ile fare kafasını çubukla ve kafatası açığa çıkarmak için başın arka kısmında cilt kesmek için bir kesi yapmak.
   4. Bir mikromanipülatör kullanarak, bir MICROL ucuna takınboynun arka orta hatta sağlam kaslar ve bağlar aracılığıyla oksiputa ve atlas vertebra arasındaki yarık içine iter şırınga. İğnenin bükülmüş parçası ²² tarif edildiği gibi, tüm uzunluğu için oksiputa iç yüzeyi ile yakın temas içinde tutulur.
   5. Yavaş yavaş iğne yerleştirin ve birkaç saniye bekleyin. Operatör iğne hücre hazırlık enjekte başlatmak için önce fare kafatası, için "çengel" olma duygusunu tanımayı öğrenmek içindir. Yavaş yavaş (3-5 dakika içinde) hücre hacmini enjekte edilir. Enjeksiyondan sonra ek birkaç saniye yerinde iğne bırakın ve yavaş yavaş şırınga çıkarın.
   6. Cilt kadar dikiş ve tam iyileşme kadar bir kurtarma kafesin içine fare yerleştirin.

5.. Doku İşleme

1. Derin 0.5 ml ketamin ile (100 mg / ml), 0.25 ml ksilazin (23.32 mg / ml) ve 4.25 ml steril suyun bir karışımı ile fareler uyuşturan ve transcardically w, perfüzetuzlu-EDTA ile külleme ve% 4 PFA ile sabitleme. 4 ° C'de 12 saat boyunca% 4 PFA vertebral sütun ve beyinleri ve postfix'i hem Kaldır PBS içinde doku yıkayın, kemiklerden omurilik çıkarın ve 4 ° C 'de (PBS içinde)% 30 sukroz içinde dokuya en az 48 saat bırakın ² açıklandığı gibi, optimum kesim sıcaklığında (Ekim) bileşim dokuları gömmek ve sıvı azot ile dondurma oturtun.
2. 10-12 mikron kalınlığında dilimler halinde dokuları kesmek için bir mikrotom kullanın.
3. Alternatif olarak, agaroz taze doku gömmek ve bir Vibratome 50-80 mikron kalınlığında dilimler kullanılarak doku kesti.
4. Her iki durumda da, 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β nükleer β-galaktosidaz aktivitesi tespit etmek için D-galaktopiranosid (X-gal) çözeltisi 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
5. Astrositler (50 ug / ml), nöronlar için antinöronal nükleer antijen (neun) için antiglial fibriller asidik protein (GFAP) kullanılarak 5 um dilimleri ve çift leke içine β-gal + hücreleri ihtiva eden bölümleri (1 & Recut956., g / ml) ve farklılaşmamış sinir hücreleri (10 ug / ml) için antiNestin.
6. Bölümlerde 1.7.11 ve 1.7.12 de açıklandığı gibi devam edin. Birden lekelemeleri için farklı flüoroforlar ile konjuge sekonder antikorlar kullandığınızdan emin olun.
7. GFP etiketli hücreleri içeren dokular gibi adımlar 5.1-5.3 açıklandığı ilerleyiniz ve çoklu boyamalar ile devam edin.
8. Slaytlar montaj orta birkaç damla ekleyin ve doku lamel ile kaplayın.
9. Ile lekelenmiş bölümler için biyotin konjuge edilmiş antikorlar (bakınız Tablo 2, ABC çözelti) avidin biyotin kompleksi içeren bir çözelti hazırlanması ve 45 dakika için çalkalamada bırakın.
10. Endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için,% 1 H ₂ O ₂ dilim 5 dakika inkübe edin.
11. Iki kez PBS ile yıkayın.
12. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca ABC çözeltisi ile inkübe edin.
13. Iki kez PBS ile yıkayın.
14. 3,3 '-diaminobenzidin çözeltisi ve% 0.3 ₂ H O ₂ kuluçkalayın. Reaksiyon un MonitörBir mikroskop der ve kısa sürede dilim kahverengi (genellikle yaklaşık 5-10 dk) başlar gibi PBS ile yıkayın.
15. PBS ile iki kez yıkayın ve adım 5.7 'de açıklandığı gibi devam edin.

Maddeleri ve kapsamlı listesi Tablo 2'de gösterilmiştir.

Sonuçlar

NPC türetme ve karakterizasyonu
SVZ diseksiyonlar mekanik ve enzimatik ayrışma (Şekil 1A) vasıtası ile 6-8 haftalık C57BL / 6 farelerinin (n = 5-7 farenin / havuz) havuzları üzerinde gerçekleştirilir. CGM kültürlemenin bir kaç gün sonra, serbest yüzen neurospheres (Şekil 1A ve 1B) oluşturulması başlar. Birincil küreler alınır ve mekanik olarak her 4-5 DIV pasajlanır. Pasajlayarak sonra canlı ve ölü hücre sayıları tespit ve kümülati...

Tartışmalar

Somatik kök hücre bazlı terapiler gibi MS2 ¹¹ gibi kronik iltihaplı CNS bozuklukları tedavi etmek için en ümit verici yöntemlerinden biri olarak ortaya çıkmaktadır. Terapötik etkilerini sürdürme mekanizmaları hala tam olarak aydınlatılamamıştır gerekir iken, nörodejeneratif hastalıkların farklı deneysel modellerde NPC naklinin önemli bir etkisi hücreler yakında insan çalışmalar içine uygulanabilir kök biraz kışkırtıcı inanç doğurmuştur. Ancak, bazı önemli sorunları y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
EBSS	Sigma	E2888
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7352
Papain	Worthington	30H11965
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult proliferation supplements	Stem Cell Technologies	05701
Heparin	Sigma	H3393
Basic fibroblast growth factor	Peprotech	100-18B-1000
Epidermal growth factor	Peprotech	AF-100-15-1000
Pen/Strep	Invitrogen	1514012
Matrigel (coating solution)	BD Biosciences	354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse)	Stem Cell Technologies	05704
Accumax	eBioscience	00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg	PAA Laboratories	H15-011
Myco trace	PAA Laboratories	Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum	PAA Laboratories	B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether	Sigma Aldrich	T8787
Mouse anti Nestin	Abcam	ab11306
Rabbit anti GFAP	DAKO	203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)	Abcam	ab14955
Rabbit anti MAP-2	Abcam	ab32454
Rat anti MBP	AbD SEROTEC	MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345	Millipore	MAB345
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting solution	DAKO	S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete	Sigma Aldrich	F5506
Mycobacterium tuberculosis	DIFCO	H37Ra
MOG(35–55)	Espikem
Pertussis toxin	List Biological Laboratories	181
Tissue processing
Iris scissor straight	Fine Sciences Tools	14060-09
Blunt/bended forceps	Fine Sciences Tools	11080-02
Brain slicer	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Surgical blades	Swann-Morton	324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar)	Boehringer Ingelheim	01LC0030
Xylazine (Rompun)	Bayer	32371
Stereotaxic frame	KOPF	Model 900
Hamilton syringe	Hamilton	7762-04
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100