Iniezione sistemica di cellule staminali neurali / progenitrici nei topi con EAE cronica

Riepilogo

Il trapianto di cellule staminali / progenitrici neurali (NPC) detiene grandi promesse in neurologia rigenerativa. La consegna sistematica di NPC è trasformato in efficace protocollo, bassa invasività, e terapeuticamente molto efficace per fornire cellule staminali nel cervello e nel midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale.

Abstract

Cellule staminali / precursori neurali (NPC) sono una fonte di cellule staminali promettente per gli approcci di trapianto finalizzate alla riparazione del cervello o il ripristino in neurologia rigenerativa. Questa direttiva è nata dalla vasta evidenza che la riparazione del cervello è ottenuta dopo trapianto NPC focale o sistemica in diversi modelli preclinici di malattie neurologiche.

Questi dati sperimentali hanno identificato il percorso di consegna cellula come uno dei principali ostacoli di terapie con cellule staminali rigeneranti per le malattie cerebrali che richiede una valutazione urgente. Intraparenchimale trapianto di cellule staminali rappresenta un approccio logico per quelle patologie caratterizzate da isolate e accessibili lesioni cerebrali, quali lesioni del midollo spinale e la malattia di Parkinson. Purtroppo, questo principio è poco applicabile a condizioni caratterizzate da una natura multifocale, infiammatoria e diffusi (sia nel tempo e nello spazio), tra cui la sclerosi multipla (SM). Come tale, il cervello targeting systconsegna NPC emic è diventato un protocollo bassa invasività e terapeuticamente efficace per fornire cellule al cervello e il midollo spinale di roditori e primati non umani affetti da danni infiammatoria cronica sperimentale del sistema nervoso centrale (CNS).

Questo metodo alternativo di consegna delle cellule si basa sul pathotropism NPC, in particolare la loro capacità innata di (i) percepire l'ambiente tramite molecole di adesione cellulare funzionali e citochine e chemochine recettori infiammatori; (Ii) attraversare le perdite barriere anatomiche dopo per via endovenosa (IV). O intracerebroventricolare (ICV) di iniezione; (Iii) accumulare a livello del sito multiplo perivascolare (s), del cervello e del midollo spinale danno infiammatorio; e (iv) esercitare notevole trofico tissutale e effetti regolatori immunitari su diverse cellule bersaglio ospitante in vivo.

Qui si descrivono i metodi che abbiamo sviluppato per il iv. e <em> consegna ICV di NPC singeniche in topi con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), come modello di demielinizzazione infiammatoria cronica del sistema nervoso centrale, e prevedono la consegna delle cellule staminali sistemico come una tecnica preziosa per targeting selettiva del cervello infiammato in neurologia rigenerativa.

Introduzione

Forte evidenza è sorta da studi in vivo che attestano l'efficacia terapeutica del trapianto di cellule somatiche neurali staminali / precursori (NPC) in modelli animali di disturbi al SNC ^1-8. Tuttavia, una serie di questioni relative alla fornitura di cellule staminali nel ospitante richiede un attento esame prima che questi risultati sperimentali possono essere tradotti in applicazioni cliniche. Un ostacolo particolarmente significativo verso lo sviluppo di (ematopoietiche) terapie con cellule staminali rigeneranti per multifocali, malattie infiammatorie cerebrali croniche è l'identificazione del percorso ideale di iniezione NPC. Una solida comprensione della fisiopatologia della malattia mirata (focale o multifocale; degenerativa infiammatoria o primaria primaria), ed un'analisi prudente di questioni di fattibilità e di rischio associati alle tecniche di spedizione sono a individuare il protocollo ottimale per la consegna delle cellule staminali.

Mentre la focale ( Ad es. nel parenchima sistema nervoso) trapianto di cellule staminali è un approccio logico per il trattamento di malattie del SNC caratterizzate da aree spazialmente confinate di danno (ad es Parkinson e la malattia di Huntington, cervello e midollo spinale lesioni traumatiche, e ictus), lo stesso approccio può rivelarsi che sia praticamente non realizzabile in condizioni come la sclerosi multipla, in cui un multifocale, cronica, e spazialmente diffusi danni CNS accumula nel tempo. In quest'ultimo caso, il targeting iniezioni di cellule focali di singole lesioni è inoltre ostacolato dalla limitata capacità di NPC trapiantate per migrare su lunghe distanze all'interno del parenchima nervoso centrale, inducendo quindi l'individuazione di metodi più idonei alternativi di CNS targeting con trapianti NPC meno invasive .

Grande promessa emerso dalle osservazioni che NPC colpiscono un tumore intracranico (ad es. Glioma) nei topi quando iniettato per via endovenosa al di fuori del CNS9. Seguendo questa seminaleevidenza in vivo di cellule staminali pathotrophism ^10, numerosi dati sono stati accumulati relativi alla fattibilità e l'efficacia terapeutica del trapianto sistemico di NPC in animali da laboratorio con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), un modello di danno infiammatorio del SNC, sia via endovenosa (iv) o intracerebroventricolare (ICV). NPC iniezione ^{1,2,5,6,8 ..} Abbiamo prima dimostrato che questo dipende dalla capacità di NPC trapiantate per indirizzare e inserire il SNC infiammato, e di impegnarsi in seguito intercellulare multipla programmi di comunicazione all'interno di microambienti particolari in vivo ^11. Al fine di indirizzare specificamente il CNS, NPC vengono consegnati direttamente nel liquido cerebrospinale (CSF) circolazione mediante iniezione ICV, o nel flusso sanguigno tramite iniezione endovenosa. Una volta immettendo nel flusso sanguigno o CSF, NPC trapiantate interagiscono attivamente conil cervello di sangue (BBB) ​​o di sangue nel liquido cerebrospinale (BCSFB) le barriere e inserire il parenchima del SNC. Questa interazione tra l'innesto NPC e il BBB (o BCSFB) è regolata da specifica serie di molecole di adesione cellulare di superficie NPC (CAM) e facilitato dalla espressione di elevati livelli di CAM contro-ligandi sulla attivati ​​endoteliali / cellule ependimali ^12-14. Esempi di queste camme includono il recettore per ialuronato, CD44, e la molecola di adesione intercellulare (ICAM) -1 ligando molto tardi antigene (VLA) -4 ^5,15,16 (che, nei leucociti, sono responsabili dell'interazione con ependimali attivato e cellule endoteliali), e di un linfocita misura Function-associated Antigen molto più basso (LFA) -1 e P-selectina ligando glicoproteina (PSGL) -1. NPC esprimono anche una vasta gamma di recettori per chemochine, tra cui CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 e CXCR4 (ma non esprimono CCR3 e CCR7), che sono funzionalmente attivi, sia in vitro che in vivo ^5,16. Così, systemicaNPC lly iniettati utilizzano queste camme, insieme a G-proteina recettore accoppiato (GPCR), ad accumularsi a livello del SNC infiammato. Al contrario, PNG iniettato per via sistemica in topi sani non entrare SNC via vascolare o cerebrospinale aeree spazio fluido ^2. CNS infiammazione, o endoteliale / attivazione delle cellule ependimali seguente citochine sistemica o lypopolisaccharide (LPS) iniezione come modello di encefalite indotta chimicamente, è pertanto necessario per l'accumulo di NPC sistematicamente iniettate nel cervello e nel midollo spinale ^2. Così, il targeting successo del SNC con terapie sistemiche NPC dipende dalla identificazione di una finestra specifica malattia di opportunità (woo) in cui il cervello e del midollo spinale ambiente favoriscono l'accumulo e la migrazione transendoteliale di NPC. Tali condizioni generalmente sorgono nel contesto di infiammazione acuta e subacuta ^17. Dopo aver inserito il sistema nervoso centrale, trapiantato NPC indifferenziatihanno dimostrato di migliorare le caratteristiche clinico-patologiche di topi e anche più grandi, primati non umani con EAE. Questo è stato descritto a dipendere da minimal sostituzione cella ² e notevole secrezione di fattori immunitari paracrini regolamentari e neuroprotettivi all'interno perivascolare CNS ^2,5,6,18 vs non-SNC zone infiammate ^19,20 (ad esempio linfonodi) in risposta alla segnalazione di cellule infiammatorie suscitato infiltrandosi cellule immunitarie ^5.

Qui descriviamo gli aspetti chiave metodologici della iniezione sistemica di NPC somatiche in un modello murino di EAE cronica. Più in particolare, si definiscono i protocolli che abbiamo stabilito a (i) Derive, espandere e prepararsi per trapianto NPC somatici dalla zona subventricolare (SVZ) di adulti C57BL / 6 topi; (Ii) indurre EAE cronica in questi topi e (iii) effettuare terapeuticamente efficace sistemica (iv o ICV) trapianto NPC itopi nto EAE.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali vengono eseguite secondo i principi della cura degli animali da laboratorio approvati dalla UK Home Office sotto gli animali (procedure scientifiche) Act 1986 (PPL n ° 80/2457 di SP).

1. Derivazione di Somatic neurali Cellule staminali / progenitrici (NPC) dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello di topi adulti

1. Preparazione di strumenti di dissezione e supporti
   NB: Queste due soluzioni devono essere preparate 1-2 ore prima di strumenti dissezioni sono pronti e preriscaldato a 37 ° C per almeno 20-30 minuti prima dell'uso (aiuta a diluire papaina e ottimizza l'attività enzimatica).
   
   1. Autoclave una forbice tagliente dritto, una piccola forbice chirurgica e due piccole pinze dentellate curve.
   2. Soluzione 'digestione': Preparare due distinte provette da 50 ml con:
      Soluzione # 1: 25 ml di soluzione salina bilanciata (EBSS) + 10 mg di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) + 10 mg L-cisteina di Earle;e
      Soluzione # 2: 25 ml EBSS + 50 mg papaina.
   3. Preparare 'Media Complete crescita' (CGM): completa il mouse medio basale di proliferazione integratori del mouse, eparina 0,002%, fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF; 10 ng / ml), il fattore di crescita epidermico (EGF; 20 ng / ml), e gli antibiotici (Pen / Strep).
2. Cervello dissezione
   NB: La rimozione delle ossa temporali possono facilmente danneggiare il tessuto a causa della loro nitidezza. Per evitare questo, fissare saldamente le ossa con le pinze e tirare fuori fino a quando l'intero osso è stato rimosso.
   
   1. Per ogni preparazione di NPC, cull per dislocazione cervicale n = 5-7, 4-8 settimane di età C57BL / 6 topi.
   2. Pulire con etanolo al 70% (in acqua) il pelo dei topi abbattuti e dietro alle orecchie con la forbice tagliente dritto per rimuovere la testa;
   3. Effettuare una incisione mediana con una piccola forbice chirurgica per tagliare la pelle sopra il cranio. Utilizzando le pinze, piegare le due chiazze di pelle per manifestazionivia e il cranio.
   4. Con la piccola forbice chirurgica eseguire due piccoli tagli alla base del cranio e rimuovere le ossa sotto il ponte / midollo (cranio ventrale). Procedere tirando le ossa temporali. Con la stessa forbice eseguire un taglio lungo tutto il cranio, partendo dalla base alle lampadine, senza danneggiare la superficie del cervello. Inoltre, effettuare un taglio tra le ossa frontali e gli occhi, per facilitare la rimozione delle ossa parietali. Con due pinze iniziare a rimuovere il cranio tirando ciascuna delle ossa parietali verso l'esterno. Mentre si tira, prestare attenzione alle meningi, che può danneggiare il cervello quando le ossa vengono rimossi.
   5. Una volta che il cranio è stato rimosso, far scorrere la pinza tra il cervello e il cranio di staccare completamente le meningi sinistra. Sollevare delicatamente il cervello dal cranio. Tagliare i nervi ottici per rilasciare il cervello ed infine raccogliere il cervello in un tubo con fosfato freddo salina tamponata (PBS).
   6. Mantenere il tubo su un ghiacciod ripetere la stessa procedura per tutti i topi.
3. Saggi dissezione del SVZ, neurosfere di formazione e di manutenzione
   Numero medio di cellule x fattore di diluizione x 10 ⁴
   
   Dove 10 ⁴ rappresenta la conversione del volume totale della camera hematocytometer (volume totale = 0.1 mm ³ -> 10-4 cm ³ -> 10-4 ml). Quando si considera il fattore di diluizione, sia quello fatto con CGM e con il colorante vitale devono essere presi in considerazione. Come esempio, se 160 cellule sono state contate nelle 4 caselle d'angolo, la densità finale (cellule / ml) di sospensione cellulare sarà:
   
   160/4 x 5 (diluizione con CGM) x 2 (diluizione con colorante vitale) x 10 ⁴
   
   1. Attivare un cappuccio dissezione dotato di un microscopio da dissezione.
   2. Pulire tutte le superfici con etanolo al 70% (in acqua), e spruzzare con una soluzione anti Mycoplasma per ridurre il rischio di contaminazione.
   3. Coperturail fondo di un bicchiere con garza sterile (per preservare strumenti affilato) e riempirlo con etanolo al 70% (in acqua). Mettere a bagno nel bicchiere due paia di pinze, un paio di micro forbici e una lama chirurgica.
   4. Porre l'intero cervello sulla matrice cervello-affettatrice.
   5. Utilizzando due lamette eseguono una coronale sezionamento 2 mm dal polo anteriore del cervello, escludendo i tratti ottici, e 3 mm posteriormente al taglio precedente; e posizionare il tessuto su una scatola di Petri pulita.
   6. Sotto il microscopio da dissezione isolare il tessuto SVZ e tagliate a 1 millimetro ³ pezzi con le forbici iridectomia. Ripetere l'operazione per tutti i cervelli.
      1. Mescolare bene le due soluzioni (sezione 1.1.2) sopra e filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron subito dopo i cervelli vengono sezionati e le SVZs sono pronti per essere digerito.
   7. Trasferire le sezioni in 30 ml di soluzione di 'digestione', risospendere delicatamente con a10 pipetta ml ed incubare 30 min a 37 ° C in 5% CO _2. Ogni 15 min scuotere delicatamente il tubo 2-3x.
   8. Centrifugare a 300 xg per 10 min.
   9. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di CGM pipettando prima con un P1000 e poi con una pipetta P200 (10-20x ciascuno), fino ad ottenere una sospensione di cellule singole.
   10. Prendete la sospensione fino a 5 ml con CGM e trasferire ad un pallone T25 cm ^2.
   11. Dopo 5-7 giorni in vitro (DIV) neurosfere formeranno. Raccogliere la sospensione in un tubo di 15 ml e centrifugare 10 min a 150 x g.
   12. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml di CGM.
       Dissociare le neurosfere meccanicamente passaging il cellule 100-150x con una pipetta P200, fino ad ottenere una sospensione singola cella e portarlo fino a 1 ml con CGM.
   13. Diluire la sospensione cellulare, ad esempio, 10 ml di sospensione cellulare in 40 ml di CGM per ottenere una diluizione 1:5, e mescolare bene. Miscelare 10 ml di dilutsospensione cellulare e con 10 pl di una macchia vitale e mescolare bene.
   14. Riempire una camera di conteggio emocitometro con 10 microlitri di una sospensione di cellule 01:01: soluzione colorante vitale. Separatamente contare il numero di (bianco) e morti (blu) cellule vive nelle 4 piazze d'angolo. Per determinare il numero di cellule / ml, applicare il seguente calcolo:
   15. Risospendere 2 x 10 ⁵ cellule in 5 ml di CGM e portarlo in un pallone T25 cm ^2;
   16. Ripetere sezioni 1.3.11-1.3.12 ogni 4-5 DIV. Dal secondo passaggio di espansione in poi, valutare la vitalità cellulare mediante vitale esclusione macchia e iniziare a costruire una curva di crescita continua mediante placcatura NPC a densità clonale (8.000 cellule/cm2), come descritto ^21. Tenere i numeri di cellulare e ripetere la procedura ogni 4-5 DIV. Per generare una curva di crescita continua, procedere come segue:
       NB: Per avere una buona preparazione di cellule, dopo 4-5 sfere DIV dovrebbero aver raggiunto un diametro di 150-200 micron. Per avere una buona stima di tegli cellula densità, è importante trovare un fattore di diluizione ottimale per avere celle sovrapposte, ben distribuite in tutta la hematocytometer. Idealmente, ci dovrebbe essere tra 50-200 cellule totali. Quando il conteggio, solo le cellule compresi nella piazza senza toccare i bordi devono essere considerati. Inoltre, la vitalità delle cellule è un fattore cruciale per avere una preparazione sano. Importante, dovrebbe essere maggiore di 90%. Una curva di crescita lineare è un altro indicatore di un preparato di cellule sane.
       
       1. Contare il numero di cellule vive e morte (es 1.3 x 10 ^6).
       2. Definire il tasso di crescita dividendo il numero di cellule vive per il numero di cellule piastrate (ad esempio 1,3 x 10 ^6/2 x 10 ⁵ = 6.5).
       3. Calcolare il numero totale di cellule moltiplicando il tasso di crescita per il numero totale di cellule presenti nel punto di tempo precedente (all'inizio = 2 x 10 ^5).
       4. Riportare la media7; deviazione standard per costruire una linea di tendenza lineare.
   17. A partire dal passaggio 6, dissociazione meccanica è sostituito dal dissociazione enzimatica. Dopo centrifugazione a 150 xg per 10 min, rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 200 ml di soluzione di dissociazione cellulare aggregato, risospendere 7-8x con P200 e incubare 10 min a 37 ° C, 5% CO _2.
   18. Risospendere 7-8x con P200 per ottenere una sospensione di cellule singole e aggiungere 800 ml di CGM. Contare le cellule (sia vivi e morti) e stabilire la loro vitalità. Risospendere 2 x 10 ⁵ cellule in 5 ml di CGM e portarlo in un pallone T25 cm ^2.
4. Trasduzione virale di NPC per il monitoraggio in vivo delle cellule
   NB: Per verificare l'efficienza di trasduzione virale, costruire una curva di crescita in parallelo con gli NPC trasdotte e nontransduced. Inoltre, l'efficienza clonale, cioè il numero assoluto di cellule neurosfere formando presente all'interno di un preparato cellularezione o una analisi del ciclo cellulare per contenuto di DNA (con ioduro di propidio, PI), possono essere utilizzati come ulteriori indicazioni dello stato delle cellule. Se la percentuale di cellule infettate non dovrebbe essere buono, il protocollo di trasduzione virale può essere ripetuta una seconda volta con la stessa popolazione di cellule. Una volta che il livello di infezione è soddisfacente e la curva di crescita è simile a quello ottenuto con le cellule di tipo selvatico, NPC trasdotte possono essere espansi e / o trapiantate.
   
   1. Raccogliere le neurosfere e ottenere una sospensione singola cella. Piastra le cellule ad alta densità (1,5 x 10 ⁶ cellule in un pallone T75 cm ²⁾ in 10 ml CGM.
   2. Dopo 12 ore aggiungere 3 x 10 ⁶ TU / ml di una terza generazione di vettori lentivirali pRRLsin. PPT-hCMV costruito con la E. coli derivato β-galattosidasi (lacZ) o con la proteina fluorescente verde (GFP).
   3. 48 ore più tardi, raccogliere le cellule, centrifugare a 300 xg per 10 min e replate le cellule con un rapporto 1:1.
   4. Dopo3 passaggi in vitro verifica dell'efficienza dell'infezione. La citometria a flusso è comunemente usato per testare l'efficacia infezione, e il livello soddisfacente di infezione è comunemente accettato per essere nell'intervallo di 75-95% di cellule positive. Controllare nuovamente l'efficienza dell'infezione dopo 3 ulteriori passaggi di espansione per verificare il mantenimento dell'espressione marcatore.
5. Neurosfere di congelamento
   1. Raccogliere le neurosfere da un pallone T25 cm ^2, centrifugare a 300 xg per 10 min, e scartare il surnatante.
   2. Risospendere il pellet con 1 ml di congelamento media (CGM con 10% dimetilsolfossido (DMSO).
   3. Posizionare i cryovials a -80 ° C in un contenitore di congelamento.
   4. Dopo almeno 24 h spostare le cellule ad una cryobox e conservare a -80 ° C per mesi, o portare ad azoto liquido (N ₂₎ per una conservazione più lunga.
6. Neurosfere scongelamento
   NB: Per evitare gli effetti tossici di contatto prolungato of NPC con DMSO, il processo di scongelamento deve essere il più veloce possibile.
   
   1. Rimuovere il esageratamente dal -80 ° C / N ₂ e mantenere in ghiaccio secco.
   2. Scongelare rapidamente il flacone a bagnomaria, fino a quasi tutta la sospensione cellulare viene scongelato e solo un piccolo pezzo di sospensione ghiacciata rimane.
   3. Risospendere la sospensione cellulare con 5 ml di preriscaldata fresco CGM.
   4. Centrifugare a 300 xg per 10 min.
   5. Rimuovere il surnatante, risospendere delicatamente con 5 ml di fresco CGM e piastra sospensione di cellule in una beuta pulita, greggia T25 cm ^2.
7. 1.7) Caratterizzazione NPC
   NB: L'ultimo lavaggio PBS può essere sostituito con il 0,05% di sodio azide-PBS per prevenire la crescita di funghi o contaminazioni, e coverslides sono conservati a 4 ° C per 2-3 settimane.
   
   NB: Per colorare per i marcatori intracellulari aggiungere un agente permeabile al PBS nella soluzione di blocco. Se l'origine dell'anticorpo primario è capra, siero bovino albumin (BSA) o siero di diverso capra dovrebbero essere utilizzati.
   
   NB: a macchia di marcatori intracellulare utilizzare un agente permeabile nella soluzione di anticorpo primario.
   
   1. Posizionare un coverslide vetro 13 millimetri sul fondo di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 150 ml di soluzione di rivestimento sulla parte superiore di ogni coverslide per creare una piccola goccia. Incubare per almeno 30 min a 37 ° C, 5% CO _2.
   2. Raccogliere le neurosfere e dissociare per ottenere una sospensione singola cella.
   3. Contare le cellule vive e diluire per ottenere 80.000 cells/35 microlitri. Rimuovere l'eccesso di soluzione di rivestimento dal coverslide aspirando delicatamente, e piastra 35 microlitri di sospensione cellulare.
   4. Incubare 25 minuti a 37 ° C, 5% CO _2. Controllare rapidamente al microscopio a contrasto di fase, se le cellule hanno iniziato ad aderire.
   5. Preparare il terreno di differenziamento mescolando medio basale del mouse con i supplementi adeguati (cfr. tabella 1) e antibiotici (Pen / Strep).
   6. Aggiungere 400 ml di terreno di differenziamento e incubare a 37 ° C, 5% CO _2.
   7. Dopo 3 DIV, cambiamento metà del mezzo con terreno di differenziamento fresco.
   8. Dopo 6 DIV, rimuovere il terreno e lavare una volta con PBS. Sotto cappa chimica rimuovere il PBS e aggiungere 300 ml di preriscaldata 4% paraformaldeide (PFA) 4% di saccarosio. Incubare per 5 min a temperatura ambiente (RT). Rimuovere la PFA e lavare 3x con PBS.
   9. Per procedere con immunocitochimica, rimuovere il PBS e bloccare con PBS 10% di siero normale di capra (NGS) (soluzione blocco), e incubare 1 ora a temperatura ambiente.
   10. Rimuovere la soluzione di saturazione e aggiungere l'anticorpo primario desiderato diluito con PBS 1% NGS. Incubare a 4 ° CO / N o, in alternativa, 120 min a RT.
   11. Dopo l'incubazione, lavare 2x con PBS. Incubare con l'anticorpo secondario appropriato diluito con PBS 1% NGS. Incubare 60 minuti a temperatura ambiente.
   12. Lavare 2x con PBS e contro-macchiare i nuclei con 4 ',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluito 1:20.000 con PBS agente permeabilizzante per 3 min a temperatura ambiente al buio. Lavare due volte con PBS ed una volta con acqua distillata.
   13. Mettere una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino tessuto di vetro e con una pinza montare il coverslide con le cellule di fronte al mezzo di montaggio. Premere delicatamente il coverslide di spremere l'eccesso di mezzo di montaggio. Lasciare il coverslide al buio a temperatura ambiente fino a quando il mezzo di montaggio viene essiccato e conservare a 4 ° C.

Autoimmunità sperimentale 2. Mielina Oligodendrocyte glicoproteina (MOG) indotta in C57Bl / 6 Mice

1. Preparazione della emulsione
   1. In un bicchiere di vetro preparare un'emulsione composta di adiuvante incompleto di Freund contenente 4 mg / ml di Mycobacterium tuberculosis [altrimenti definito come adiuvante di Freund completo (CFA)] e 200 pg di MOG (peptide 35-55), considerando che la quantità totale di emulsione per topo sarà 300 ml.
      NB: Stanziate controlli di topi MOG-immunizzati in CFA sono topi immunizzati con solo CFA. La varianza atteso di insorgenza della malattia nei topi MOG-immunizzati è 11,3 (± 1,8) dpi.
      
      NB: Quando si calcola il volume totale di emulsione necessaria, considerare il doppio volume come il numero di topi per immunizzare. Vetro devono essere preferito Plasticware per minimizzare lo spreco di parte dell'emulsione.
      
      1. Con una siringa di vetro con una miscela 19 ago G per circa 30 minuti, mantenendo sempre l'emulsione su ghiaccio.
      2. Per verificare se l'emulsione è pronto, cadere una piccola quantità di emulsione acqua. L'emulsione è pronta per essere iniettata solo se la goccia rimane così com'è e non si disperde.
      3. Immunizzare il gruppo di controllo di topi con solo CFA. Trattare topi sperimentali (MOG immunizzati) con MOG in CFA. La varianza atteso di insorgenza della malattia in topi immunizzati MOG è 11,3 (± 1,8) dpi.
   2. Trasferire il ago 19 G a un 1 ml di plastica siringa unnd aspirare l'emulsione. Evitare le bolle, cambiare l'ago con un 25 G e lasciare la siringa sul ghiaccio. Siringhe riempite con l'emulsione sono pronti per essere utilizzati e devono essere tenuti in ghiaccio per un paio di ore.
2. Immunizzazione
   1. Posizionare i topi (6-8 settimane di età, di sesso femminile) in una scatola di riscaldamento e attendere circa 10 minuti per consentire la vena della coda a dilatarsi.
   2. Trasferire un mouse dalla casella di riscaldamento ad un dispositivo di immobilizzazione mouse. Chiudere il dispositivo di immobilizzazione per evitare qualsiasi movimento del mouse.
   3. Riempire una siringa da insulina da 1 ml con 100 ml di tossina della pertosse (5 mg / ml), evitando fare bolle. Iniettare lentamente la soluzione nella vena caudale. Rimuovere l'ago e premere per alcuni secondi con un pezzo di carta per collegare l'emorragia.
   4. Posizionare il mouse indietro nella gabbia e ripetere la stessa procedura per tutti i topi.
   5. Anestetizzare un mouse con inalazione continua isoflurano (1-2%, 2 L / min) e iniettare 100 ml di emulsione per via sottocutanea a livellodei due fianchi e la base della coda (300 microlitri emulsione / topo). Rimuovere lentamente la siringa, evitando la dispersione dell'emulsione.
   6. Segnare il mouse con un perforatore orecchio, posizionare il mouse nella gabbia e controllare fino al pieno recupero. Ripetere l'operazione per tutti i topi.
   7. Dopo 48 ore (due giorni dopo la vaccinazione, dpi) la ripetizione della sezione 2.2.3.
3. Analisi comportamentale dei topi EAE
   1. Partendo da 5 dpi, pesare i topi giornaliero e monitorare le loro prestazioni locomotorie utilizzando il sistema di punteggio scala descritto nella Tabella 1.

3. Iniezione di neurali Cellule staminali / progenitrici nella vena della coda (iv)

1. Preparazione cellulare
   1. Neurosfere raccolto per centrifugazione a 300 xg per 10 min.
   2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 ml di soluzione di cellule dissociazione aggregato. Incubare 10 minuti a 37 ° C, 5% CO _2.
   3. Risospendere delicatamente 10-12x (avoiding bolle) con P200 fino ad ottenere una sospensione singola cella e prendono a 800 ml con medio basale senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
   4. Contare le cellule utilizzando un colorante vitale per saggiare la vitalità cellulare e diluire la sospensione con terreno base senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} per ottenere una densità finale di 10 microlitri cells/150 ^6. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. NPC iniezione iv
   NB: La dissociazione ideale in sospensione di cellule singole e l'assenza di bolle d'aria sono due aspetti chiave da considerare per ridurre il rischio di entrambi i grumi / aggregati contro la formazione di emboli che possono provocare occlusione venosa e conseguente morte.
   
   1. Al culmine della malattia (16-18 dpi), pesare e segnare i topi. Distribuire i topi base al loro punteggio in modo da avere gruppi omogenei.
   2. Mettere i topi in una scatola di riscaldamento e attendere circa 10 minuti per consentire la vena della coda a dilatarsi.
   3. Trasferire un mouse dalla casella di riscaldamento ad un dispositivo di immobilizzazione mouse. Chiudere il dispositivo di immobilizzazione per evitare qualsiasi movimento del mouse.
   4. Riempire una siringa da insulina da 1 ml con 150 ml di sospensione cellulare e assicurarsi di rimuovere tutte le bolle. Iniettare lentamente la soluzione nella vena caudale. Rimuovere l'ago e premere per alcuni secondi con un pezzo di carta per collegare il sanguinamento (Figure 6A e 6B).
   5. Posizionare il mouse nella gabbia e controllare fino al recupero. Ripetere la stessa procedura per tutti i topi.

4. Iniezione di neurali Cellule staminali / progenitrici nel Cisterna Magna (ICV)

1. Preparazione cellulare
   1. NPC raccolto per centrifugazione a 300 xg per 10 min.
   2. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 ml di soluzione di cellule dissociazione aggregato. Incubare 10 minuti a 37 ° C, 5% CO _2.
   3. Risospendere delicatamente 10-12x con P200 fino ad ottenere un unico csospensione ell e prendere a 800 ml con medio basale senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +.}
   4. Contare le cellule e diluire la sospensione con terreno base senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +} avere la densità cellulare desiderata. Mantenere la sospensione cellulare in ghiaccio fino al momento dell'uso.
2. 4.2) iniezione NPC ICV
   1. Al culmine della malattia (16-18 dpi), pesare e segnare i topi. Distribuire i topi base al loro punteggio in modo da avere gruppi omogenei.
   2. Posizionare il mouse su un apparato stereotassico sotto inalazione continua isoflurano (1-2%, 2 L / min). Fissare la testa del topo con le barre orecchio. Quindi regolare sia la bocca e naselli. Assicurarsi che la testa del topo è piatta e fissa.
   3. Tamponare la testa del topo con povidone-iodio (PVP-I) ed effettuare una incisione per tagliare la pelle nella parte posteriore della testa per esporre il cranio.
   4. Utilizzando un micromanipolatore, inserire la punta di un microlsiringa iter nella fessura tra l'occipite e la vertebra atlante attraverso i muscoli intatti e legamenti della linea mediana nella parte posteriore del collo. La parte piegata dell'ago viene mantenuta in stretto contatto con la superficie interna della regione occipitale per tutta la lunghezza, come descritto ^22.
   5. Inserire lentamente l'ago e attendere qualche secondo. L'operatore ha lo scopo di imparare a riconoscere la sensazione dell'ago essere "agganciato" al cranio del mouse, prima di iniziare l'iniezione della preparazione cellulare. Iniettare lentamente il volume delle cellule (in 3-5 min). Lasciare l'ago in posizione per ulteriori pochi secondi dopo l'iniezione e rimuovere lentamente la siringa.
   6. Ricucire la pelle e posizionare il mouse in una gabbia di recupero fino al pieno recupero.

5. Tissue Processing

1. Profondamente anestetizzare il mouse con una miscela di 0,5 ml di ketamina (100 mg / ml), 0,25 ml xilazina (23,32 mg / ml) e 4,25 ml di acqua sterile e transcardically profumato, wincenerimento con soluzione salina-EDTA e fissaggio con il 4% PFA. Rimuovere entrambe le colonne vertebrali e cervelli e postfix nel 4% PFA per 12 ore a 4 ° C. Lavare il tessuto in PBS, rimuovere midollo spinale dalle ossa e lasciare il tessuto almeno 48 ore in saccarosio al 30% (in PBS) a 4 ° C. Incorporare i tessuti in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e far scattare il congelamento con azoto liquido, come descritto ^2.
2. Utilizzare un microtomo per tagliare i tessuti in 10-12 micron fette spesse.
3. In alternativa, incorporare tessuto fresco in agarosio e tagliare il tessuto utilizzando un vibratome 50-80 micron fette spesse.
4. In entrambi i casi, incubare O / N a 37 ° C in soluzione di D-galattopiranoside (X-gal) per rilevare l'attività β-galattosidasi nucleare indolil-β-cloro-3-5-bromo-4.
5. Ritagliare sezioni contenenti β-gal + cellule in 5 micron fette e doppia macchia con fibrillare antiglial proteina acida (GFAP) per gli astrociti (50 mg / ml), antigene nucleare antineuronali (NeuN) per i neuroni (1 &# 956; g / ml) e antiNestin per le cellule neurali indifferenziate (10 mcg / ml).
6. Procedere come descritto nei paragrafi 1.7.11 e 1.7.12. Per più colorazioni assicurarsi di utilizzare anticorpi secondari coniugati con differenti fluorofori.
7. Per i tessuti contenenti cellule GFP etichettati procedere come spiegato nei passaggi 5,1-5,3 e procedere con le molteplici colorazioni.
8. Aggiungere alcune gocce di soluzione di montaggio per le diapositive e coprire con un vetrino tessuto.
9. Per le sezioni colorate con anticorpi coniugati biotina preparare una soluzione di avidina complesso di biotina (soluzione ABC, vedi Tabella 2) e lasciare in agitazione per 45 min.
10. Incubare le fette 5 min con 1% H ₂ O ₂ per bloccare l'attività della perossidasi endogena.
11. Lavare due volte con PBS.
12. Incubare con la soluzione ABC per 1 ora a RT.
13. Lavare due volte con PBS.
14. Incubare con la soluzione di 3,3 '-diaminobenzidina e 0,3% H ₂ O _2. Monitorare la reazione delle Nazioni Uniteder un microscopio e lavare con PBS appena la fetta iniziare a ricevere marrone (di solito circa 5-10 min).
15. Lavare due volte con PBS e procedere come descritto al punto 5.7.

Elenco completo di materiali e reagenti è mostrato nella Tabella 2.

Risultati

NPC derivazione e caratterizzazione
Dissezioni SVZ vengono eseguite su piscine (n = 5-7 topi / pool) di 6-8 settimane di età C57BL / 6 topi mediante dissociazione meccanica ed enzimatica (Figura 1A). Dopo alcuni giorni di coltura in CGM, neurosfere free-floating iniziano a formarsi (Figure 1A e 1B). Sfere primarie sono raccolti e meccanicamente diversi passaggi ogni 4-5 DIV. Su passaging, numero di cellule vive e morte di accertate e numero di cellule cumulativi...

Discussione

Terapie basate sulle cellule staminali somatiche stanno emergendo come una delle strategie più promettenti per il trattamento di malattie croniche infiammatorie del sistema nervoso centrale come MS2 ^11. Mentre i meccanismi che sostengono i loro effetti terapeutici devono ancora essere completamente chiarito, l'impatto significativo della NPC trapianto in diversi modelli sperimentali di malattie neurodegenerative ha dato origine alla credenza un po 'provocatorio che le cellule staminali potrebbero pre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
EBSS	Sigma	E2888
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7352
Papain	Worthington	30H11965
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult proliferation supplements	Stem Cell Technologies	05701
Heparin	Sigma	H3393
Basic fibroblast growth factor	Peprotech	100-18B-1000
Epidermal growth factor	Peprotech	AF-100-15-1000
Pen/Strep	Invitrogen	1514012
Matrigel (coating solution)	BD Biosciences	354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse)	Stem Cell Technologies	05704
Accumax	eBioscience	00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg	PAA Laboratories	H15-011
Myco trace	PAA Laboratories	Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum	PAA Laboratories	B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether	Sigma Aldrich	T8787
Mouse anti Nestin	Abcam	ab11306
Rabbit anti GFAP	DAKO	203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)	Abcam	ab14955
Rabbit anti MAP-2	Abcam	ab32454
Rat anti MBP	AbD SEROTEC	MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345	Millipore	MAB345
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting solution	DAKO	S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete	Sigma Aldrich	F5506
Mycobacterium tuberculosis	DIFCO	H37Ra
MOG(35–55)	Espikem
Pertussis toxin	List Biological Laboratories	181
Tissue processing
Iris scissor straight	Fine Sciences Tools	14060-09
Blunt/bended forceps	Fine Sciences Tools	11080-02
Brain slicer	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Surgical blades	Swann-Morton	324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar)	Boehringer Ingelheim	01LC0030
Xylazine (Rompun)	Bayer	32371
Stereotaxic frame	KOPF	Model 900
Hamilton syringe	Hamilton	7762-04
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100