Injection systémique de cellules neurales souches / progénitrices chez des souris atteintes d'EAE chronique

Résumé

La transplantation de cellules souches / progénitrices neurales (PNJ) détient de grandes promesses en neurologie régénérative. L'administration systémique de PNJ est devenu faible invasive, et thérapeutique très efficace protocole efficace, pour fournir des cellules souches dans le cerveau et la moelle épinière des rongeurs et des primates non humains touchés par les dégâts inflammatoire chronique expérimentale du système nerveux central.

Résumé

Cellules souches / précurseurs neurales (PNJ) sont une source de cellules souches prometteuses pour les approches de transplantation visant à la réparation du cerveau ou de la restauration en neurologie régénérative. Cette directive a surgi de nombreux éléments de preuve que la réparation du cerveau est atteint après la transplantation PNJ focale ou systémique dans plusieurs modèles précliniques de maladies neurologiques.

Ces données expérimentales ont identifié l'itinéraire de livraison de cellule comme l'un des principaux obstacles de thérapies de cellules souches réparatrices pour les maladies du cerveau qui nécessite une évaluation urgente. Intraparenchymateuse greffe de cellules souches représente une approche logique de ces pathologies caractérisées par des lésions cérébrales isolées et accessibles tels que les blessures de la moelle épinière et la maladie de Parkinson. Malheureusement, ce principe est applicable à mal des conditions caractérisées par une nature multifocale, inflammatoire et disséminée (dans le temps et dans l'espace), y compris la sclérose en plaques (MS). En tant que tel, le cerveau ciblage par systlivraison PNJ émique est devenu un peu protocole thérapeutique invasive et efficace pour fournir des cellules du cerveau et la moelle épinière des rongeurs et des primates non humains touchés par les dégâts inflammatoire chronique expérimentale du système nerveux central (SNC).

Cette méthode alternative de livraison de cellule repose sur la pathotropism PNJ, en particulier leur capacité innée à (i) détecter l'environnement via des molécules d'adhésion cellulaire fonctionnels et cytokines et chimiokines inflammatoires récepteurs; (Ii) franchir les barrières anatomiques fuite après administration intraveineuse (iv). Ou intracérébroventriculaire (icv) injection; (Iii) s'accumulent au niveau du site de périvasculaire multiple (s) de inflammatoire cerveau et la moelle épinière des dommages; et (iv) exercer trophique de tissu remarquable et des effets régulateurs immunitaires sur différentes cellules cibles de l'hôte in vivo.

Nous décrivons ici les méthodes que nous avons développées pour la iv. et <em> livraison icv de PNJ syngéniques chez la souris avec l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), comme modèle de démyélinisation inflammatoire chronique du système nerveux central, et envisager la livraison de cellules souches systémique comme une technique utile pour le ciblage sélectif du cerveau enflammé en neurologie régénérative.

Introduction

Des preuves solides ont surgi de in vivo attestant de l'efficacité thérapeutique de la transplantation de cellules somatiques neurales souches / précurseurs (PNJ) dans des modèles animaux de troubles du SNC ^1-8. Néanmoins, un certain nombre de questions relatives à la livraison de cellules souches dans l'hôte nécessite un examen attentif avant ces résultats expérimentaux peuvent être convertis en applications cliniques. Un obstacle particulier important vers le développement de (non-hématopoïétiques) réparatrice thérapies de cellules souches pour les maladies inflammatoires chroniques multifocales, cerveau est l'identification de l'itinéraire idéal d'injection PNJ. Une bonne compréhension de la physiopathologie de la maladie ciblée (focale ou multifocale; dégénérative inflammatoire ou primaire primaire), et une analyse prudente des questions de faisabilité et des risques associés aux techniques de livraison sont en identifiant le protocole optimal pour la livraison de cellules souches.

Bien que la focale ( Par exemple. dans le parenchyme du système nerveux) transplantation de cellules souches est une approche logique pour le traitement des maladies du système nerveux central caractérisée par des zones spatialement confinés de dommages (par exemple la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington, le cerveau et la moelle épinière des blessures traumatiques, et accident vasculaire cérébral), la même approche peut s'avérer être pratiquement impossible dans des conditions telles que MS, où un dommage multifocale, chronique, et dans l'espace diffusées CNS s'accumule au fil du temps. Dans ce dernier cas, le ciblage des injections de cellules focales de lésions individuelles est également entravé par la capacité limitée des PNJ transplantés à migrer sur de longues distances dans le parenchyme du SNC, incitant ainsi l'identification de méthodes alternatives, plus appropriés de SNC visant avec greffes NPC moins invasives .

Grande promesse émergé des observations que les PNJ ciblent une tumeur intracrânienne (par exemple. Gliome) chez la souris lorsqu'il est injecté par voie intravasculaire en dehors de la CNS9. Suite à cette séminaldes preuves in vivo de la pathotrophism de cellules souches ^10, de nombreuses données ont été accumulées concernant la faisabilité et l'efficacité thérapeutique de la transplantation systémique des PNJ dans les animaux de laboratoire avec l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), comme un modèle de lésions inflammatoires du système nerveux central, soit par voie intraveineuse (iv) ou intracérébroventriculaire (ICV). d'injection PNJ ^{1,2,5,6,8 ..} Nous avons tout d'abord montré que cela dépend de la capacité des PNJ transplantés à cibler et à entrer dans le système nerveux central enflammée, et d'engager ensuite intercellulaire multiple programmes de communication au sein de micro-environnements spécifiques in vivo ^11. Afin de cibler spécifiquement le système nerveux central, les PNJ sont livrés directement dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) de circulation par injection icv, ou dans la circulation sanguine par injection intraveineuse. Une fois entré dans la circulation sanguine soit ou CSF, PNJ transplantées interagissent activement avecle cerveau (BHE) ou du sang liquide céphalo-rachidien (BCSFB) des barrières et entrer dans le parenchyme du SNC. Cette interaction entre le greffon NPC et le Bureau (ou BCSFB) est régie par ensemble spécifique de molécules d'adhésion cellulaire de surface PNJ (CAMs) et facilitée par l'expression de niveaux élevés de MCP contre-ligands sur endothéliales / cellules épendymaires activées ^12-14. Des exemples de ces cames comprennent le récepteur de l'acide hyaluronique, CD44, et la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM) -1 ligand antigène très tardif (VLA) -4 ^5,15,16 (qui, dans les leucocytes, sont responsables de l'interaction avec épendymaire activé et des cellules endothéliales), et à un antigène des lymphocytes beaucoup plus faible de mesure associé aux fonctions (LFA) -1 et la glycoprotéine P-sélectine ligand (PSGL) -1. NPC expriment également une large gamme de récepteurs de chimiokine, y compris CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3, et CXCR4 (mais n'expriment pas CCR3 et CCR7), qui sont fonctionnellement actifs, à la fois in vitro et in vivo ^5,16. Ainsi, SystemicaNPC lly injectés utilisent ces CAMs, avec G-protein coupled receptor (GPCR), à s'accumuler au niveau de l'inflammation du système nerveux central. Inversement, les PNJ injecté par voie systémique chez des souris en bonne santé ne pas entrer dans le système nerveux central via vasculaire ou des routes spatiales liquide céphalo-rachidien ^2. L'inflammation du système nerveux central, ou endothéliale / activation des cellules épendymaires suivante cytokine systémique ou lypopolisaccharide (LPS) injection comme un modèle d'encéphalite induite chimiquement, est donc nécessaire pour l'accumulation de PNJ systémique injectées dans le cerveau et la moelle épinière ^2. Ainsi, le ciblage réussi de la CNS avec les thérapies systémiques NPC dépend de l'identification d'une fenêtre spécifique de la maladie de chances (WoO) dont le cerveau et l'environnement de la moelle épinière sont propices à l'accumulation et la migration trans de PNJ. De telles conditions se présentent généralement, dans le contexte de l'inflammation aiguë et subaiguë ^17. Une fois après avoir entré le CNS, transplanté PNJ indifférenciéesse sont révélés améliorer les caractéristiques clinico-pathologiques de la souris ainsi que de plus grands primates non humains, atteintes d'EAE. Ceci a été décrit comme dépendant de minime remplacement des cellules ² et remarquable sécrétion de facteurs immunitaires paracrines réglementaires et neuroprotecteurs dans périvasculaire CNS ^2,5,6,18 vs non-SNC zones enflammées ^19,20 (par exemple les ganglions lymphatiques) en réponse à la signalisation cellulaire inflammatoire provoquée par l'infiltration des cellules immunitaires ^5.

Nous décrivons ici les aspects méthodologiques de l'injection systémique de PNJ somatiques dans un modèle de souris de l'EAE chronique. Plus précisément, nous définissons les protocoles que nous avons établies pour (i) résultent, développer et préparer transplantation PNJ somatiques de la zone sous-ventriculaire (SVZ) des adultes C57BL / 6; (Ii) induire l'EAE chronique chez ces souris et (iii) effectuer thérapeutiquement efficace systémique (iv ou icv) PNJ transplantation isouris nto EAE.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux sont effectués selon les principes de protection des animaux de laboratoire approuvé par le Home Office du Royaume-Uni dans les animaux (procédures scientifiques) de 1986 (PPL n ° 80/2457 de SP).

1. Dérivation de cellules somatiques de neurones souches / progénitrices (PNJ) de la zone sous-ventriculaire (SVZ) du cerveau de souris adulte

1. Préparation des instruments de dissection et les médias
   NB: Ces deux solutions doivent être préparées 1-2 heures avant instruments de dissections sont prêts et préchauffé à 37 ° C au moins 20-30 minutes avant de l'utiliser (il contribue à diluer la papaïne et optimise l'activité enzymatique).
   
   1. Autoclave d'un ciseau pointu droite, un petit ciseau chirurgical et deux petites pinces dentelées courbes.
   2. Solution 'digestion': Préparer deux tubes de 50 ml distincts avec:
      Solution n ° 1: 25 ml solution saline acide éthylènediamine (EBSS) + 10 mg (EDTA) + 10 mg L-cystéine équilibré Earle;et
      Solution n ° 2: 25 ml EBSS + 50 mg de papaïne.
   3. Préparer "milieu de croissance complet» (CGM): toutes milieu de base de la souris avec des suppléments de prolifération de souris, des héparines de 0,002%, facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF, 10 ng / ml), du facteur épidermique de croissance (EGF, 20 ng / ml) et des antibiotiques (Pen / Strep).
2. dissection du cerveau
   NB: Le retrait de l'os temporal peut facilement endommager les tissus en raison de leur netteté. Pour éviter cela, fixer solidement les os avec la pince et tirez jusqu'à ce que toute l'os a été enlevée.
   
   1. Pour chaque préparation de PNJ, abattage par dislocation cervicale n = 5-7, 4-8 semaines vieilles souris C57BL / 6.
   2. Nettoyer avec 70% d'éthanol (dans l'eau) les cheveux des souris de réforme et en arrière des oreilles avec les ciseaux pointu droite pour enlever la tête;
   3. Faire une incision médiane à l'aide d'un petit ciseau chirurgical pour couper la peau sur le crâne. Utilisation de la pince, plier les deux taches de la peau à des expose le crâne.
   4. Avec le petit ciseau chirurgical effectuer deux petites coupes à la base du crâne et enlever les os sous la protubérance / médullaire (de crâne ventrale). Passez en tirant sur les os temporaux. Avec le même ciseau effectuer une coupe le long du crâne, à partir de la base de l'ampoule, sans endommager la surface du cerveau. En outre, effectuer une coupe entre les os frontaux et les yeux, afin de faciliter l'enlèvement des os pariétaux. Avec deux pinces commencent retirer le crâne en tirant chacun des os pariétaux vers l'extérieur. Tout en tirant, faire attention aux méninges, ce qui peut endommager le cerveau lorsque les os sont enlevés.
   5. Une fois que le crâne a été supprimé, faites glisser la pince entre le cerveau et le crâne de détacher complètement les méninges à gauche. Soulevez délicatement le cerveau du crâne. Couper les nerfs optiques pour libérer le cerveau et finalement recueillir le cerveau dans un tube avec une solution saline tamponnée phosphate froide (PBS).
   6. Garder le tube sur une glaced Répétez la même procédure pour toutes les souris.
3. Essais Dissection de la SVZ, neurosphère formation et de maintenance
   Nombre moyen de cellules x facteur de dilution x 10 ⁴
   
   Lorsque 10 la ^{figure 4} représente la conversion du volume total de la chambre de hématocytomètre (volume total = 0,1 mm ³ -> 10-4 cm ³ -> 4.10 ml). Lors de l'examen du facteur de dilution, une fois le fait avec la CGM et avec le colorant vital doivent être pris en considération. A titre d'exemple, si 160 cellules ont été comptées dans les quatre cases d'angle, la densité finale (cellules / ml) de la suspension cellulaire sera:
   
   160/4 x 5 (dilution avec CGM) x 2 (dilution avec coloration vitale) x 10 ⁴
   
   1. Allumer une hotte à dissection équipé d'un microscope à dissection.
   2. Nettoyer toutes les surfaces avec de l'éthanol à 70% (dans l'eau), et pulvériser avec une solution anti Mycoplasma à réduire le risque de contamination.
   3. Couverturele fond d'un bécher avec de la gaze stérile (pour préserver les instruments pointus) et le remplir avec 70% d'éthanol (dans l'eau). Faire tremper dans le bécher de deux paires de pinces, une paire de ciseaux micro et une lame chirurgicale.
   4. Placez l'ensemble du cerveau sur la matrice cerveau-trancheuse.
   5. L'utilisation de deux lames de rasoir effectuer un sectionnement frontal 2 mm depuis le pôle antérieur du cerveau, à l'exception des voies optiques, et 3 mm en arrière de la coupe précédente; et placer le tissu sur une boîte de Petri propre.
   6. Sous le microscope de dissection isoler le tissu SVZ et les couper en 1 mm ³ pièces à l'aide de ciseaux iridectomie. Répétez l'opération pour tous les cerveaux.
      1. Mélangez bien les deux solutions (section 1.1.2) ci-dessus et filtrer à travers un filtre de 0,22 um immédiatement après les cerveaux sont disséqués et les SVZs sont prêts à être digéré.
   7. Transférer les sections dans 30 ml de solution 'digestion', remettre en suspension doucement avec a10 ml pipette et incuber 30 min à 37 ° C dans 5% de CO _2. Toutes les 15 min secouer délicatement le tube 2-3x.
   8. Centrifuger à 300 g pendant 10 min.
   9. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de CGM par pipetage d'abord avec une P1000, puis avec une pipette P200 (10-20x chacun), jusqu'à l'obtention d'une suspension cellulaire unique.
   10. Prenez la suspension jusqu'à 5 ml avec CGM et transférer dans une fiole T25 cm ^2.
   11. Après 5-7 jours in vitro (DIV) neurosphères se forment. Recueillir la suspension dans un tube de 15 ml et centrifuger 10 min à 150 x g.
   12. Enlever le surnageant et remettre le culot dans 200 ul de CGM.
       Dissocier les neurosphères mécaniquement par passage des cellules 100-150x avec une pipette P200, jusqu'à l'obtention d'une suspension cellulaire unique et prendre jusqu'à 1 ml avec CGM.
   13. Diluer la suspension cellulaire, par exemple 10 pi de suspension cellulaire dans 40 pi de CGM pour obtenir une dilution 1:5, et bien mélanger. Mélanger 10 ul de la DILUTe suspension cellulaire avec 10 pi d'un colorant vital et bien mélanger.
   14. Remplir une chambre de comptage hémocytomètre avec 10 ul d'une suspension de cellules 01 heures 01: solution de colorant vital. Compter séparément le nombre de (bleu) des cellules vivantes (blanc) et morts dans les quatre cases de coins. Pour déterminer le nombre de cellules / ml, appliquer le calcul suivant:
   15. Remettre en suspension de 2 x 10 ⁵ cellules dans 5 ml de CGM et transférer dans un flacon T25 de ² cm;
   16. Répétez sections 1.3.11-1.3.12 chaque 4-5 DIV. A partir du deuxième passage de l'expansion partir, évaluer la viabilité cellulaire par exclusion de colorant vital et commencer à construire une courbe de croissance continue en plaquant PNJ à densité clonale (8000 cellules/cm2), comme décrit ^21. Gardez les numéros de cellulaires et répéter la procédure chaque 4-5 DIV. Pour générer une courbe de croissance continue, procédez comme suit:
       NB: Pour avoir une bonne préparation de la cellule, après 4-5 sphères DIV devraient avoir atteint un diamètre de 150-200 um. Pour avoir une bonne estimation de til cellule densité, il est important de trouver un facteur de dilution optimale afin d'avoir bien réparties, les cellules ne se chevauchent pas tout au long de la hématocytomètre. Idéalement, il devrait y avoir entre 50-200 cellules totales. Lors du comptage, seules les cellules comprises dans la place sans toucher les frontières doivent être considérés. En outre, la viabilité des cellules est un facteur essentiel de disposer d'une préparation en bonne santé. Fait important, elle doit être supérieure de 90%. Une courbe de croissance linéaire est un autre indicateur d'une préparation de cellules saines.
       
       1. Compter le nombre de cellules vivantes et mortes (par exemple 1,3 x 10 ^6).
       2. Définir le taux de croissance de la division du nombre de cellules vivantes par le nombre de cellules étalées (par exemple 1,3 x 10 ^6/2 x 10 ⁵ = 6,5).
       3. Calculer le nombre total de cellules en multipliant le taux pour le nombre total de cellules présentes à l'instant précédent (au début = 2 x 10 ⁵⁾ de la croissance.
       4. Indiquer la moyenne7; écart-type pour construire une ligne de tendance linéaire.
   17. A partir de passage 6, dissociation mécanique est remplacé par dissociation enzymatique. Après centrifugation à 150 xg pendant 10 minutes, éliminer le surnageant, remettre en suspension le culot dans 200 pl de solution de dissociation cellulaire total, remettre en suspension 7-8x avec un P200 et incuber 10 min à 37 ° C, 5% CO _2.
   18. Reprendre 7-8x avec un P200 pour obtenir une suspension cellulaire unique et ajouter 800 ul de CGM. Compter les cellules (à la fois vivants et morts) et assurer leur viabilité. Remettre en suspension à 2 x 10 ⁵ cellules dans 5 ml de CGM et transférer dans une fiole T25 ^cm2.
4. Transduction virale de PNJ pour le suivi in vivo de cellules
   NB: Pour vérifier l'efficacité de la transduction virale, construire une courbe de croissance parallèle avec les PNJ transduction et nontransduced. En outre, l'efficacité clonale, qui est le nombre absolu de cellules de neurosphères de formage présente à l'intérieur une préparation cellulairetion ou d'une analyse du cycle cellulaire par la teneur en ADN (avec l'iodure de propidium, PI), peuvent être utilisées comme d'autres indications de l'état de la cellule. Si le pourcentage de cellules infectées ne doit pas être bon, le protocole de transduction virale peut être répétée une seconde fois avec la même population de cellules. Une fois que le niveau d'infection est satisfaisante et la courbe de croissance est similaire à celui obtenu avec les cellules de type sauvage, NPC transduites peuvent être étendus et / ou transplantées.
   
   1. Récolter les neurosphères et obtenir une suspension de cellules isolées. Plaquer les cellules à haute densité (1,5 x 10 ⁶ cellules dans un flacon T75 cm ²⁾ dans 10 ml CGM.
   2. Après 12 heures ajouter 3 x 10 ⁶ TU / ml d'une troisième génération vecteur lentiviral pRRLsin. PPT-hCMV conçu avec E. coli dérivé β-galactosidase (lacZ) ou avec la protéine fluorescente verte (GFP).
   3. 48 h plus tard, la récolte des cellules, centrifuger à 300 g pendant 10 min et Réensemencement les cellules à un rapport de 1:1.
   4. AprèsTrois passages in vitro de vérifier l'efficacité de l'infection. La cytométrie en flux est couramment utilisé pour tester l'efficacité infection, et le niveau satisfaisant d'infection est communément admis pour être de l'ordre de 75-95% de cellules positives. Vérifier à nouveau l'efficacité de l'infection après 3 passages supplémentaires de l'expansion pour vérifier le maintien de l'expression du marqueur.
5. Neurosphère congélation
   1. Récolter les neurosphères dans un flacon T25 cm ^2, centrifuger à 300 g pendant 10 min, et jeter le surnageant.
   2. Reprendre le culot avec 1 ml de milieu de congélation (CGM avec 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO).
   3. Placez les cryotubes à -80 ° C dans un récipient de congélation.
   4. Après au moins 24 heures de déplacer les cellules à un cryobox et conserver à -80 ° C pendant des mois, ou de porter à l'azote liquide _(N2) pour une conservation plus longue.
6. Neurosphère décongélation
   NB: Pour éviter les effets toxiques de contact prolongé of PNJ avec du DMSO, le processus de décongélation doit être aussi rapide que possible.
   
   1. Retirez le tube cryogénique de -80 ° C / N ₂ et le garder sur la glace sèche.
   2. Décongeler rapidement le flacon dans un bain d'eau, jusqu'à ce que la quasi-totalité de la suspension cellulaire est décongelée et seulement une petite partie de la suspension reste glacé.
   3. Reprendre la suspension de cellules avec 5 ml d'préchauffé frais CGM.
   4. Centrifuger à 300 g pendant 10 min.
   5. Retirer le surnageant, remettre en suspension doucement avec 5 ml de frais CGM et de la plaque de la suspension cellulaire dans un flacon propre et non traitée T25 cm ^2.
7. 1.7) PNJ caractérisation
   NB: Le dernier lavage PBS peut être remplacé par 0,05% d'azide de sodium-PBS pour empêcher la croissance fongique ou contaminations, et coverslides sont stockés à 4 ° C pendant 2-3 semaines.
   
   NB: pour colorer les marqueurs intracellulaires ajouter un agent de perméabilisation de PBS dans la solution de blocage. Si la source de l'anticorps primaire est une chèvre, albumi de sérum bovinn (BSA) ou de sérum de chèvre à l'exception devrait être utilisé.
   
   NB: Pour colorer des marqueurs intracellulaires utilisent un agent de perméabilisation de la solution d'anticorps primaire.
   
   1. Placer un coverslide de verre de 13 mm sur le fond d'une plaque à 24 puits. Ajouter 150 ul de solution de revêtement sur le haut de chaque coverslide pour créer une petite goutte. Incuber pendant au moins 30 min à 37 ° C, 5% CO _2.
   2. Récolter les neurosphères et se dissocier pour obtenir une suspension cellulaire unique.
   3. Compter les cellules vivantes et diluer pour obtenir 80 000 cells/35 ul. Éliminer l'excès de solution de revêtement à partir de la coverslide par aspiration douce, et plaquer les 35 ul de suspension cellulaire.
   4. Incuber 25 min à 37 ° C, 5% CO _2. Vérifier rapidement au microscope de contraste de phase si les cellules ont commencé à adhérer.
   5. Préparer le milieu de différenciation en mélangeant moyen de la souris de base avec les suppléments appropriés (voir le tableau 1) et des antibiotiques (Pen / Strep).
   6. Ajouter 400 ul de milieu de différenciation et incuber à 37 ° C, 5% CO _2.
   7. Après 3 DIV, changer la moitié du milieu par du milieu de différenciation frais.
   8. Après 6 DIV, éliminer le milieu et laver une fois avec du PBS. Sous une hotte chimique retirer le PBS et ajouter 300 ul d'préchauffé paraformaldéhyde 4% (PFA) 4% de saccharose. Incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Retirez la PFA et laver 3 fois avec PBS.
   9. Pour procéder à l'immunocytochimie, retirez le PBS et bloquer avec du PBS 10% de sérum de chèvre normal (NGS) (solution de blocage), et incuber 1 heure à température ambiante.
   10. Retirer la solution de blocage et ajouter l'anticorps primaire dilué souhaité avec PBS 1% NGS. Incuber à 4 ° CO / N ou, en variante, 120 min à température ambiante.
   11. Après l'incubation, laver 2 fois avec PBS. Incuber avec l'anticorps secondaire approprié dilué avec du PBS 1% de NGS. Incuber 60 minutes à température ambiante.
   12. Laver 2 fois avec du PBS et contre-colorer les noyaux avec 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dilué avec du PBS 1:20,000 agent de perméabilisation pendant 3 min à température ambiante dans l'obscurité. Laver deux fois avec du PBS et une fois avec de l'eau distillée.
   13. Mettre une goutte de milieu de montage sur une lame de tissu de verre et avec une pince à monter le coverslide avec les cellules en regard du support de montage. Appuyez doucement sur le coverslide de faire sortir l'excès de milieu de montage. Laissez le coverslide dans l'obscurité à la température ambiante jusqu'à ce que le milieu de montage est séché et stocker à 4 ° C.

2. Myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) induite expérimentale auto-immunité dans C57BL / 6

1. Préparation de l'émulsion
   1. Sur un bêcher en verre de préparer une émulsion composée de l'adjuvant incomplet de Freund contenant 4 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis [autrement défini comme adjuvant complet de Freund (CFA)] et 200 ug de MOG (peptide 35-55), en considérant que le montant total de l'émulsion par souris sera de 300 pi.
      NB: affectation de créditscontrôles te de souris MOG-immunisés en CFA sont des souris immunisées avec CFA seulement. La variance attendue de l'apparition de la maladie chez les souris immunisées MOG est de 11,3 (± 1,8) dpi.
      
      NB: Pour le calcul du volume total de l'émulsion nécessaire, envisager deux fois plus de volume que le nombre de souris pour vacciner. La verrerie doit être préférée à plasticware à minimiser le gaspillage d'une partie de l'émulsion.
      
      1. Avec une seringue en verre tenant un mélange 19 d'aiguille G pendant environ 30 minutes, en gardant toujours l'émulsion sur la glace.
      2. Pour vérifier si l'émulsion est prêt, déposez une petite quantité d'émulsion de l'eau. L'émulsion est prêt à être injecté uniquement si la goutte reste telle quelle et ne se disperse pas.
      3. Immuniser le groupe de souris de contrôle avec du CFA seul. Offrez-souris expérimentales (MOG immunisé) avec MOG en CFA. La variance attendue d'apparition de la maladie dans MOG souris immunisées est de 11,3 (± 1,8) dpi.
   2. Transférer l'aiguille 19 G pour un 1 ml seringue en plastique une aspirer l'émulsion. Éviter les bulles, changer l'aiguille avec un 25 G et laisser la seringue sur la glace. Seringues remplies de l'émulsion sont prêts à être utilisés et doivent être conservés sur de la glace pendant quelques heures.
2. Immunisation
   1. Placez la souris (de 6-8 semaines, de sexe féminin) dans une zone de réchauffement et attendre environ 10 minutes pour permettre à la veine de la queue à se dilater.
   2. Transférer un clic à partir de la boîte de réchauffement à un dispositif de retenue de la souris. Fermer le dispositif de retenue afin d'éviter tout mouvement de la souris.
   3. Remplir une seringue de 1 ml d'insuline avec 100 pi de toxine de la coqueluche (5 ug / ml) en évitant de faire des bulles. Injecter lentement la solution dans la veine de la queue. Retirez l'aiguille et appuyez pendant quelques secondes avec un morceau de papier de brancher le saignement.
   4. Placez la souris dans le dos de la cage et répétez la même procédure pour toutes les souris.
   5. Anesthésier une souris avec inhalation continue de l'isoflurane (1-2%, 2 L / min) et d'injecter 100 ml de l'émulsion sous-cutanée au niveaules deux flancs et la base de la queue (300 ul émulsion / souris). Retirer lentement la seringue, en évitant la fuite de l'émulsion.
   6. Marquez la souris avec un perforateur de l'oreille, placez la souris dans la cage et vérifier jusqu'à guérison complète. Répétez l'opération pour toutes les souris.
   7. Après 48 heures (2 jours après la vaccination, dpi) section de répétition 2.2.3.
3. L'analyse du comportement des souris atteintes d'EAE
   1. À partir de 5 dpi, peser les souris quotidienne et le suivi de leurs performances locomotrices, en utilisant le système de notation à l'échelle décrite dans le tableau 1.

3. Injection de cellules neurales souches / progénitrices dans la veine caudale (iv)

1. La préparation des cellules
   1. neurosphères de récolte par centrifugation à 300 g pendant 10 min.
   2. Eliminer le surnageant et ajouter 200 ul de solution de dissociation cellulaire total. Incuber 10 min à 37 ° C, 5% CO _2.
   3. Remettre en suspension doucement 10-12x (avoiding) des bulles avec un P200 jusqu'à l'obtention d'une suspension de cellules isolées et les amène à 800 ul avec un milieu de base sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +.}
   4. Compter les cellules à l'aide d'un colorant vital pour doser la viabilité cellulaire et de diluer la suspension avec un milieu de base sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +} pour obtenir une densité finale de 10 ⁶ cells/150 ul. Conserver la suspension de cellules sur de la glace jusqu'à utilisation.
2. Injection iv NPC
   NB: La dissociation idéal en suspension cellulaire unique et l'absence de bulles d'air sont deux aspects essentiels à considérer pour réduire le risque soit de touffes / agrégats vs formation d'emboles qui pourrait aboutir à une occlusion de la veine et la mort conséquente.
   
   1. Au sommet de la maladie (16-18 dpi), peser et marquer les souris. Distribuez les souris en fonction de leur score dans le but d'avoir des groupes homogènes.
   2. Placez la souris dans une boîte de réchauffement et attendre environ 10 minutes pour permettre à la veine de la queue à se dilater.
   3. Transférer un clic à partir de la boîte de réchauffement à un dispositif de retenue de la souris. Fermer le dispositif de retenue afin d'éviter tout mouvement de la souris.
   4. Remplissez un 1 ml seringue à insuline avec 150 pi de suspension cellulaire et assurez-vous d'enlever toutes les bulles. Injecter lentement la solution dans la veine de la queue. Retirez l'aiguille et appuyez pendant quelques secondes avec un morceau de papier de brancher le saignement (figures 6A et 6B).
   5. Placez la souris dans la cage et vérifier jusqu'à la guérison. Répétez la même procédure pour toutes les souris.

4. L'injection de cellules neurales souches / progénitrices dans la grande citerne (ICV)

1. La préparation des cellules
   1. PNJ de récolte par centrifugation à 300 g pendant 10 min.
   2. Eliminer le surnageant et ajouter 200 ul de solution de dissociation cellulaire total. Incuber 10 min à 37 ° C, 5% CO _2.
   3. Remettre en suspension doucement 10-12x avec un P200 jusqu'à l'obtention d'un seul cell suspension et prendre à 800 pi avec le milieu de base sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +.}
   4. Compter les cellules et on dilue la suspension avec un milieu de base sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +} pour obtenir la densité cellulaire désirée. Conserver la suspension de cellules sur de la glace jusqu'à utilisation.
2. 4.2) injection PNJ icv
   1. Au sommet de la maladie (16-18 dpi), peser et marquer les souris. Distribuez les souris en fonction de leur score dans le but d'avoir des groupes homogènes.
   2. Placer la souris sur un appareil stéréotaxique sous inhalation continue de l'isoflurane (1-2%, de 2 L / min). Fixer la tête de la souris avec les barres d'oreilles. Puis ajustez la bouche et des morceaux de nez. Assurez-vous que la tête de la souris est plate et fixée.
   3. Nettoyer la tête de la souris avec l'iode povidone (PVP-I) et faire une incision à couper la peau dans la partie postérieure de la tête pour exposer le crâne.
   4. L'utilisation d'un micromanipulateur, insérer la pointe d'un microlitreseringue iter dans la fente entre l'occiput et la vertèbre atlas à travers les muscles et les ligaments intacts sur la ligne médiane à l'arrière du cou. La partie coudée de l'aiguille est maintenue en contact étroit avec la surface interne de l'occiput pour la totalité de la longueur, telle que décrite ^22.
   5. Insérer l'aiguille lentement et attendre quelques secondes. L'opérateur est destiné à apprendre à reconnaître la sensation de l'aiguille étant «accro» au crâne de la souris, avant de commencer à injecter la préparation cellulaire. Injecter lentement le volume des cellules (à moins de 3 à 5 min). Laissez l'aiguille en place pendant quelques secondes supplémentaires après l'injection et retirer lentement la seringue.
   6. Recoudre la peau et placer la souris dans une cage de récupération jusqu'à guérison complète.

5. Traitement des tissus

1. Profondément anesthésier les souris avec un mélange de 0,5 ml de kétamine (100 mg / ml), 0,25 ml de xylazine (23,32 mg / ml) et 4,25 ml d'eau stérile et transcardically perfuser, wincinération avec une solution saline-EDTA et fixer avec 4% de PFA. Retirez les deux colonnes vertébrales et de cerveaux et postfix dans 4% PFA pendant 12 heures à 4 ° C. Laver le tissu dans du PBS, enlever la moelle épinière de l'os et lui laisser le tissu d'au moins 48 h dans 30% de saccharose (dans du PBS) à 4 ° C. Incluez les tissus de la température de coupe optimale (OCT) de composé et enclenchez le gel avec de l'azote liquide, comme décrit ^2.
2. Utilisez un microtome pour couper les tissus en 10-12 um tranches épaisses.
3. Sinon, incorporer tissu frais dans de l'agarose et couper le tissu en utilisant un vibratome 50-80 um tranches épaisses.
4. Dans les deux cas, l'incubation O / N à 37 ° C dans du D-galactopyranoside (X-gal) solution pour détecter l'activité β-galactosidase nucléaire-chloro-3-indolyl-β 5-bromo-4.
5. Recouper sections contenant β-gal + cellules en 5 um tranches et le double tache en utilisant fibrillaire antiglial protéine acide (GFAP) pour les astrocytes (50 pg / ml), l'antigène nucléaire antineuronaux (NeuN) pour les neurones (1 &# 956; g / ml) et antiNestin de cellules neurales indifférenciées (10 pg / ml).
6. Procédez comme décrit dans les sections 1.7.11 et 1.7.12. Pour de multiples colorations assurez-vous d'utiliser des anticorps secondaires conjugués avec différents fluorophores.
7. Pour les tissus contenant des cellules GFP étiqueté procédez comme expliqué aux étapes 5.1 à 5.3 et procéder aux multiples colorations.
8. Ajouter quelques gouttes de milieu de montage sur les lames et couvrir avec une lamelle de tissu.
9. Pour les sections colorées avec des anticorps conjugués à la biotine préparer une solution d'avidine complexe biotine (solution ABC, voir le tableau 2) et laissent dans l'agitation pendant 45 min.
10. Incuber les tranches 5 min avec 1% de H ₂ O ₂ pour bloquer l'activité de peroxydase endogène.
11. Laver deux fois avec du PBS.
12. Incuber avec une solution ABC pendant 1 heure à température ambiante.
13. Laver deux fois avec du PBS.
14. Incuber avec une solution de 3,3 '-diaminobenzidine et de 0,3% de H ₂ O _2. Surveillance de l'ONU de réactionder un microscope et laver avec du PBS dès que la tranche commencer à obtenir brun (généralement autour de 5-10 min).
15. Laver deux fois avec du PBS et procéder comme décrit dans l'étape 5.7.

Liste complète des matériaux et des réactifs est présentée dans le tableau 2.

Résultats

NPC dérivation et la caractérisation
Dissections SVZ sont effectuées sur les piscines (n = 5-7 souris / pool) de vieux 6-8 semaines souris C57BL / 6 par le biais de dissociation mécanique et enzymatique (figure 1A). Après quelques jours de culture dans CGM, neurosphères flottants commencent à se former (Figures 1A et 1B). Sphères primaires sont recueillies et mécaniquement des passages tous les 4-5 DIV. Après repiquage, les nombres de cellules vivantes ...

Discussion

Thérapies à base de cellules souches somatiques sont en train de devenir l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement des troubles du système nerveux central inflammatoires chroniques telles que le MS2 ^11. Bien que les mécanismes soutenant leurs effets thérapeutiques doivent encore être complètement élucidé, l'impact significatif des PNJ transplantation dans différents modèles expérimentaux de maladies neurodégénératives a donné lieu à la croyance un peu provocateur ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture
EBSS	Sigma	E2888
L-Cystein	Sigma Aldrich	C7352
Papain	Worthington	30H11965
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/50
Mouse NeuroCult basal medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult proliferation supplements	Stem Cell Technologies	05701
Heparin	Sigma	H3393
Basic fibroblast growth factor	Peprotech	100-18B-1000
Epidermal growth factor	Peprotech	AF-100-15-1000
Pen/Strep	Invitrogen	1514012
Matrigel (coating solution)	BD Biosciences	354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse)	Stem Cell Technologies	05704
Accumax	eBioscience	00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and Mg	PAA Laboratories	H15-011
Myco trace	PAA Laboratories	Q052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Immunofluorescence
Normal goat serum	PAA Laboratories	B11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether	Sigma Aldrich	T8787
Mouse anti Nestin	Abcam	ab11306
Rabbit anti GFAP	DAKO	203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10)	Abcam	ab14955
Rabbit anti MAP-2	Abcam	ab32454
Rat anti MBP	AbD SEROTEC	MCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345	Millipore	MAB345
DAPI	Invitrogen	D1306
Mounting solution	DAKO	S3023
EAE
Freund's Adjuvant Incomplete	Sigma Aldrich	F5506
Mycobacterium tuberculosis	DIFCO	H37Ra
MOG(35–55)	Espikem
Pertussis toxin	List Biological Laboratories	181
Tissue processing
Iris scissor straight	Fine Sciences Tools	14060-09
Blunt/bended forceps	Fine Sciences Tools	11080-02
Brain slicer	Zivic Instruments	BSMAS005-1
Surgical blades	Swann-Morton	324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar)	Boehringer Ingelheim	01LC0030
Xylazine (Rompun)	Bayer	32371
Stereotaxic frame	KOPF	Model 900
Hamilton syringe	Hamilton	7762-04
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	158127
VECTASTAIN Elite ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100