JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Трансплантация нервных стволовых клеток / клеток-предшественников (NPC) держит большие обещания в регенеративной неврологии. Системная доставка НПС превратился в эффективный, низкий инвазивными, и терапевтически очень действенным протокола для доставки стволовых клеток в головном и спинном мозге грызунов и приматов, пострадавших от экспериментального хронического воспалительного повреждения центральной нервной системы.

Аннотация

Нервные клетки стволовых / предшественники (NPC) являются перспективным источником стволовых клеток для трансплантации подходов, направленных на ремонт головного мозга или восстановления в регенеративной неврологии. Эта директива возникла из обширного доказательства того, что ремонт мозг достигается после очаговой или системного трансплантации NPC в нескольких доклинических моделях неврологических заболеваний.

Эти экспериментальные данные выявили маршрут доставки клеток в качестве одного из основных препятствий восстановительного лечения стволовых клеток при заболеваниях головного мозга, что требует срочного оценку. Интрапаренхимальные прививки стволовых клеток представляет собой логический подход к решению этих патологий, характеризующихся изолированных и доступных поражений головного мозга, таких как травмы спинного мозга и болезни Паркинсона. К сожалению, этот принцип плохо применима для состояний, характеризующихся мультифокальным, воспалительного и распространяемой (как во времени и пространстве) природы, в том числе рассеянного склероза (РС). Как ориентации, такие, мозг по систэмический доставка NPC стала низкой инвазивные и терапевтически эффективный протокол для доставки клеток в головном и спинном мозге грызунов и приматов, пострадавших от экспериментального хронического воспалительного повреждения центральной нервной системы (ЦНС).

Этот альтернативный способ доставки клеток зависит от избирательное действие лекарственных средств на пораженные `органы NPC, в частности их врожденную способность к (I) ощутить среды через функциональных молекул клеточной адгезии и воспалительных цитокинов и рецепторов хемокинов; (II) пересечь протекающие анатомические барьеры после внутривенного (IV). Или интрацеребровентрикулярное (ICV) инъекции; (III) накапливать на уровне множественной периваскулярной сайт (ы) воспалительного головного и спинного мозга повреждение; и (IV) оказывают замечательную ткани трофические и иммунные регуляторные эффекты на различных хост клеток-мишеней в естественных условиях.

Здесь мы опишем методы, которые мы разработали для IV. и <EM> ICV поставка сингенным НПС у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелит (ЕАЕ), а модели хронического ЦНС воспалительной демиелинизации и предусматривают системную доставку стволовых клеток в качестве ценного методики для избирательного выбора в воспаленном мозгу в регенеративной неврологии.

Введение

Убедительные доказательства возникла из в естественных условиях исследования, свидетельствующих о терапевтической эффективности трансплантации соматических нервных стволовых клеток / предшественников (NPC) в животных моделях ЦНС расстройств 1-8. Тем не менее, ряд вопросов, связанных с доставкой стволовых клеток в организм хозяина требуют тщательного рассмотрения, прежде чем эти экспериментальные результаты могут быть переведены в клинической практике. Особенно существенным препятствием на пути развития (nonhematopoietic) восстановительного лечения стволовыми клетками для мультифокальными, хронических воспалительных заболеваний головного мозга является выявление идеального маршрута впрыска NPC. Фирма понимание патофизиологии целевой болезни (фокусное или мультифокальной; первичный воспалительный или первичный дегенеративный), и осторожной анализа технико-экономических и риска проблем, связанных с методами доставки в определении оптимального протокола для доставки стволовых клеток.

В то время как фокусное ( Например. в паренхиму нервной системы) трансплантация стволовых клеток является логическим подходом к лечению заболеваний ЦНС, характеризующихся пространственно ограниченных пространствах повреждения (например, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона, головного и спинного мозга травматические повреждения, и инсульт), тот же самый подход может оказаться быть практически не представляется возможным в условиях, таких как MS, где мультифокальный, хронический, и пространственно распространены поражение ЦНС накапливается с течением времени. В этом последнем случае, ориентации координационные инъекции клеток в отдельных поражений также препятствует ограниченных возможностей пересаженных НПС мигрировать на большие расстояния в пределах паренхимы ЦНС, тем самым побуждая идентификацию альтернативных, более подходящих способов ЦНС ориентации с менее инвазивных трансплантации NPC .

Большие перспективы появились из наблюдений, что НПС нацелены внутричерепной опухоли (например,. Глиомы) у мышей при введении внутривенно вне CNS9. После этого семеннойв естественных условиях доказательства стволовых клеток pathotrophism 10, обширные данные были накоплены, относящиеся к целесообразности и терапевтической эффективностью системного трансплантации НПС на лабораторных животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелит (ЕАЕ), в качестве модели воспалительного повреждения ЦНС, либо через внутривенное (IV) или интрацеребровентрикулярное (ICV). NPC впрыска 1,2,5,6,8 .. Мы сначала показали, что это зависит от возможностей пересаженных НПС, чтобы цели и введите воспаленную ЦНС, и впоследствии участвовать несколько межклеточный Коммуникационные программы в конкретных микросреды в естественных условиях 11. Для того, чтобы особый акцент сделан на ЦНС, NPC доставляются непосредственно в спинномозговую жидкость (ликвор) циркуляции путем инъекции ICV, или в кровоток через внутривенной инъекции. После ввода либо в кровоток или CSF, пересаженные НПС активно взаимодействуют смозг крови (BBB) ​​или крови цереброспинальной жидкости (BCSFB) барьеры и введите паренхимы ЦНС. Это взаимодействие между трансплантата NPC и BBB (или BCSFB) регулируется определенным набором молекул клеточной адгезии поверхности NPC (кулачков) и при содействии выражения высокого уровня CAM контр-лигандов на активированных эндотелиальных / Эпендимоциты 12-14. Примерами таких САМ включают рецептор для гиалуроната, CD44, и межклеточной адгезии (ICAM) -1 лиганд очень поздно антигена (VLA) -4 5,15,16 (что, в лейкоцитах, несут ответственность взаимодействия с активированным эпендимных и эндотелиальные клетки), и в гораздо меньшей степени лимфоцитов функции ассоциированный антиген (МАФ) -1 и P-селектина гликопротеина лиганда (PSGL) -1. НПС также выразить широкий спектр рецепторов хемокинов, в том числе CCR1, CCR2, CCR5, CXCR3 и CXCR4 (но не выражают CCR3 и CCR7), которые функционально активны, как в пробирке и в естественных 5,16. Таким образом, systemicaLLY вводили НПС использовать эти камеры, вместе с G-белком рецептор (GPCR), чтобы накопить на уровне воспаленной ЦНС. И наоборот, НПС вводят системно в здоровых мышей не входят в ЦНС через сосудистой или спинномозговой жидкости космических маршрутов 2. ЦНС воспаление, или эндотелиальный / активация эпендимных клеток после системного цитокин или lypopolisaccharide (LPS) впрыска в качестве модели химически индуцированных энцефалита, поэтому необходимо для накопления системно вводили НПС в головном и спинном мозге 2. Таким образом, успешная нападения на ЦНС с системной терапии NPC зависит от идентификации конкретного окна заболевания возможностей (Ву), в котором головного и спинного среда шнур способствует накоплению и трансэндотелиальной миграции NPC. Такие условия обычно возникают в контексте острым и подострым воспалением 17. Как только войдя в ЦНС, пересаживают недифференцированные НПСБыло показано, что для улучшения Клинико-патологическая особенности мышей, а также более крупных, приматов с EAE. Это было описано, быть зависимым от минимальной замены клеток 2 и замечательной секреции иммунных регуляторных и нейропротективных факторов паракринных пределах периваскулярной ЦНС 2,5,6,18 против не-ЦНС воспаленные участки 19,20 (например, лимфатические узлы) в ответ на сигнализации воспалительных клеток, вызванное проникновения иммунных клеток 5.

Здесь мы опишем основные методологические аспекты системного введения соматических НПС в мышиной модели хронического ЕАЕ. В частности, мы определяем протоколы, которые мы поставили, чтобы (I) вытекают, расширить и подготовиться к трансплантации соматических НПС из субвентрикулярной зоне (SVZ) взрослых мышей C57BL / 6; (II) индуцируют хронический EAE в таких мышей и (III) выполнять терапевтически эффективное системное (IV или ICV) NPC трансплантацию ямышей НТО EAE.

протокол

Все процедуры с участием животных проводятся в соответствии с принципами лабораторной ухода за животными, утвержденных внутренних дел Великобритании под животных (научные процедур) действовать 1986 (Закон о госзакупках номер 80/2457 к СП).

1. Вывод соматических нервных стволовых / клеток-предшественников (NPC) из субвентрикулярной зоне (SVZ) головного мозга взрослых мышей

  1. Подготовка рассечение инструментов и средств массовой информации
    Примечание: Эти два решения должны быть подготовлены 1-2 ч до вскрытия инструменты готовы и предварительно нагретой при 37 º C, по крайней мере 20-30 минут перед использованием (это помогает разбавить папаин и оптимизирует активность фермента).
    1. Автоклав одну прямую резкое ножницы, одну маленькую хирургическую ножницами и два маленьких изогнутых зубчатые щипцы.
    2. "Пищеварение" решение: Подготовка два отдельных 50 мл пробирки с:
      Решение # 1: 25 мл сбалансированный солевой раствор (EBSS) + 10 мг этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) + 10 мг L-цистеин Эрла;и
      Решение № 2: 25 мл EBSS + 50 мг папаин.
    3. Подготовьте "Завершить ростовой среды» (CGM): полное мыши базальной среды мыши распространения добавок, гепарин 0,002%, основной фактор роста фибробластов (BFGF, 10 нг / мл), эпидермальный фактор роста (EGF, 20 нг / мл) и антибиотики (ручка / Стрептококковое).
  2. Мозг рассечение
    NB: удаление височных костей может легко повредить ткани из-за их резкости. Чтобы избежать этого, надежно прикрепить кости с пинцетом и вытащить, пока весь кость была удалена.
    1. Для каждого подготовки НПС, отбраковки смещением шейных позвонков п = 5-7, 4-8 недельных мышей C57BL / 6.
    2. Очисти с 70% этанола (в воде) волос из отбракованных мышей и сократить за ушами с прямой резкой ножницами снять головку;
    3. Сделайте срединный разрез с помощью небольшой хирургической ножницами разрезать кожу над черепом. Используя щипцы, сложить два пятна на коже, чтобы выставкахе череп.
    4. С небольшой хирургической ножницами выполняют две маленькие порезы на основании черепа и удалить кости под Понс / мозга (вентральной черепа). Продолжать, потянув временные кости. С той же ножницами выполнить разрез вдоль всей черепа, начиная от основания, чтобы луковицы, не повреждая поверхность мозга. Кроме того, выполнить разрез между лобных костей и глаз, чтобы облегчить удаление из теменных костей. С двумя щипцы начать удаление череп, потянув каждый из теменных костей наружу. Хотя потянув, обратите внимание на мозговые оболочки, которые могут повредить мозг, когда кости удаляются.
    5. После того, как череп был удален, скользить щипцы между мозгом и черепом, чтобы полностью отделить мозговых оболочек оставили. Осторожно поднимите мозг от черепа. Обрежьте зрительные нервы, чтобы освободить мозг и, наконец, собирают мозг в трубку с холодным фосфатным буферным раствором (PBS).
    6. Держите трубку на льду апг повторите эту же процедуру для всех мышей.
  3. Анализы Рассечение СВЗ, нейросфера формирования и обслуживания
    Среднее число клеток х разбавление фактором х 10 4

    Где 10 4 представляет собой превращение общего объема гематоцитометр камеры (общий объем = 0,1 мм 3 -> 10-4 см 3 -> 10-4 мл). При рассмотрении коэффициент разбавления, как один сделано с CGM и с витальной окраски, должны быть приняты во внимание. Например, если 160 клетки были подсчитаны в угловых квадратах 4, конечная плотность (клеток / мл) клеточной суспензии будет:

    160/4 х 5 (разведение с CGM) х 2 (разведение с витальной окраски) х 10 4
    1. Включите рассечение капюшона, оснащенного вскрытии микроскопом.
    2. Очистите все поверхности с 70% этанола (в воде), и спрей с анти решения Mycoplasma, чтобы снизить риск заражения.
    3. Крышкадно стакан с стерильную марлю (для сохранения заточены инструменты) и залейте его 70%-ного этанола (в воде). Замочите в стакане две пары щипцов, одну пару микро ножницы и хирургического лезвия.
    4. Поместите весь мозг на мозг-среза матрицы.
    5. Использование двух лезвий выполнить корональной секционирования 2 мм от переднего полюса мозга, за исключением оптических путей, и 3 мм кзади от предыдущего разреза; и поместите ткань на чистую чашку Петри.
    6. Под микроскопом рассекает изолировать СВЗ ткани и нарезать 1 мм 3 части, используя иридэктомия ножницы. Повторите эти действия для всех мозгов.
      1. Хорошо перемешать два решения (раздел 1.1.2) выше и фильтруют через 0,22 мкм фильтр сразу же после того, как мозг иссекали и SVZs готовы быть переварены.
    7. Передача разделы в 30 мл раствора "пищеварения", осторожно ресуспендируют с a10 мл пипетки и инкубировать 30 мин при 37 ° C в 5% CO 2. Каждые 15 мин осторожно встряхните трубки 2-3х.
    8. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин.
    9. Удалить супернатант и не ресуспендируют осадок в 200 мкл с помощью пипетки ПГС первого с P1000, а затем с P200 пипетки (10-20-кратным каждый), до получения суспензии отдельных клеток.
    10. Возьмите подвеску до 5 мл с CGM и перенести в T25 см 2 колбы.
    11. Через 5-7 дней в пробирке (DIV) нейросферы сформируют. Сбор суспензии в 15 мл трубки и центрифуги 10 мин при 150 х г.
    12. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 200 мкл CGM.
      не отделить нейросферы механически пассажей клеток 100-150X с P200 пипетки, до получения суспензии отдельных клеток и принять его до 1 мл с CGM.
    13. Развести клеточной суспензии, например 10 мкл клеточной суспензии в 40 мкл CGM, чтобы получить разведение 1:05, и хорошо перемешать. Смешайте 10 мкл разбавлятьэ клеточной суспензии с 10 мкл витальной окраски и хорошо перемешать.
    14. Заполните подсчета гемоцитометр камеру с 10 мкл 1:1 клеточной суспензии: жизненно решений пятно. Отдельно подсчитать количество живых (белые) и мертвых (синий) клеток в угловых квадратов 4. Для определения количества клеток / мл, нанесите следующий расчет:
    15. Ресуспендируйте 2 х 10 5 клеток в 5 мл CGM и перевода к T25 см 2 колбы;
    16. Повторите разделы 1.3.11-1.3.12 каждые 4-5 DIV. Со второй прохождения расширения года, оценить жизнеспособность клеток жизненной пятно исключения и начать строить непрерывную кривую роста при посеве НПС на клоновых плотности (8000 клеток/см2), как описано 21. Держите числа клеток и повторите процедуру каждые 4-5 DIV. Чтобы создать непрерывную кривую роста, выполните следующие действия:
      Примечание: Для того, чтобы иметь хорошую подготовку клеток, после 4-5 DIV сферы должны достигли диаметр 150-200 мкм. Чтобы иметь хорошую оценку тон клеток плотность, важно найти оптимальный коэффициент разбавления, чтобы иметь хорошо распределены, непересекающиеся клеток по всему гематоцитометр. В идеале, должна быть в пределах 50-200 общего числа клеток. При подсчете, только клетки, состоящие на площади, не касаясь границ должны быть рассмотрены. Кроме того, жизнеспособность клеток является решающим фактором, чтобы иметь здоровую подготовку. Важно отметить, что она должна быть больше 90%. Линейная кривая роста является еще одним показателем здорового клеточного препарата.
      1. Подсчитайте количество живых и мертвых клеток (например, 1,3 х 10 6).
      2. Определить скорость роста деления количества живых клеток по количеству высеянных клеток (например, 1,3 х 10 6/2 х 10 5 = 6,5).
      3. Рассчитать общее количество клеток путем умножения скорости роста для общего числа клеток, присутствующих в предыдущей момент времени (в начале = 2 х 10 5).
      4. Пожаловаться на среднее7; стандартное отклонение построить линейного тренда.
    17. С течением 6, механической диссоциации заменяется ферментативной диссоциации. После центрифугирования при 150 мкг в течение 10 мин, удалить супернатант, ресуспендируют осадок в 200 мкл клеток совокупного решения диссоциации, ресуспендируйте 7-8x с P200 и инкубировать 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    18. Ресуспендируют 7-8x с P200, чтобы получить суспензии отдельных клеток и добавить 800 мкл ПГС. Граф клеток (как живых и мертвых) и установить их жизнеспособность. Ресуспендируйте 2 х 10 5 клеток в 5 мл CGM и перевода к T25 см 2 колбы.
  4. Вирусный трансдукция НПС для отслеживания клеток в естественных условиях
    Примечание: Чтобы проверить эффективность вирусной трансдукции, построить параллельную кривой роста с трансдуцированные и nontransduced NPC. Кроме того, клональной эффективность, то есть абсолютное количество клеток, образующих нейросфер присутствуют в клеточной подготовТион или анализ клеточного цикла по содержанию ДНК (с пропидийиодидом, PI), могут быть использованы в качестве дополнительных признаков состояния клеток. Если процент инфицированных клеток не должно быть хорошо, протокол вирусной трансдукции можно повторить во второй раз с тем же популяции клеток. Как только уровень инфекции является удовлетворительным и кривая роста аналогична полученной с клетками дикого типа, трансдуцированных НПС может быть расширена и / или пересажены.
    1. Урожай нейросферы и получить суспензии отдельных клеток. Пластина клеток при высокой плотности (1,5 х 10 6 клеток в T75 см 2 колбы) в 10 мл CGM.
    2. После 12 ч добавить 3 х 10 6 ТУ / мл третьего поколения лентивирусный вектора pRRLsin. ППТ-HCMV инженерии с Е. палочка, полученных β-галактозидазы (LacZ), либо с зеленым флуоресцентным белком (GFP).
    3. 48 час спустя, сбора клеток центрифуги при 300 мкг в течение 10 мин и replate клетки в соотношении 1:1.
    4. После3 места в пробирке проверки эффективности инфекции. Проточная цитометрия обычно используется для проверки эффективности инфекции, а также удовлетворительный уровень инфекции является общепринятым быть в диапазоне 75-95% положительных клеток. Проверьте еще раз, эффективность инфекции после еще 3 проходов расширения для проверки поддержание экспрессии маркеров.
  5. Нейросфера замерзания
    1. Урожай нейросферы от T25 см 2 колбу, центрифуге при 300 х г в течение 10 мин, и отбросить супернатант.
    2. Ресуспендируют гранул с 1 мл среды замораживания (ПГС с 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
    3. Поместите криопробирки при -80 ° С в течение замораживания контейнера.
    4. После по меньшей мере 24 ч перемещения клеток в cryobox и хранить при -80 ° С в течение нескольких месяцев, или довести до жидкого азота (N 2) для более длительного хранения.
  6. Нейросфера оттаивания
    Примечание: Чтобы избежать токсические эффекты длительном контакте Oе НПС с ДМСО, процесс оттаивания должен быть как можно быстрее.
    1. Снимите криопробирку от -80 ° C / N 2 и держать его на сухом льду.
    2. Быстро разморозить флакон на водяной бане, пока почти все суспензию клеток не размораживают и только небольшой кусок ледяной суспензии остается.
    3. Ресуспендируют клеточной суспензии с 5 мл свежей предварительно нагретой ПГС.
    4. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 мин.
    5. Удалить супернатант, ресуспендируют осторожно 5 мл свежего CGM и пластины клеточной суспензии в чистой, необработанной T25 см 2 колбы.
  7. 1.7) NPC характеристика
    NB: последней промывки PBS может быть заменен на 0,05% азида натрия-PBS, чтобы предотвратить рост грибков или загрязнений, и coverslides которые хранили при 4 ° С в течение 2-3 недель.

    Примечание: Для того, чтобы окрасить для внутриклеточных маркеров добавить permeabilizing агента ФБР в блокирующем растворе. Если источником первичного антитела является коза, бычий сывороточный Albumiн (БСА) или сыворотке кроме козы должны быть использованы.

    Примечание: Для того, чтобы окрасить для внутриклеточных маркеров использовать permeabilizing агента в растворе первичного антитела.
    1. Поместите 13 мм стекла coverslide в нижней части 24-луночный планшет. Добавить 150 мкл покрытия раствора на верхней части каждой coverslide создать небольшую каплю. Инкубировать в течение по крайней мере 30 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    2. Урожай нейросферы и отделить, чтобы получить суспензии отдельных клеток.
    3. Всего живые клетки и разбавляют до получения 80000 cells/35 мкл. Удалить избыток раствора для покрытия от coverslide осторожным стремления, и пластины с 35 мкл клеточной суспензии.
    4. Инкубировать 25 мин при 37 ° С, 5% СО 2. Быстро проверить на контраст фазовом микроскопе если клетки начали придерживаться.
    5. Подготовьте дифференциации среду путем смешивания базальной среды мыши с соответствующими добавками (см. таблицу 1) и антибиотиков (Пен / Стрептококковое).
    6. Добавить 400 мкл дифференциации среды и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2.
    7. После 3 DIV, изменение половина среды со свежим дифференциации среды.
    8. После 6 DIV, удалить среды и мыть один раз PBS. Под химической капот удалить PBS и добавить 300 мкл нагретого 4% параформальдегида (PFA) 4% сахарозы. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Снимите PFA и промыть 3 раза с PBS.
    9. Чтобы продолжить иммуноцитохимии, удалить PBS и блокируют с PBS 10% нормальной козьей сывороткой (NGS) (блокирующий раствор), и инкубируют 1 час при комнатной температуре.
    10. Удалить блокирующий раствор и добавить нужную первичного антитела, разбавленного PBS 1% NGS. Инкубируют при 4 ° CO / N или, альтернативно, 120 мин при комнатной температуре.
    11. После инкубации промыть 2x с PBS. Инкубировать с соответствующим вторичным антителом, разбавленного PBS 1% NGS. Инкубировать 60 мин при комнатной температуре.
    12. Вымойте 2x с PBS и против окрашивают ядра с 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) разбавляют 1:20000 с PBS permeabilizing агента в течение 3 мин при комнатной температуре в темноте. Промыть два раза с PBS и один раз дистиллированной водой.
    13. Поместите каплю монтажной среды на стекло ткани горкой и щипцами смонтировать coverslide с клетками, стоящих монтажную среду. Аккуратно нажмите на coverslide выжать избыток монтажной среды. Оставьте coverslide в темноте при комнатной температуре, пока монтажа среда не сушат и хранят при 4 ° С.

2. Миелина олигодендроцитов гликопротеин (MOG)-индуцированной Experimental Аутоиммунность в мышей C57BL / 6

  1. Приготовление эмульсии
    1. На стеклянном стакане готовить эмульсию, состоящую из неполном адъюванте Фрейнда, содержащего 4 мг / мл микобактерий туберкулеза [противном случае определяется как полном адъюванте Фрейнда (CFA)] и 200 мкг MOG 35-55 (пептид), учитывая, что общее количество эмульсии за мышь будет 300 мкл.
      NB: ассигнованиямиTE элементы управления MOG-иммунизированных мышей в CFA являются мыши, иммунизированные только CFA. Ожидаемая дисперсия начала заболевания в МНГ-иммунизированных мышей составляет 11,3 (± 1,8) точек на дюйм.

      Примечание: При расчете общего объема эмульсии необходимо, считают в два раза больше объема, как количество мышей иммунизировать. Стеклянная посуда должна быть предпочтительно Пластик, чтобы минимизировать отходы часть эмульсии.
      1. С стеклянный шприц держит 19 G иглы смесь в течение 30 мин, всегда сохраняя эмульсии на льду.
      2. Чтобы проверить, является ли эмульсия готова, падение небольшое количество эмульсии на воде. Эмульсию готов быть введен только тогда, когда перепад остается как есть, и не расходиться.
      3. Иммунизируйте контрольную группу мышей с только CFA. Лечить подопытных мышей (МНГ прививка) с MOG в CFA. Ожидаемая дисперсия начала заболевания в МНГ иммунизированных мышей составляет 11,3 (± 1,8) точек на дюйм.
    2. Передача 19 G иглу на 1 мл пластиковую шприцй аспирации эмульсии. Избегайте пузырей, изменить иглу с 25 г и оставить шприц на льду. Шприцы, наполненные эмульсии готовы использовать ее следует хранить на льду в течение нескольких часов.
  2. Иммунизация
    1. Поместите мышей (6-8 недель старые, женщины) в потепления поле и ждать около 10 минут, чтобы позволить хвостовую вену, чтобы расширить.
    2. Трансфер одну мышь из коробки потепления к фиксатор мыши. Закройте фиксатор, чтобы избежать движение мыши.
    3. Заполните 1 мл инсулиновый шприц со 100 мкл коклюшного токсина (5 мкг / мл), избегая пузыри. Медленно введите решение в хвостовую вену. Удалите иглу и нажмите на несколько секунд с лист бумаги, чтобы включить кровотечение.
    4. Наведите мышь обратно в клетку и повторить ту же процедуру для всех мышей.
    5. Обезболить мышь с непрерывной ингаляции изофлуран (1-2%, 2 л / мин) и вводят 100 мкл эмульсии подкожно на уровнеиз двух боках и в основание хвоста (300 мкл эмульсии / мышь). Медленно удалите шприц, избегая утечку эмульсии.
    6. Отметить мышь с уха панчер, поместите мышей в клетке, а регистрация до полного выздоровления. Повторите эти действия для всех мышей.
    7. Через 48 ч (2 дня после иммунизации, точек на дюйм) повторите раздел 2.2.3.
  3. Поведенческий анализ мышей EAE
    1. Начиная с 5 руб, взвесить мышей ежедневно и контролировать их опорно-двигательного аппарата выступления с помощью масштабного систему подсчета очков, описанный в таблице 1.

3. Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников в хвостовую вену (IV)

  1. Подготовка Сотовый
    1. Урожай нейросферы путем центрифугирования при 300 мкг в течение 10 мин.
    2. Удалить супернатант и добавить 200 мкл клеточной совокупного раствора диссоциации. Выдержите 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    3. Аккуратно ресуспендирования 10-12х (avoidinг пузырьки) с Р200 до получения суспензии отдельных клеток и принять до 800 мкл с базальной среды без Са 2 + и Mg 2 +.
    4. Граф клеток с использованием витальным красителем для анализа жизнеспособности клеток и разбавления суспензии с базальной среды без Са 2 + и Mg 2 +, чтобы получить конечную плотность 10 6 клеток/150 мкл. Хранить клеточной суспензии на льду до использования.
  2. NPC впрыска IV
    NB: Идеальный диссоциации в суспензии отдельных клеток и отсутствие воздушных пузырьков два ключевых аспектов, чтобы рассмотреть, чтобы снизить риск либо сгустки / агрегатов против формирования эмболии, которые могли бы привести к окклюзии вены и последующей смерти.
    1. На пике заболевания (16-18 точек на дюйм), вес и набрать мышей. Распределить мышей в соответствии с их счетом, чтобы иметь однородные группы.
    2. Поместите мышей в условиях потепления поле и ждать около 10 минут, чтобы позволить хвостовую вену, чтобы расширить.
    3. Трансфер одну мышь из коробки потепления к фиксатор мыши. Закройте фиксатор, чтобы избежать движение мыши.
    4. Заполните 1 мл инсулиновый шприц с 150 мкл клеточной суспензии и не забудьте удалить все пузырьки. Медленно вводить раствор в хвостовую вену. Удалите иглу и нажмите на несколько секунд с лист бумаги, чтобы подключить кровотечения (6А и 6B).
    5. Наведите мышь в клетке, а регистрация до выздоровления. Повторите ту же процедуру для всех мышей.

4. Инъекция стволовых нервных / клеток-предшественников в цистерна (ICV)

  1. Подготовка Сотовый
    1. Урожай НПС путем центрифугирования при 300 мкг в течение 10 мин.
    2. Удалить супернатант и добавить 200 мкл клеточной совокупного раствора диссоциации. Выдержите 10 мин при 37 ° С, 5% СО 2.
    3. Аккуратно ресуспендирования 10-12x с Р200 до получения одного грлокоть подвеска и принять до 800 мкл с базальной среды без Са 2 + и Mg 2 +.
    4. Граф клеток и разбавления суспензии с базальной среды без Са 2 + и Mg 2 + для получения желаемой плотности клеток. Хранить клеточной суспензии на льду до использования.
  2. 4.2) впрыска NPC ICV
    1. На пике заболевания (16-18 точек на дюйм), вес и набрать мышей. Распределить мышей в соответствии с их счетом, чтобы иметь однородные группы.
    2. Наведите мышь на стереотаксической аппарата при непрерывном изофлурана ингаляции (1-2%, 2 л / мин). Закрепите голову мыши с уха баров. Тогда регулировать как рот и нос штук. Убедитесь, что глава мыши является плоской и закреплена.
    3. Тампон голову мыши с повидон-йода (ПВП-я) и сделать надрез, чтобы сократить кожу в задней части головки выставить череп.
    4. Использование микроманипулятора, вставьте кончик мклИТЭР шприц в щель между затылком и атлас позвонка через неповрежденную мышц и связок в средней линии на задней части шеи. Изогнутая часть иглы удерживается в плотном контакте с внутренней поверхностью затылка по всей длине, как описано 22.
    5. Медленно вставьте иглу и подождите несколько секунд. Оператор подразумевается научиться распознавать чувство игла быть "на крючок" к черепу мыши, предварительного начать инъекционных подготовку клеток. Медленно введите объем клеток (в пределах 3-5 мин). Оставьте иглу на месте для дополнительных нескольких секунд после инъекции и снимите медленно шприц.
    6. Стежка до кожи и не разместить мышь в клетке восстановления до полного выздоровления.

5. Тканей Обработка

  1. Глубоко анестезировать мышей смесью 0,5 мл кетамина (100 мг / мл), 0,25 мл ксилазина (23,32 мг / мл) и 4,25 мл стерильной воды и transcardically заливать, шозоления с физиологическим-EDTA и фиксации с 4% PFA. Снимите обе позвонков столбцы и мозги и постфикс в 4% PFA в течение 12 часов при 4 ° С. Промойте ткань в PBS, удалите спинной мозг из костей и оставить ткани, по крайней мере 48 часов в 30% сахарозы (в ФБР) при 4 ° С Вставить ткани в оптимальной температуры режущей (OCT) соединения и оснастки заморозить жидким азотом, как описано 2.
  2. Используйте микротома сократить тканей в 10-12 толстыми ломтиками мкм.
  3. С другой стороны, вставлять свежий ткани в агарозы и сократить ткани, используя толстые ломтики Vibratome 50-80 мкм.
  4. В обоих случаях, инкубировать O / N при 37 ° С в 5-бром-4-хлор-3-индолил-β D-галактопиранозид (X-Gal) раствор для обнаружения β-галактозидазы ядерного.
  5. Пересекаемых секций, содержащих β-гал + клеток в 5 мкм ломтиками и двойной пятна с помощью antiglial фибриллярный кислый белок (GFAP) для астроцитов (50 мкг / мл), antineuronal ядерного антигена (NeuN) для нейронов (1 &# 956; г / мл) и antiNestin для недифференцированных нервных клеток (10 мкг / мл).
  6. Действуйте, как описано в разделах 1.7.11 и 1.7.12. Для нескольких окрашивания обязательно используйте вторичные антитела, конъюгированные с разными флуорофорами.
  7. Для тканях, содержащих GFP помечены клетки продолжить, как описано в шагах 5.1-5.3 и заполните многочисленных окрашивания.
  8. Добавить несколько капель монтажной среды к слайдам и накройте ткани покровное.
  9. Для срезах, окрашенных биотин сопряженные антитела приготовить раствор авидин биотин комплекса (раствор ABC, см. таблицу 2) и оставить в агитации в течение 45 мин.
  10. Инкубируйте ломтиками 5 мин с 1% H 2 O 2, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы.
  11. Промыть два раза с PBS.
  12. Инкубировать с ABC раствор в течение 1 часа при комнатной температуре.
  13. Промыть два раза с PBS.
  14. Выдержите раствором 3,3 '-диаминобензидина и 0,3% H 2 O 2. Мониторинг реакции ипдер микроскопа и промывают PBS, как только кусок начинают получать коричневый (обычно около 5-10 мин).
  15. Мыть два раза с PBS и действуйте, как описано в шаге 5.7.

Полный список всех материалов и реагентов приведены в таблице 2.

Результаты

NPC вывод и характеристика
SVZ вскрытия выполняются на пулах (п = 5-7 мыши / бассейн) из 6-8 недельных мышей C57BL / 6 с помощью механического и ферментативной диссоциации (рис. 1А). Через несколько дней культивирования в CGM, свободно плавающие нейросферы начать формирование (1А

Обсуждение

Терапии соматических стволовых клеток, основанные становятся одним из наиболее перспективных стратегий для лечения хронических воспалительных заболеваний ЦНС, таких как MS2 11. Хотя механизмы поддерживающие их терапевтический эффект все еще должны быть полностью выяснены, значи...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Джейден Смит для критически рассмотрения и редактирования доказательство рукопись. Эта работа получила поддержку от Национального общества рассеянного склероза (НМС, частичных грантов RG-4001-A1), итальянский Рассеянный склероз Ассоциация (AISM, грант 2010/R/31), итальянский Министерство здравоохранения (GR08-7), Крылья для жизни, Banca Agricola Popolare ди Рагуза (BAPR), Европейского исследовательского совета (ERC) в соответствии с соглашением ERC-2010-StG грант № 260511-SEM_SEM и 7-й Рамочной программы Европейского сообщества (ЕС) (FP7/2007-2013) по гранту соглашения н * град; 280772 - IONE.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture
EBSSSigmaE2888
L-CysteinSigma AldrichC7352
PapainWorthington30H11965
EDTAFisher ScientificD/0700/50
Mouse NeuroCult basal mediumStem Cell Technologies05700
NeuroCult proliferation supplementsStem Cell Technologies05701
HeparinSigmaH3393
Basic fibroblast growth factorPeprotech100-18B-1000
Epidermal growth factorPeprotechAF-100-15-1000
Pen/StrepInvitrogen1514012
Matrigel (coating solution)BD Biosciences354230
NeuroCult® Differentiation Kit (Mouse)Stem Cell Technologies05704
AccumaxeBioscience00-4666-56
Dulbecco's PBS (DPBS) (10x) without Ca and MgPAA LaboratoriesH15-011
Myco tracePAA LaboratoriesQ052-020
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD2650
Immunofluorescence
Normal goat serumPAA LaboratoriesB11-035
Polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl etherSigma AldrichT8787
Mouse anti NestinAbcamab11306
Rabbit anti GFAPDAKO203344
Mouse anti Histone H3 (phospho S10) Abcamab14955
Rabbit anti MAP-2Abcamab32454
Rat anti MBPAbD SEROTECMCA409S
Anti-O4 Antibody, clone 81 | MAB345MilliporeMAB345
DAPIInvitrogenD1306
Mounting solutionDAKOS3023
EAE
Freund's Adjuvant IncompleteSigma AldrichF5506
Mycobacterium tuberculosisDIFCOH37Ra
MOG(35–55) Espikem
Pertussis toxinList Biological Laboratories181
Tissue processing
Iris scissor straightFine Sciences Tools14060-09
Blunt/bended forcepsFine Sciences Tools11080-02
Brain slicerZivic InstrumentsBSMAS005-1
Surgical bladesSwann-Morton324
P200, P1000 pipettes
Ketamine (Vetalar)Boehringer Ingelheim01LC0030
Xylazine (Rompun)Bayer32371
Stereotaxic frameKOPFModel 900
Hamilton syringeHamilton7762-04
Paraformaldehyde (PFA)Sigma158127
VECTASTAIN Elite ABC KitVector LaboratoriesPK-6100

Ссылки

  1. Ben-Hur, T., et al. Transplanted multipotential neural precursor cells migrate into the inflamed white matter in response to experimental autoimmune encephalomyelitis. Glia. 41, 73-80 (2003).
  2. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, 688-694 (2003).
  3. Chu, K., Kim, M., Jeong, S. W., Kim, S. U., Yoon, B. W. Human neural stem cells can migrate, differentiate, and integrate after intravenous transplantation in adult rats with transient forebrain ischemia. Neurosci. Lett. 343, 129-133 (2003).
  4. Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14, 634-644 (2008).
  5. Pluchino, S., et al. Neurosphere-derived multipotent precursors promote neuroprotection by an immunomodulatory mechanism. Nature. 436, 266-271 (2005).
  6. Einstein, O., et al. Intraventricular transplantation of neural precursor cell spheres attenuates acute experimental allergic encephalomyelitis. Mol. Cell Neurosci. 24, 1074-1082 (2003).
  7. Chu, K., et al. Human neural stem cell transplantation reduces spontaneous recurrent seizures following pilocarpine-induced status epilepticus in adult rats. Brain Res. 1023, 213-221 (2004).
  8. Jeong, S. W., et al. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke. 34, 2258-2263 (2003).
  9. Aboody, K. S., et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: evidence from intracranial gliomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12846-12851 (2000).
  10. Muller, F. J., Snyder, E. Y., Loring, J. F. Gene therapy: can neural stem cells deliver. Nat. Rev. Neurosci. 7, 75-84 (2006).
  11. Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nat. Rev. Neurosci. 7, 395-406 (2006).
  12. Deckert-Schluter, M., Schluter, D., Hof, H., Wiestler, O. D., Lassmann, H. Differential expression of ICAM-1, VCAM-1 and their ligands LFA-1, Mac-1, CD43, VLA-4, and MHC class II antigens in murine Toxoplasma encephalitis: a light microscopic and ultrastructural immunohistochemical study. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 457-468 (1994).
  13. Hemmer, B., Archelos, J. J., Hartung, H. P. New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurosci. 3, 291-301 (2002).
  14. Butcher, E. C., Picker, L. J. Lymphocyte homing and homeostasis. Science. 272, 60-66 (1996).
  15. Rampon, C., et al. Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44. Stem Cells. 26, 1673-1682 (2008).
  16. Pluchino, S., et al. Human neural stem cells ameliorate autoimmune encephalomyelitis in non-human primates. Ann. Neurol. 66, 343-354 (2009).
  17. Martino, G., Pluchino, S., Bonfanti, L., Schwartz, M. Brain regeneration in physiology and pathology: the immune signature driving therapeutic plasticity of neural stem cells. Physiol. Rev. 91, 1281-1304 (2011).
  18. Aharonowiz, M., et al. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursors in an animal model of multiple sclerosis. PLoS ONE. 3, e3145 (2008).
  19. Pluchino, S., et al. Immune regulatory neural stem/precursor cells protect from central nervous system autoimmunity by restraining dendritic cell function. PLoS One. 4, (2009).
  20. Einstein, O., et al. Neural precursors attenuate autoimmune encephalomyelitis by peripheral immunosuppression. Ann. Neurol. 61, 209-218 (2007).
  21. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  22. Furlan, R., Pluchino, S., Marconi, P. C., Martino, G. Cytokine gene delivery into the central nervous system using intrathecally injected nonreplicative viral vectors. Methods Mol. Biol. 215, 279-289 (2003).
  23. Constantin, G. Visualization and analysis of adhesive events in brain microvessels by using intravital microscopy. Methods Mol. Biol. 239, 189-198 (2004).
  24. Politi, L. S., et al. Magnetic-resonance-based tracking and quantification of intravenously injected neural stem cell accumulation in the brains of mice with experimental multiple sclerosis. Stem Cells. 25, 2583-2592 (2007).
  25. Melzi, R., et al. Co-graft of allogeneic immune regulatory neural stem cells (NPC) and pancreatic islets mediates tolerance, while inducing NPC-derived tumors in mice. PLoS One. 5, (2010).
  26. Amariglio, N., et al. Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 6, (2009).
  27. Ben-Hur, T., et al. Effects of proinflammatory cytokines on the growth, fate, and motility of multipotential neural precursor cells. Mol. Cell Neurosci. 24, 623-631 (2003).
  28. Giusto, E., Donega, M., Cossetti, C., Pluchino, S. Neuro-immune interactions of neural stem cell transplants: From animal disease models to human trials. Exp. Neurol. , (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Immunology86

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены