一个完整的皮肤缺损模型，以评估生物材料的血管化<em&gt;体内</em

摘要

血管是关键，成功的组织工程方法。因此，可靠的技术是必需的，以评估组织构建体的血管网络的发展。在这里，我们提出一个简单和具有成本效益的方法来可视化和量化血管在体内 。

摘要

血管化不足被认为是限制性的组织工程化构建体的临床成功的主要因素之一。为了评价新的策略，其目的是提高血管化的，可靠的方法是必需的，以使得在生长的新血管进入生物人工支架可见和量化的结果。在过去的几年中，我们的团队已经推出了全层皮肤缺损模型，使血管的直接可视化通过透，并提供量化，通过数字化分割的可能性。在此模式中，一个外科地在小鼠背部创建完整皮肤缺陷并将它们替换为所测试的材料。分子或感兴趣的细胞也可以在这些材料掺入以研究它们的潜在影响。经过自己选择的观察时间，材料植进行评估。双侧伤口提供进行内部比较次的可能在减少个体之间的工件，以及减少所需的研究的动物的数量的。相较于其他方法，我们的方法提供了一种简单，可靠和具有成本效益的分析。我们已经实现了这个模式作为常规工具测试不同的生物材料和生物活化方法的血管时，执行高解析度的筛选。

引言

在最近的几十年中，组织工程开辟了新的治疗选择与人体自身的细胞替换¹组织缺损。为了支持组织再生的生理过程，支架被设计成可生物降解的结构，即提供了一种方案，其中从伤口床的细胞能生长和恢复的缺陷^2,3。

血管化不足被认为是主要的障碍，这阻碍了生物人工支架⁴的临床突破。与细胞的向内生长，营养物质和氧的增加，材料的血管化的需求变得至关重要。因此不足或延迟血管可导致组织工程产品⁵中央坏死。此外，血管提供免疫感受态细胞并去除代谢残留在再生区。高感染率和低再生只部分的血流灌注不足，在组织工程中所观察到的结果，其目的都是为了通过增加支架^6,7的血管被避免。

几种策略，目的是改善血管聚焦在生物材料本身和支架的微观结构中的关键作用。有深入的研究努力，从修理转向愈合过程中再生 ，从而（重新）产生的组织与最接近的生理特性，以一个开发新的方法来恢复^8,9。到研究和评估与问候他们的再生潜能的生物材料包括胶原蛋白，纤维蛋白，壳聚糖和海藻酸钠^10,11。这些生物材料可以使用，组合为骨干，建立使用不同的策略，新的支架，如脱细胞组织，自组装，快速成型和静电^12。为了ENHANCE人体自身的再生能力，支架可生物活化。重组血管生成生长掺入因子¹³或基因载体等因素后¹⁴编码已经显示出改善支架的血管。利用干细胞已被广泛证明是一种很有前途的战略，以改善血管化，其中的间充质基质细胞和内皮祖细胞获得了最多的关注^15,16。其他方法试图建立包含移植前¹⁷预制的血管网络结构。尽管支架设计密集的努力和他们的生物活性，没有战略已经在临床上显著水平提高血管，并与大规模烧伤除真皮替代的，翻译生物工程材料进入临床常规只发生欲言又止¹⁸ 。

之一的原因的血管人工组织结构仍然是一个未解决的问题，是评价新技术在体内的方法取得成功的难度。虽然在体外实验可提供支架的血管形成潜力的重要的见解，合适的动物模型是必需的，研究的关键参数，如材料的生物相容性，该处理的特别重要的安全性和有效性，并且，该组织的血管构建。因此，可靠的工具来可视化和量化的血管网络， 在体内是必需的。

在本研究中，我们提出了一种简单而可靠的方法，它允许取出的支架内的血管网络的可视化和量化。这个方法是基于组织透和数字分割。由于该方法是非侵入性的，它可以使靶材料的进一步分子和组织学分析。

研究方案

1，准备的支架

1. 通过使用12毫米活检穿孔产生的支架的样品。
2. 引进生物活性分子或细胞进入支架，轻轻挤压它们，用无菌纱布引流支架。然后通过加入160微​​升含有生物活性分子或所关注的细胞的溶液中再水化的支架。仔细检查，通过代谢试验，如MTT法生物活化与细胞的成功。
3. 如果需要的话，固定的化合物或细胞可以在支架内测试了通过在纤维蛋白的​​凝血酶溶液或水凝胶递送它们，例如，再经过补液如在步骤1.2中描述。
   注意：此步骤可以是有益的，当化合物或细胞不机械地附着到材料。一个也可以控制化合物的释放动力学..
4. 制备的钛化网格，这将在每一个实验组和对照组被放置在每个支架下，通过cuttin克出圆形片，约14毫米的直径。
   注：钛化网格可以作为划定从伤口床再生的组织所需要的物理边界。

2，动物

1. 在实施之前所提出的模型，请咨询相应的动物保护法，并从当地政府获得许可。在这项工作中，所有实验用小鼠进行的，根据目前德国的动物福利法，并经区政府上巴伐利亚（Regierung冯Oberbayern）。
2. 慎选动物和应变。尽管建立了小鼠模型中，它可以转化为其他常见的动物，如大鼠，兔子或猪。
3. 如果您正在使用的毛皮动物，剃动物的支架植入前回来。
   注意：此工作使用的6至8周龄小鼠介于20g和25克，但是不同年龄和b体重ODY权重也可以使用。

3，麻醉

1. 进行无菌条件下操作。为了维持动物的正常体温下，使用加温垫。
2. 之前的吸入麻醉的动物接受Buprenorphin在0.05-0.1 mg / kg体重，皮下每天8小时的剂量。
3. 将下吸入性麻醉（异氟烷）的动物或申请同等标准的程序。确认麻醉或者轻轻挤压动物的脚趾或通过皮肤捏。
4. 为了防止exsiccosis，在操作开始时注入0.5毫升生理盐水溶液皮下注射。

4，切除的皮肤

1. 将动物俯卧位，并标明鼠标的背面采用了细尖永久性笔（ 图1A）的中线。
2. 定义切除区域。将缺陷中Figu所示的区域重新1C。请注意，如果缺陷被放置太尾端，动物更容易去除敷料和支架。
3. 创建全面采用10毫米活检穿孔（ 图1B）双边缺陷。冲头应仔细被迫靠着皮肤，并且不能用来完全切透皮肤，但划定切除区域（ 图1C及1E）。
4. 轻轻抬离皮肤明显用镊子沿采用精细手术剪（ 图1F）标记的圆圈切割。若出血，仔细压缩用无菌纱布。切除的一步一步的描述如图1所示。
   注：该缺陷是用较小的穿孔比所述一个用于产生支架创建，以弥补该缺陷的扩大是由于皮肤的弹性。

5，支架植入术

1. 为了使空间的蒂塔欲使网眼，延长皮肤和下面的组织的分离在2-4毫米（ 图2A）的伤口边界。
2. 将钛化网进缺损直接对创面的伤口边缘（ 图2A和B）的。
3. 脚手架的地方直接在网格。
4. 缝合的支架与相邻的伤口边缘与4至6个单结，留下的边缘略微超过所述支架（ 图2C）。
   注意：避免使用可生物降解的缝线。
5. 缝合的透明伤口敷料上面的缺陷，以保护所述支架，同时允许监测伤口区域（ 图2D）的。

6，术后护理

1. 让每笼一只老鼠，以避免敷料和支架相互操作。
2. 通过观察运动活动，体重，疼痛的迹象，宽容评估每天动物的一般状态在更衣室和自动切割。还监测伤口区域的出血，局部和全身感染的迹象和敷料的位置。
3. 为了最大限度地减少了动物的痛苦，每日注射Buprenorphin在0.05-0.1 mg / kg体重或等效镇痛药物的剂量。
4. 如果鼠标删除或损坏的伤口敷料，更换或重新连接在麻醉下。

7安乐死的脚手架和外植

1. 在期望的时间点，由戊巴比妥（150毫克/千克）的过量牺牲动物。
2. 马克皮肤切除的部位用永久性记号笔，其中应包括支架，并尽可能多的鼠标背部皮肤越好（ 图3A）。
3. 沿着切开用剪刀或手术刀的标线在皮肤上。拆下整个皮肤，包括支架和钛化目，通过生硬的准备下面的组织（ 网络gure 3B）。
4. 将取出的组织伸出在培养皿上（ 图3C和D）

8，可视化的血管网和定量

1. 透：
   1. 成立了透设备，通过安装培养皿上面的白色光（100瓦标准灯泡）强大的源泉。
   2. 固定透射以上数码相机，以获得数码照片。
   3. 将样品在培养皿上的透设备倒挂。
   4. 采取在微距模式的完整支架的照片，以及正常皮肤的同样大小的区域。在进一步的数字分析TIFF格式存储的图像。
   5. 除组织进行进一步的生化或组织学分析。
2. 数字细分和量化：
   1. 下载并安装VesSeg，工具软件，它可以得到FR负责EE在： http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 。
   2. 打开图片与VesSeg - 工具软件。
   3. 选择覆盖所述支架用于数字分析（图片→选择）的图像的区域。
   4. 为了提高船舶的对比使用选项“迟滞阈值”（图像→血管增强过滤器→迟滞阈值→顶帽变换→计算血管增强）。
   5. 进行血管图（图像→血管增强过滤器→迟滞阈值→阈值的边界）的分割。选择所述第一阈值（“船只覆盖”），因此每一个像素，这甚至远程容器状，将被标记为容器。选择所述第二阈值（“背景覆盖”），因此，只有那些像素是特别容器状将被标记为容器。
   6. 手动检查自动分割建议添加非捕获的船只和消除常见的假阳性的结构，它通常是长而薄，血管样结构，例如毛发或缝线。
   7. 计算血管的长度和覆盖船（图像→图像统计→二进制图像的统计）的总面积。
      注：对于血管长度的计算，血管生成的血管地图减薄到线，一个像素²⁰的宽度。
3. 根据相同的参数的支架分析天然皮肤区域，分配100％的值的原生组织和涉及该支架到该值。例如，如果白色像素的比例是60％，在正常组织和在该支架30％时，就表示该支架的50％的血管。注意：白色容器覆盖分配给周围的脚手架的正方形的面积。调整白色像素覆盖率consi数dering该圆的面积是显著较小（πX读^2）比正方形（4×R ^2）。

结果

一个可靠的双边全皮肤缺损所用的小鼠（ 图1），其中所述皮肤可以由生物材料进行研究（ 图2）来代替被创建。在这里，没有严重的并发症是中或手术操作后，无论是宏观的感染或异物反应的迹象观察。在极少数情况下，支架被当鼠标中删除丢失。伤口收缩从未被观察到（ 图3）。组织透允许明确的高达30微米的宽度的血管结构的可视化，整个组织样品，其?...

讨论

有必要建立在改善血流灌注组织工程构建，这需要新的可靠的方法发展到生物材料研究中的血管形成过程中的成功做法。用于制造支架的血管的体外可见常见的方法包括使用显微镜，它提供了高分辨率的工具。在大多数情况下，虽然，这种方法仅限于较小的组织区域的分析，而且往往是昂贵的和费时的。此外，它通常包括复杂的标签和染色的方法，其中血液灌注容器不能从非功能性的人

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10