Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Riepilogo

Vascolarizzazione è la chiave per approcci in ingegneria dei tessuti successo. Pertanto, tecnologie affidabili sono necessari per valutare lo sviluppo di reti vascolari in tessuto-costrutti. Qui vi presentiamo un metodo semplice e conveniente per visualizzare e quantificare vascolarizzazione in vivo.

Abstract

Vascolarizzazione insufficiente è considerata uno dei principali fattori limitanti il ​​successo clinico di costrutti tissutale. Al fine di valutare nuove strategie che mirano a migliorare la vascolarizzazione, metodi affidabili sono tenuti ad effettuare la in-crescita di nuovi vasi sanguigni in impalcature visibili bio-artificiale e quantificare i risultati. Negli ultimi due anni, il nostro gruppo ha introdotto un modello di difetto completo della pelle che consente la visualizzazione diretta dei vasi sanguigni da parte transilluminazione e fornisce la possibilità di quantificazione attraverso la segmentazione digitale. In questo modello, si crea chirurgicamente difetti pieni di pelle nella parte posteriore di topi e li sostituisce con il materiale testato. Molecole o cellule di interesse possono anche essere incorporati in tale materiale, per studiare il loro effetto potenziale. Dopo un periodo di osservazione di uno di propria scelta, i materiali vengono espiantati per la valutazione. Ferite bilaterali offrono la possibilità di fare confronti interni tha minimizzare gli artefatti tra individui nonché di diminuire il numero di animali necessari per lo studio. In confronto ad altri approcci, il nostro metodo offre una semplice, efficace analisi affidabile ed economica. Abbiamo implementato questo modello come strumento di routine per eseguire lo screening ad alta risoluzione durante il test vascolarizzazione di diversi biomateriali e approcci bio-attivazione.

Introduzione

Negli ultimi decenni, l'ingegneria dei tessuti ha aperto una nuova opzione terapeutica per sostituire difetti del tessuto con le cellule del corpo ^1. Al fine di sostenere il processo fisiologico di rigenerazione tissutale, ponteggi sono progettati come una struttura biodegradabile, che fornisce uno scenario in cui le cellule dal letto della ferita possono crescere e ripristinare il difetto ^2,3.

Vascolarizzazione insufficiente è considerata il principale ostacolo, che trattiene la svolta clinico di scaffold bioartificiali ^4. Con la ricrescita delle cellule, la domanda di sostanze nutritive e di ossigeno aumenta e vascolarizzazione del materiale diventa essenziale. Vascolarizzazione insufficiente o ritardato può quindi portare a necrosi centrale dei prodotti dell'ingegneria tissutale ^5. Inoltre, i vasi sanguigni forniscono le cellule immunocompetenti e rimuovere i residui metabolici nella zona rigenerante. Gli alti tassi di infezione e la bassa rigenerazione sono soloalcune delle conseguenze di una insufficiente perfusione sanguigna osservato in ingegneria dei tessuti, che mirano ad essere evitato aumentando la vascolarizzazione dei ponteggi ^6,7.

Diverse strategie che mirano a migliorare la vascolarizzazione attenzione sul ruolo chiave del biomateriale stesso e la microstruttura del patibolo. Ci sono sforzi di ricerca intensivi per sviluppare nuovi approcci nello spostare il processo di guarigione dalla riparazione alla rigenerazione, quindi (ri) generazione di un tessuto con le proprietà fisiologiche più vicino a quello da ristrutturare ^8,9. Biomateriali che sono stati studiati e valutati con riferimento al loro potenziale rigenerativo inclusi collagene, fibrina, chitosano e alginato ^10,11. Questi biomateriali possono essere utilizzati e combinati come una spina dorsale per la costruzione di nuove impalcature utilizzando diverse strategie come decellularization tessuto, auto-assemblaggio, prototipazione rapida e elettrospinning ^12. Per ENHANCE propria capacità rigenerativa del corpo, ponteggi possono essere bioattivato. L'incorporazione di crescita angiogenico ricombinante fattori di ¹³ o vettori di geni che codificano per fattori ¹⁴ ha dimostrato di migliorare la vascolarizzazione del patibolo. L'uso di cellule staminali è stato ampiamente dimostrato di essere una strategia promettente per migliorare la vascolarizzazione, dove le cellule stromali mesenchimali e le cellule progenitrici endoteliali hanno guadagnato più attenzione ^15,16. Altri approcci tentano di costruire costrutti che contengono le reti dei vasi prefabbricati prima del trapianto ^17. Nonostante intensi sforzi nella progettazione patibolo e la loro bio-attivazione, nessuna strategia è migliorata vascolarizzazione a livello clinicamente significativo e, con l'eccezione di sostituzioni dermici in massicce ustioni, la traduzione di materiali bioengineered nella routine clinica si sta solo posto esitante ¹⁸ .

Una delle ragioni per cui vascolarizzazionedi costrutti di tessuto artificiale è ancora un problema irrisolto, è la difficoltà di valutare il successo delle nuove tecnologie negli approcci in vivo. Anche se gli esperimenti in vitro possono fornire importanti intuizioni del potenziale vascolarizzazione di ponteggi, modelli animali appropriati sono tenuti a studiare i parametri chiave quali la biocompatibilità del materiale, la sicurezza e l'efficacia del trattamento e, di particolare importanza, la vascolarizzazione del tessuto costruire. Pertanto, strumenti affidabili per visualizzare e quantificare le reti dei vasi sanguigni in vivo sono essenziali.

In questo studio presentiamo un metodo semplice e affidabile che permette la visualizzazione e la quantificazione della rete vascolare all'interno ponteggi espiantati. Questo metodo si basa sulla transilluminazione tessuto e segmentazione digitale. Poiché questo metodo è non invasivo, permette ulteriori analisi molecolari e istologiche del materiale bersaglio.

Protocollo

1 Preparazione di Ponteggi

1. Generare campioni dei ponteggi utilizzando 12 millimetri pugni biopsia.
2. Per introdurre molecole bioattive o cellule nel patibolo, drenare i ponteggi da loro stringendo delicatamente con una garza sterile. Poi reidratare i ponteggi aggiungendo 160 ml di una soluzione contenente le molecole bioattive o cellule di interesse. Ricontrollare il successo di bioattivazione con cellule attraverso saggi metaboliche come MTT saggi.
3. Se necessario, fissare i composti o le cellule da testare all'interno del ponteggio fornendo loro, ad esempio in una soluzione di fibrina-trombina o un idrogel, ancora attraverso reidratazione come descritto al punto 1.2.
   NOTA: Questo passaggio può essere utile quando i composti o le cellule non attribuiscono meccanicamente al materiale. Si può anche controllare le dinamiche di rilascio dei composti ..
4. Preparare le maglie titanized, che saranno collocati sotto ogni impalcatura in ogni gruppo di sperimentazione e di controllo, da Cutting i pezzi a forma rotonda, di circa 14 mm di diametro.
   NOTA: La maglia titanized funziona come un confine fisico richiesto per delimitare il tessuto rigenerato dal letto della ferita.

2. Animali

1. Prima attuazione del modello presentato, consultare le leggi di protezione degli animali corrispondenti e ottenere il permesso da parte delle autorità locali. In questo lavoro, tutti gli esperimenti sono stati effettuati con topi, secondo l'attuale atto benessere degli animali tedesca e approvati dal governo distretto dell'Alta Baviera (Regierung von Oberbayern).
2. Scegliere con cura l'animale e la tensione. Anche se il modello è stato stabilito per i topi, che può essere tradotto ad altri animali comuni, come ratti, conigli e maiali.
3. Nel caso in cui si sta lavorando con gli animali pelo, radere la parte posteriore degli animali prima dell'impianto degli scaffold.
   NOTA: Questo lavoro utilizza topi di 6 a 8 settimane di età con un peso corporeo compreso tra 20 ge 25 g, ma diverse età e bpesi ody possono anche essere utilizzati.

3 Anestesia

1. Effettuare l'operazione in condizioni sterili. Al fine di mantenere la normale temperatura corporea dell'animale, utilizzare un tappetino riscaldante.
2. Prima di inalazione anestesia gli animali ricevono buprenorfina alla dose di 0,05-0,1 mg / kg di peso corporeo, per via sottocutanea ogni 8 ore.
3. Posizionare l'animale in anestesia per inalazione (isoflurano) oppure applicare procedure standard equivalenti. Confermare l'anestesia sia premendo delicatamente le dita dei piedi dell'animale o tramite un pizzico di pelle.
4. Per evitare essiccosi, iniettare 0,5 ml di soluzione salina fisiologica sottocute all'inizio dell'operazione.

4. escissione della pelle

1. Mettere l'animale in posizione prona e segnare la linea mediana della schiena del mouse con una punta fine penna permanente (Figura 1A).
2. Definire l'area di escissione. Mettere i difetti nell'area mostrata in Figuri 1C. Si noti che se i difetti siano troppo caudalmente, gli animali sono più inclini a rimuovere le medicazioni ed i ponteggi.
3. Crea rotondo difetti bilaterali utilizzando una biopsia del punzone 10 mm (Figura 1B). Il punzone deve essere attentamente forzato contro la pelle e non deve essere usato per tagliare completamente attraverso la pelle, ma per delineare l'area di escissione (Figure 1C e 1E).
4. Sollevare delicatamente la pelle sensibile con una pinza e incidere lungo il cerchio marcato con le forbici chirurgiche sottili (Figura 1F). In caso di sanguinamento, comprimere delicatamente con una garza sterile. Una descrizione passo-passo della escissione è mostrato in Figura 1.
   NOTA: Il difetto viene creato con un punzone inferiore a quello per la generazione dei ponteggi, per compensare l'allargamento del difetto dovuto alla elasticità della pelle.

5. Scaffold impianto

1. Al fine di rendere lo spazio per il titasciuta maglia, estendere la separazione della pelle e dei tessuti sottostanti alle frontiere ferita per 2-4 mm (Figura 2A).
2. Posizionare il titanized maglia nel difetto direttamente sul letto della ferita e sotto i bordi della ferita (Figure 2A e B).
3. Luogo Ponteggi direttamente sulla maglia.
4. Suturare i ponteggi ai bordi della ferita adiacenti con 4 a 6 singoli nodi, lasciando i bordi leggermente sopra il patibolo (Figura 2C).
   NOTA: Evitare l'uso di suture biodegradabili.
5. Suturare una ferita medicazione trasparente sopra i difetti di proteggere il ponteggio pur consentendo il monitoraggio della ferita (Figura 2D).

6. postoperatoria Cura

1. Mantenere un mouse per gabbia per evitare la manipolazione reciproca della medicazione e ponteggi.
2. Valutare lo stato generale dell'animale su una base quotidiana per attività osservando motore, il peso corporeo, segni di dolore, tolleranzaper la medicazione e auto-mutilazione. Monitorare anche la zona della ferita di sanguinamento, locale e segni sistemici di infezione e la posizione della medicazione.
3. Per ridurre al minimo il dolore dell'animale, iniettare buprenorfina ogni giorno alla dose di 0,05-0,1 mg / kg di peso corporeo o farmaci analgesici equivalente.
4. Se il mouse rimuove o danneggia la medicazione della ferita, sostituire o ricollegare sotto anestesia.

7 Eutanasia e Espianto dell'impalcatura

1. A intervalli di tempo desiderati, sacrificare gli animali da overdose di pentobarbital (150 mg / kg).
2. Segnare il sito di escissione pelle con un pennarello indelebile, che dovrebbe includere i ponteggi e quanto del mouse schiena pelle possibile (Figura 3A).
3. Incidere la pelle lungo le linee segnate con un paio di forbici o un bisturi. Staccare tutta la pelle, compresi i ponteggi e la rete titanized, dal tessuto sottostante attraverso la preparazione smussato (Fifigura 3B).
4. Posizionare il tessuto espiantato sdraiati su una piastra di Petri (Figura 3C e D)

8 Visualizzazione e quantificazione della rete vascolare

1. La transilluminazione:
   1. Configurare un dispositivo transilluminazione, montando una piastra di Petri di sopra di una forte sorgente di luce bianca (100 Watt lampadina standard).
   2. Fissare una fotocamera digitale sopra il transilluminatore per ottenere immagini digitali.
   3. Posizionare i campioni a testa in giù sulla piastra di Petri sul dispositivo transilluminazione.
   4. Scattare foto dei ponteggi completi in modalità macro, nonché delle aree di uguali dimensioni di pelle normale. Conservare le immagini in formato TIFF per ulteriori analisi digitale.
   5. Salvare il tessuto per ulteriori analisi biochimica o istologica.
2. Segmentazione digitale e quantificazione:
   1. Scaricare e installare il software VesSeg-Tool, che può essere ottenuto free di carica a: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
   2. Apri l'immagine con il software VesSeg-Tool.
   3. Selezionare l'area dell'immagine oggetto del ponteggio per l'analisi digitale (Immagine → Seleziona).
   4. Per aumentare il contrasto delle navi usare l'opzione "Isteresi soglia" (Immagine → valorizzazione Vaso filtro → Isteresi soglia → Top-Hat trasformazione → Calcolare la valorizzazione nave).
   5. Procedere con la segmentazione della mappa imbarcazione (confini Immagine → valorizzazione Vaso filtro → Isteresi soglia → Threshold). Selezionare la prima soglia ("copertura Vessel"), così ogni pixel, che è anche lontanamente nave simile, sarà etichettato come nave. Selezionare la seconda soglia ("copertura Background"), in modo che solo i pixel che sono particolarmente nave-come saranno etichettati come i vasi.
   6. Controllare la proposta automatica di segmentazione manualmente per aggiungere le navi non catturati e per eliminare i falsi positivi strutture comuni, che di solito sono strutture lunghe e sottili vasi simili, come peli o suture.
   7. Calcolare la lunghezza dei vasi e la superficie totale coperta da navi (statistiche Immagine → Immagine → statistiche immagine binaria).
      NOTA: Per il calcolo della nave lunghezze, navi in risultante cartina nave sono assottigliate a linee con una larghezza di un pixel ^20.
3. Analizzare l'area pelle nativo sotto gli stessi parametri i ponteggi, assegnando un valore di 100% per il tessuto nativo e riguardano il patibolo a quel valore. Per esempio, se la percentuale di pixel bianchi è del 60% nel tessuto normale e il 30% nel ponteggio, rappresenterebbe una vascolarizzazione 50% del ponteggio. Nota: La copertura vasi bianco viene assegnato l'area di un quadrato attorno al patibolo. Regolare il numero di pixel bianchi consi coperturadering che l'area del cerchio è significativamente più piccolo (π x R ²⁾ del quadrato (4 x R ^2).

Risultati

Un difetto pelle piena bilaterale affidabile può essere creato nel topo (Figura 1) in cui la pelle può essere sostituito da un biomateriale in studio (Figura 2). Qui, senza grandi complicazioni si osservano durante o dopo la procedura operativa, né segni macroscopici di infezione o reazione da corpo estraneo. In rari casi, una impalcatura si perde quando un mouse rimuove. Contrazione della ferita non è mai stato osservato (Figura 3). Tissue transilluminazione permes...

Discussione

Vi è la necessità di stabilire approcci di successo nel migliorare la perfusione sanguigna in ingegneria tessutale costrutti, che richiede lo sviluppo di nuovi metodi affidabili per studiare i processi di vascolarizzazione all'interno dei biomateriali. Metodi comuni per la preparazione di scaffold vascolarizzazione ex vivo visibile includono l'uso della microscopia, che fornisce uno strumento ad alta risoluzione. Nella maggior parte dei casi, però, questo metodo è limitato all'analisi di piccole...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10