A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Resumo

A vascularização é essencial para abordagens de engenharia de tecidos bem sucedida. Portanto, tecnologias confiáveis ​​são necessários para avaliar o desenvolvimento de redes vasculares em tecido construções. Aqui apresentamos um método simples e de baixo custo para visualizar e quantificar a vascularização in vivo.

Resumo

Vascularização insuficiente é considerada um dos principais fatores que limitam o sucesso clínico de construções de engenharia de tecidos. A fim de avaliar novas estratégias que visam melhorar a vascularização, métodos confiáveis ​​são necessários para fazer o em-crescimento de novos vasos sanguíneos em andaimes bio-artificial visíveis e quantificar os resultados. Ao longo dos últimos dois anos, nosso grupo apresentou um modelo de defeito pele completa que permite a visualização direta dos vasos sanguíneos por transiluminação e oferece a possibilidade de quantificação através da segmentação digital. Neste modelo, uma cria cirurgicamente defeitos da pele cheio nas costas de camundongos e substitui-los com o material testado. Moléculas ou células de interesse, também pode ser incorporado em tais materiais para estudar o seu efeito potencial. Depois de um tempo de observação de uma de própria escolha, os materiais são explantada para avaliação. Feridas bilaterais oferecem a possibilidade de fazer comparações internas ªa minimizar artefactos entre indivíduos, bem como de diminuir o número de animais necessários para este estudo. Em comparação com outras abordagens, o nosso método oferece uma análise simples e eficaz, confiável e de custo. Nós implementamos este modelo como uma ferramenta de rotina para realizar a triagem de alta resolução ao testar a vascularização de diferentes biomateriais e abordagens bio-ativação.

Introdução

Em décadas recentes, a engenharia de tecidos, abriu uma nova opção terapêutica para substituir defeitos de tecidos com células do próprio corpo ^um. A fim de apoiar o processo fisiológico da regeneração de tecidos, andaimes são concebidos como uma estrutura biodegradável, que proporciona um cenário em que as células do leito da ferida pode crescer e restaurar o defeito de ^2,3.

Vascularização insuficiente é considerada o principal obstáculo que impede o avanço clínico de andaimes Bioartificiais ^4. Com o crescimento de células, a procura de nutrientes e de oxigénio e aumento da vascularização do material torna-se essencial. Vascularização insuficiente ou atrasada pode, portanto, levar à necrose central de produtos da engenharia de tecidos ^5. Além disso, os vasos sanguíneos fornecem células imunocompetentes e remover os resíduos metabólicos na zona de regeneração. Altas taxas de infecção e baixa regeneração são apenasalgumas das consequências de perfusão sanguínea insuficiente observados na engenharia de tecidos, que são destinadas a ser evitada pelo aumento da vascularização dos andaimes ^6,7.

Várias estratégias que visam melhorar a vascularização foco no papel fundamental da própria biomaterial ea microestrutura do andaime. Há esforços de pesquisa intensiva para desenvolver novas abordagens em mudar o processo de cicatrização de reparação para a regeneração, assim, (re) produzir um tecido com propriedades fisiológicas mais próximos o único a ser restaurados ^8,9. Biomateriais que foram estudados e avaliados no que diz respeito ao seu potencial regenerativo incluído colágeno, fibrina, quitosana e alginato ^10,11. Estes biomateriais podem ser usados ​​e combinados como uma espinha dorsal para a construção de novos scaffolds utilizando diferentes estratégias como descelulação tecido, auto-montagem, prototipagem rápida e eletrofiação ^12. A fim de ENHance própria capacidade regenerativa do corpo, andaimes podem ser bioactivado. A incorporação de crescimento angiogénico recombinante factores ¹³ ou genes vectores que codificam para factores tais ¹⁴ demonstrou melhorar a vascularização do andaime. A utilização de células estaminais tem sido amplamente demonstrado ser uma estratégia promissora para melhorar a vascularização, em que as células estromais mesenquimatosas e células progenitoras endoteliais ganharam mais atenção ^15,16. Outras abordagens tentam construir estruturas que contêm redes de vasos pré-fabricadas antes do transplante ^17. Apesar dos esforços intensivos em design de andaime e sua bio-ativação, nenhuma estratégia melhorou a vascularização em um nível clinicamente significativo e, com exceção de substituições dérmicas em queimaduras maciças, a tradução de materiais de bioengenharia na rotina clínica é só ocorrendo hesitante ¹⁸ .

Uma das razões pelas quais a vascularizaçãode construções de tecidos artificiais é ainda um problema não resolvido, é a dificuldade de avaliar o sucesso das novas tecnologias em abordagens in vivo. Embora experiências in vitro pode fornecer informações importantes sobre o potencial de vascularização de andaimes, modelos animais apropriados são necessários para estudar os parâmetros-chave, tais como a biocompatibilidade do material, a segurança ea eficácia do tratamento e, de particular importância, a vascularização do tecido construir. Portanto, ferramentas confiáveis ​​para visualizar e quantificar redes de vasos sanguíneos in vivo são essenciais.

Neste estudo apresentamos um método simples e confiável que permite a visualização e quantificação da rede vascular no interior andaimes explante. Este método baseia-se no tecido de transiluminação e segmentação digital. Uma vez que este método é não-invasivo, que permite novas análises moleculares e histológicos do material alvo.

Protocolo

1 Preparação de andaimes

1. Gerar amostras dos scaffolds usando 12 milímetros punções.
2. Para introduzir moléculas bioativas ou células para o cadafalso, drenar os andaimes delicadamente apertando-os com uma gaze estéril. Em seguida, re-hidratar os andaimes por adição de 160 ul de uma solução contendo as moléculas bioactivas ou células de interesse. Confira o sucesso de bioactivação com células através de ensaios metabólicos, como MTT Ensaios.
3. Se necessário, corrigir os compostos ou as células a serem testadas dentro do andaime, fornecendo-lhes, por exemplo, em uma solução de fibrina-trombina ou um hidrogel, de novo por meio de re-hidratação, conforme descrito no passo 1.2.
   NOTA: Este passo pode ser útil quando os compostos ou as células não dão mecanicamente com o material. Pode-se também controlar a dinâmica de libertação dos compostos ..
4. Prepare as malhas titanizada, que serão colocados sob cada andaime em cada grupo experimental e controle, por cortandog pedaços em forma redonda, de aproximadamente 14 mm de diâmetro.
   NOTA: A malha titanizada funciona como uma fronteira física necessária para delimitar o tecido regenerado a partir do leito da ferida.

2. Animais

1. Antes da implementação do modelo apresentado, consultar as leis de proteção aos animais correspondentes e obter a permissão das autoridades locais. Neste trabalho, todos os experimentos foram realizados com camundongos, de acordo com a atual lei de protecção dos animais alemão e aprovado pelo Governo do Distrito da Alta Baviera (Regierung von Oberbayern).
2. Escolha cuidadosamente o animal e tensão. Apesar de se ter estabelecido o modelo de ratos, que podem ser convertidos para outros animais comuns, tais como ratos, coelhos ou porcos.
3. No caso de você estiver trabalhando com animais de pêlo, raspar a parte de trás dos animais antes da implantação dos andaimes.
   NOTA: Este trabalho utiliza ratos de 6 a 8 semanas de idade, com peso corporal entre 20 ge 25 g, no entanto diferentes idades e bpesos ody também pode ser usado.

3 Anestesia

1. Conduzir a operação em condições estéreis. A fim de manter a temperatura normal do corpo do animal, utilizar um tapete de aquecimento.
2. Antes da anestesia por inalação os animais recebem buprenorfina a uma dose de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por via subcutânea a cada 8 horas.
3. Colocar o animal sob anestesia inalação (isoflurano) ou aplicar procedimentos padrões equivalentes. Confirme anestesia ou apertando suavemente os dedos do animal ou através de uma pitada de pele.
4. Para evitar exsiccosis, injectar 0,5 ml de solução salina fisiológica por via subcutânea, no início da operação.

4. Excisão da Pele

1. Colocar o animal em posição prona e marcar a linha média das costas do rato com uma ponta fina caneta permanente (Figura 1A).
2. Definir a área da excisão. Coloque os defeitos na área mostrada na Figure 1C. Note-se que se os defeitos são colocados muito caudal, os animais são mais propensas a remover os curativos e os andaimes.
3. Criar rodada defeitos bilaterais através de um 10 milímetros biópsia (Figura 1B). O perfurador deve ser cuidadosamente forçado contra a pele e não deve ser usada para cortar completamente através da pele, mas para delinear a área de excisão (Figuras 1C e 1E).
4. Delicadamente levante a pele marcada com uma pinça e inciso ao longo do círculo marcado com tesouras cirúrgicas finas (Figura 1F). Em caso de hemorragia, comprimir cuidadosamente com gaze estéril. Uma descrição passo a passo da excisão é mostrado na Figura 1.
   NOTA: O defeito é criado com um perfurador menor do que aquele para gerar os andaimes, para compensar o alargamento do defeito devido à elasticidade da pele.

5. andaime Implantação

1. A fim de abrir espaço para a titazado malha, estender a separação da pele e do tecido subjacente nas fronteiras da ferida para 2-4 mm (Figura 2A).
2. Coloque a titanizada engrenar no defeito directamente no leito da ferida e sob as bordas da ferida (Figuras 2A e B).
3. Coloque andaimes diretamente sobre a malha.
4. Suturar os andaimes para as bordas da ferida adjacente por 4 a 6 nós individuais, deixando os bordos ligeiramente ao longo do esqueleto (Figura 2C).
   NOTA: Evite o uso de suturas biodegradáveis.
5. Suturar uma ferida curativo transparente acima dos defeitos para proteger a armação, enquanto que permite um controlo da área da ferida (Figura 2D).

6 Cuidados Pós-Operatórios

1. Mantenha um rato por gaiola para evitar manipulação mútua do curativo e andaimes.
2. Avaliar o estado geral do animal diariamente pela atividade observando motor, peso do corpo, sinais de dor, tolerânciaao molho e auto-mutilação. Também monitorizar a área da ferida para o sangramento, local e sintomas sistémicos de infecção e a posição do penso.
3. A fim de minimizar a dor do animal, injecta-buprenorfina por dia numa dose de 0.05-0.1 mg / kg de peso corporal ou analgésicos equivalente.
4. Se o rato elimina ou danifica o curativo, substituir ou recolocá-la sob anestesia.

7 Eutanásia e explantes do andaime

1. Em intervalos de tempo desejados, sacrificar os animais por overdose de pentobarbital (150 mg / kg).
2. Marque o local da excisão de pele com um marcador permanente, que deve incluir os andaimes e tanto o mouse de volta pele possível (Figura 3A).
3. Faça uma incisão na pele ao longo das linhas marcadas com uma tesoura ou um bisturi. Retire toda a pele, incluindo os andaimes e malha titanizada, do tecido subjacente através de uma preparação sem corte (Fifigura 3B).
4. Colocar o tecido explantado estendido sobre uma placa de Petri (Figura 3C e D)

8 visualização e quantificação da Rede Vascular

1. Transiluminação:
   1. Configurar um dispositivo transillumination, com a montagem de uma placa de Petri sobre uma forte fonte de luz branca (100 Watt lâmpada padrão).
   2. Corrigir uma câmera digital acima da transilluminator obter fotos digitais.
   3. Colocar as amostras de cabeça para baixo na placa de Petri sobre o dispositivo transillumination.
   4. Tirar fotos dos andaimes completos em modo macro, bem como de áreas de igual tamanho de pele normal. Armazenar as imagens em um formato TIFF, para posterior análise digital.
   5. Salve o tecido para posterior análise bioquímica ou histológica.
2. Segmentação Digital e quantificação:
   1. Baixe e instale o software VesSeg-Tool, que pode ser obtido free de carga em: http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
   2. Abra a imagem com o software VesSeg-Tool.
   3. Selecione a área da imagem coberta pelo andaime para análise digital (Imagem → Select).
   4. Para aumentar o contraste dos vasos use a opção "thresholding histerese" (Imagem → melhoria navio filtro → histerese limiar → Top-Hat transformação → melhoria navio Calcular).
   5. Prossiga com a segmentação do mapa navio (fronteiras Imagem → melhoria navio filtro → histerese limiar → limiar). Selecione o primeiro limiar ("cobertura de navio"), de modo que cada pixel, o que é mesmo remotamente navio-like, serão rotulados como vaso. Selecione o segundo limiar ("cobertura de Fundo"), para que apenas os pixels que são particularmente navio-como vai ser rotulado como vasos.
   6. Confira a proposta de segmentação automática manualmente para adicionar navios não capturados e eliminar estruturas falso-positivos comuns, que geralmente são estruturas longas e finas de navios-like, como cabelos ou suturas.
   7. Calcule o comprimento dos vasos e a área total coberta por navios (estatísticas Imagem → Imagem → estatísticas imagem binária).
      NOTA: Para o cálculo dos comprimentos de navios, navios no mapa navio resultando sejam reduzidas a linhas com uma largura de um pixel ^20.
3. Analisar a área da pele nativa sob os mesmos parâmetros que os andaimes, a atribuição de um valor de 100% para o tecido nativo e relacionar o andaime para esse valor. Por exemplo, se a percentagem de pixels brancos é de 60% no tecido normal e de 30% no andaime, que representaria uma vascularização 50% do andaime. Nota: A cobertura branca vasos é atribuída à área de um quadrado em torno do andaime. Ajuste o número de pixels brancos consi coberturadering que a área do círculo é significativamente menor (π x R ²⁾ do que o quadrado (4 x R ^2).

Resultados

Um defeito da pele completa bilateral de confiança podem ser criados no ratinho (Figura 1), em que a pele pode ser substituído por um biomaterial sob estudo (Figura 2). Aqui, sem grandes complicações são observadas durante ou após o procedimento operatório, nem sinais macroscópicos de infecção ou reação de corpo estranho. Em casos raros, um andaime se perde quando um rato remove-lo. Contracção da ferida não foi observado (Figura 3). Transiluminação teci...

Discussão

Há uma necessidade de se estabelecer abordagens bem sucedidas na melhoria da perfusão sanguínea em engenharia de tecidos construções, o que exige o desenvolvimento de novos métodos confiáveis ​​para estudar os processos de vascularização dentro dos biomateriais. Os métodos mais comuns para fazer andaime vascularização ex vivo disponíveis incluem a utilização de microscopia, que proporciona uma ferramenta de alta-resolução. Na maioria dos casos, no entanto, este método é limitado à análi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture
Biopsy punches (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
Biopsy punches (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
Digital camera	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	Sterile gauze (10 cm x 10 cm)
Double-layer collagen-based scaffold (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	Strain code 088	Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g
Buprenorphine (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	Fibrin-thrombin solution
Transparent adhesive drape (30.5 cm x 26 cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10