啮齿动物附睾精子磷酸分析

摘要

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO₂.

摘要

精子是相当独特的之间的细胞类型。虽然产生于睾丸，既核基因的转录和翻译被关闭一次预光标圆形细胞开始伸长和分化成什么形态识别为精子。然而，精子是很不成熟，没有能力的蠕动或卵子的认可。这两个事件的发生，一旦精子中转称为附睾一二级机构。在〜12天通道，它需要一个精子细胞穿过附睾，现有蛋白质的翻译后修饰发挥细胞的成熟中发挥关键作用。这样的一个主要方面是蛋白质的磷酸化。为了表征磷酸化事件中精子成熟发生，无论纯的精子细胞群和预分馏磷酸的必须建立。使用反冲技术，一种用于纯精子Ò隔离从远端或尾部附睾F高品质和产量概述。的步骤为溶解，消化和预分馏通过TiO ₂的亲和层析精子磷酸肽进行说明。一旦分离，磷酸可注入的MS中的精子的成熟过程，以确定在特定的氨基酸残基都蛋白质磷酸化事件和量化的磷酸发生的水平。

引言

从睾丸已经出现，精子是高度分化又显着，这些细胞是未成熟^1,2。因此，它们缺乏完整的功能，包括游泳的能力，并结合到卵母细胞^3。虽然精子细胞的进一步成熟是必需的，这无法通过典型途径发生，因为在此阶段的细胞分化的过程中，它们是不能的基因转录和进一步蛋白质生物合成^4。生物的能力是赋予精子，因为它们离开睾丸和进入被称为附睾⁵男性生殖系统的一部分。附睾是一个紧密盘绕，高度分化的管连接所述输出小管（睾丸）输精管和存在于所有雄性哺乳动物^6。精子在附睾血统逐步收购其受精能力，依靠不断变化的环境，鲁米那是CR由本地附睾上皮细胞⁷ eated。存在于附睾环境行为的各种分泌和再吸收的活动来修改精子本身，改变它的蛋白质，碳水化合物和脂质组合物^6。附睾的重要性，尤其是最初的“人均”这个结构的地区已经采用手术结扎技术⁸被例证。精子通过传出神经导管结扎睾丸内保留完全缺乏任何身份受精的卵母细胞^9-11。

除了附睾环境内的精子功信号转导通路对翻译后修改现有的精子细胞的补充。例如，从附睾的早期区域精子显示不同的蛋白质磷酸化模式相比，这些后者的区域^5,12。这并不奇怪，因为在C巨大差异apability来自这些地区的精子。例如，精子从早期，附睾头都immotilite。与此相反，精子细胞从马尾区域将经受向前一旦放置在等渗介质渐进运动。由于附睾精子细胞是不能脱从头蛋白质生物合成，所有的固有途径调节精子功能必须通过翻译后修饰（PTM）。因此，按理说，蛋白质组学，特别是翻译后修饰，如磷酸化的调查必须是一个主要的推力，如果我们要了解精子细胞成熟。

另一种方法以从epididymidies获得精子使用复古反冲^13-16。虽然这种技术是肯定比较费时，由操作者需要更大程度的技术人员，对精子获得一致表明纯度超过99.99％。此外，不同于所有其它技术，精子CAN为分离处于静止状态，使得能够研究如何精子活力被启动。样品制备是用于蛋白组学分析中最重要的方面，精子隔离已成为精子蛋白质组学研究中最重要的方面之一。该协议提供了有关如何从精子马尾附睾被隔离的解释。在此之后，在TiO ₂磷酸富集过程概述，关于如何从高度分化的精子细胞中提取的肽的具体参考。该MS的方法可以用来区分改变磷酸如果一个人尾附睾精子在一种状态比较（immotile或非获能）到另一个（能动，获能，顶体反应等）使之成为一个有效的方法来研究的精子功能。

研究方案

1.准备文化传媒和菜名

1. 使200毫升Biggers的惠顿和惠顿^（BWW）17工作溶液中加入5.54克氯化钠，0.356克氯化钾0.25克CaCl _2，0.162克的H ₂ KO ₄ P和0.294克_硫酸镁到1升的Milli-Q水。这是原液并可以保持在4℃最多一个月。
2. 从该原液中，添加_碳酸氢钠的420毫克^- ，200毫克葡萄糖，6毫克丙酮酸钠，600毫克牛血清白蛋白，0.74毫升乳酸钠和4.0毫升HEPES缓冲剂至193毫升BWW股票。这是工作溶液，并在使用前一直制作新鲜的当天和平衡至37℃。
3. 使插管，取聚乙烯（PE）管具有0.4mm的内径和1.1毫米的外径和保持在一个较低的热（通常为甲醇火焰）使得所述管开始熔化。立即拉管线outwARD伸展，使外径窄。
4. 切割以产生一个端其允许输精管容易插管变窄。
5. 切插管的另一端至约15公分。插入地下30针插入钝端，并附加3毫升注射器将其（完全缩回）。
6. 通过削减PE管（4.2毫米的直径，6.4 mm外径）的20厘米长做吸喉舌。插入一个喉舌成一端。
7. 插入微毛细管玻璃管保持器和玻璃微毛细管本身（一般为3微升为小鼠，40微升为一大鼠）。

从鼠标2.去除附睾

1. 根据具体到每个机构IACUC批准的安乐死程序老鼠。
2. 取的动物，使一个小切口在阴囊以暴露附睾。拉睾丸和附睾出使用一对钟表＃5镊子的空腔。
3. 切输精管，使得至少1-2厘米保持连接到马尾附睾。此外，切断近端输出小管和组织连接到附睾睾丸和删除整个男性生殖轨道。
4. 将解剖显微镜的放大倍数范围5-40X的秩序下，整个男性生殖轨道。

3. Cannulating附睾

1. 胶带向下插管到显微镜，使得1-2厘米的变窄（圆锥形）的端部是自由和可见光通过透镜。
2. 采取一对钟表＃5镊子轻轻扣着输精管每一侧并拔出输精管到套管，使得所述套管进入输精管。
3. 采取非吸收性的黑色编织丝绸处理（尺寸5-0）的长度和领带绕空心输精管结。确保结紧紧地按住输精管内插管时，气压FR嗡注射器被应用。

4.逆行或骶管附睾精子的反冲

1. 使用制表大师＃5镊子，抢马尾附睾的远端，并删除白膜，以公开一个附睾小管。
2. 使用镊子，轻轻一拉小管暴露出来，然后逗开以创造一个开放的精子被释放。
3. 轻轻地推上3毫升（小鼠）或20毫升（鼠）注射器，以便排出空气从注射器进输精管。在适当的压力下，精子将开始慢慢出来破碎条状细管的马尾附睾的前端。此时，施加吸力到吸嘴吸取精子放入玻璃毛细管。注意：通常在小鼠，2-3微升精子可以根据动物的年龄而获得。一只老鼠的意志，平均产量30-40微升。

5.洗涤和裂解的精子为蛋白质组学准备

1. 通过轻轻地吹对着话筒或附加一个注射器和排出空气，以便将精子推回出毛细管的排出从玻璃毛细管精子进入BWW溶液1 ml溶液（37℃）。
2. 一旦精子细胞扩散，洗3次（300×g离心，5分钟）用1ml BWW以除去污染性蛋白。最后一次洗涤后，除去上清液。注意：在这一点上，精子细胞可以冷冻供以后使用。
3. 增溶用4％CHAPS，2M硫脲，和50mM的Tris，pH 7.4中的蛋白质1小时，间歇漩涡。
4. 裂解细胞，离心（10,000×g离心，20分钟）后，取上清液并转移到新的管中。注意：在这一点上，蛋白质定量可以执行。

6.二硫键还原和烷基化

1. 添加10mM的DTT作为最终浓度以裂解蛋白质，vort前和在室温下孵育30分钟。
2. 添加50毫idodoacetamide作为最终浓度以裂解物，涡旋并在室温下孵育在黑暗中30分钟。

7.降水

1. 甲醇氯仿沉淀样品中加入1体积裂解物（400微升作为一个例子），加入甲醇1体积（400微升）和0.5体积（200微升）氯仿。
2. 涡旋样品和自旋（10,000 xg离心，2分钟）。
3. 需要注意的是两个阶段会出现以下离心。丢弃顶层（注意不要打扰接口）的所有，但为2 mm。
4. 加入1倍体积的甲醇中（400微升），转化管轻轻1-2x混合并再次旋转（10,000×g离心，15分钟）。弃上清浪费和空气干燥颗粒为3-4分钟。

8.胰酶消化

1. 重组胰蛋白酶在25mM碳酸氢铵含1M尿素的50：1的比例（w / w;蛋白：胰蛋白酶）并孵育OVErnight在37℃下优选在700rpm在一个恒温。
2. 自旋（10,000×g离心，15分钟）以沉淀未消化的材料。转移上清液至新管中。

9.磷酸化肽富集

1. 从胰蛋白酶进行纯化和磷酸富集消化如前所述^18。稀释的胰蛋白酶肽10倍于DHB缓冲液[DHB缓冲器组成：350毫克/毫升2,5- dihydrobenzesulfonic苯甲酸（DHB），80％（体积/体积）ACN（乙腈），2％（V / V）TFA（三氟酸）]，并适用于干燥_二氧化钛珠（200微克）。
2. 留在旋转器上在室温下搅拌1小时。
3. 洗DHB缓冲区样本，旋转和上清。然后洗样品三次，洗涤缓冲液[80％ACN（V / V），2％TFA（V / V）]，除去DHB。
4. 在最后的旋转后，直接加入25微升2.5％的氢氧化铵，pH值≥10.5溶液洗脱使用洗脱缓冲液的磷酸。 S针，去除上清。立即用中和0.3〜微升甲酸。

结果

从任何蛋白质组学分析的结果的质量在很大程度上依赖于起始原料。随着现代MS，在样品制备轻微污染很容易回升。因此，重要的是，在精细胞蛋白质组学的情况下，选择一种方法，使高纯度的精子。如示于图1中 ，逆行反吹用于从马尾附睾检索精子细胞。这涉及cannulating输精管用PE管材，它允许一个缓慢申请气压从连接注射器。 图1A展示马尾附睾与输精管。 图1B是密切如何输精管绑起来拍哪里插管被插入。在这样做的，因此，精子释放从尾附睾1细管的端部切下。 如图2A所示 ，精子从caud的顶点区域提取一个附睾和被吸入到处于静止状态（ 图2B）的玻璃毛细管。这具有比传统的“游式”的方法，而不是其中的是前和运动的激活后执行精子的phoshoproteomic分析的能力的几个优点。精子可以被驱逐到自己选择的媒体上。 图2C（左侧）演示了如何精子驱逐到BWW媒体后，立即寻找。许多细胞被成群在一起。然而，该细胞的10分钟后的能力证明，因为它们游出至均一到溶液中（ 图2C，右手边的细胞）。由于反冲技术对精子细胞的影响非常小，我们得到接近100％的蠕动，将细胞分散迅速进入媒体没有外部挑衅。在一个典型的反冲实验，精子恢复从瑞士包含鼠标1-5之间×10 ⁶个细胞。这是高度依赖于动物的年龄，并且可以从小鼠的不同菌株而异。在挪威鼠，我们通常得200×10 ⁶个精子，±20％。 图2D表示精子从大鼠马尾附睾中得到的纯度。

除了样品本身，关于试样制备的主要问题之一是胰蛋白酶消化的产率。蛋白质沉淀起着重要的作用，不仅在去除不需要的洗涤剂和盐，这两者都是与MS不相容，而且在变性蛋白质。我们已经发现甲醇 - 氯仿沉淀效果最好。不仅这一程序被报道以沉淀低丰度蛋白比其它包括TCA沉淀¹⁹更好，但它有另外的优点。以下TCA沉淀，通常有必要中止TCA沉淀的可保持相当后，调整pH值酸性。虽然三氯乙酸沉淀的沉淀可洗在高的有机溶液，以除去酸，这增加了样品处理和结果的不可再现。失败，以中和酸会导致不良的胰蛋白酶肽的产率。甲醇-氯仿沉淀，不仅快速，但不会酸化的样品。 图3示出了蛋白质沉淀典型地从100微克的下部和上部间期间样品的观察。

磷酸肽的分离可发生在许多方面;然而重复性取决于该样本已处理直至并包括这个阶段。一种更常见的，显影方法是_二氧化钛，最初是由该组马丁拉森^18,20,21的开发。虽然被描述为一个过程，微柱的使用，我们可以使用批处理色谱获得可再现的数据。该进程的成功在很大程度上依赖于洗脱缓冲，这一定是疯了 Ë用正确的成分;否则磷酸不洗脱的。

协议和有代表性的数据从TiO ₂的再现性富集从马尾附睾精子磷酸在非能动（ 图4上）和能动（ 图4下）从米状态/ Z 650-670可以看出。我们已经证明，这是一个使用生物学重复¹⁷即使极可重现的技术。蓝色条纹出现随着时间的推移是肽从C18纳米柱作为乙腈的浓度增加洗脱。显然，在能动人群（n = 3中所示，每组8典型地运行），有一个肽簇，与周围的651.5沓范围内的单一同位素质量是在非能动范围完全不存在。串联质谱然后用于鉴定该肽。

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图1：马尾附睾插管（A）图片马尾附睾。插管本身被录音下来以暴露预拉端的大约1-2厘米。这是用细＃5watchmakers钳插入输精管。（B）的套管到位绑细丝线绕含输精管和套管两种段举行。从小鼠，约2-3微升尾椎附睾细胞和流体被收集在1×10 ⁶个/μl的浓度。从大鼠（示出），大约30-40微升的流体都在相似的浓度获得的。

图2：用于收集主管附睾精子玻璃毛细管。 （A）从马尾e的顶点一小管 pididymis是孤立和破碎。近似位置从这种情况被示出。（B）中的图像的顶部示出了一个空的玻璃毛细管和底部示出了一个从先前反冲老鼠。不存在血液污染和最小的上皮细胞污染。（C）由于精子仍然未稀释的附睾液，他们还没有开始启动。当精子最初排出到BWW溶液，他们出来作为一个紧凑“串”（左手侧）。细胞的能力是很容易确定的，因为在10分钟后大部分精子游进而没有任何外部干扰（右手侧）溶液中。（D）的尾部附睾细胞的等分试样的图像，他们已经离开后，立即向游出表明该细胞的纯度。

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图3：甲醇-氯仿沉淀一旦精子已溶解时，可溶组分是甲醇-氯仿沉淀，以确保蛋白质和去除污染物质的变性。蛋白质沉淀出现的甲醇/水和氯仿相之间的界面上。顶层被小心去除，以便不打扰此粒料。是很常见的离开大约2-3毫米的上层相的，以便无蛋白质丢失。

图4：典型的TiO ₂富集的磷酸信息使用所描述的协议中，尾附睾精子中分离在任一immotile（顶部，N = 3）或能动状态（底部，N = 3）。随着〜651.5 D中单同位素质量肽集群一个被示出为存在于能动种群但完全不存在在immotile那些（箭头）。这种性质的比较是被称为“无标记（基于MS）”。肽质量和保留时间，然后用于靶向用于串联质谱的化合物，并确定从其中衍生的肽的蛋白质。

讨论

对于精子的一个成功的和可重复的蛋白质组分析的关键步骤是：1）纯度的原料; 2）去除多余的盐和洗涤剂; 3）变性蛋白，以它们的全部范围，以使胰蛋白酶消化高收率蛋白和4）最小化的处理，以减少肽的损失样品。

为了成功地反冲马尾附睾，有必要确定从精子将退出区域。在大鼠和小鼠中的情况下，这是在所述凹区域的顶点，在附睾的尾部区域的中间（参见图2A）。如果有进一步的来向输精管，反冲更容易，成功率一般较高。然而，这是以精子数的损失。可替代地，如果一个人试图移动至更近侧到语料库，那么压力的量所需的精子推回通过epididym人管往往是如此之高，是破坏附睾不可避免地发生。

传统上执行使用水饱和的矿物油和作为介质在注射器本身平衡盐溶液以除去精子^22-25附睾的反冲。这两个程序都是潜在的问题LC-MS的。首先，矿物很可能会阻止必须采取这样没有结转过程中的纳米C18纳米列基本上都是采用的全球蛋白质组学分析和护理。如果发生这种情况，就不可能继续并将样品实质上丢失。这可以通过使用BWW或在注射器的其他平衡盐溶液，然而来克服，这虽然是成功的，我们很快认识到，许多所述精子成为能动只要BWW溶液开始接触，并与尾附睾混合细胞。为了解决这个问题，我们简单地反冲与空气的精子。不仅是资格赛精子两者均媲美的基于液体的方法，但该数量是相同的。

磷酸化蛋白质组学也许是确定哪些信号通路是发生在精子后射精的唯一途径之一。一个我们正在调查的主要途径是获能的过程。精子必须经过“获能”才能够结合到一个鸡蛋。在实践中，这是通过孵育精子一段时间基本实现（;大鼠1.5小时;小鼠40分钟人类3-24小时）与血清白蛋白BWW溶液。以前，我们和其他人已经表明对参与获能几个激酶的作用。兴趣的，缺失的PKA的μII产生的小鼠的精子游动自发体外 ，但不能经受过度活化^26。后者是获能的标志，由此精子改变其泳图案从高速，低幅度，以一低速度，高振幅摆动频率。我们已经表明参与这一过程的下游激酶包括PP60-中国证监会^{（SRC）13,27} C-是²⁸和C-ABL ^14。有趣的是，抑制SRC的停止获能依赖的酪氨酸磷酸化^13。然而，这可以用冈田酸来克服，这表明SRC不直接参与在一般性发病酪氨酸磷酸²⁹的，但可以调节磷酸酶^29。使用BWW作为介质，迫使精子出附睾的问题是，一旦被激活，小鼠精子只需要大约40分钟，以与能力。鉴于精子隔离可能需要5分钟/小鼠和常数小鼠在实验中使用，那么精子将到期的在实验开始时的不同阶段。为了克服这个，空气压力可用于从尾附睾精子推入玻璃套管。不仅所有的精子INACT香港专业教育学院和基本上如它们将在尾环境中找到，它使得有可能比较非能动和能动磷酸化蛋白质组学。

样品处理对于磷酸化蛋白质组学应在两个不同的功能状态进行比较的精子时被保持在最低限度。以上蛋白质沉淀1）的其他传统方法使用甲醇氯仿降低需要额外的洗涤步骤，2）去除盐和脂肪的几乎所有痕量和3）具有经过验证的能力超过TCA ¹⁹以沉淀低丰度的蛋白质。前胰蛋白酶消化的蛋白质沉淀，建议因为这不仅有助于变性蛋白（其有助于胰蛋白酶消化），但除去许多在MS-不相容代谢产物存在于细胞内的。

精子磷酸的比较可以以多种方式来完成。在基层，所识别的磷酸肽的一个样本的简单比较，以在另一在被称为“谱计数”的过程中采样可以做到的。但是批评一直处于这种方法主要是因为早期的蛋白质组学研究用低重复（对于更详细的讨论参见Lundren 等 ^30）。一个更复杂的方法是看该肽母体质量的强度，并与其它样品（无标记的比较）进行比较。在图4所示的例子中，肽不存在于来自非能动（ 图4上部），但目前在游动（ 图4下）精子从M / Z 650-670可以看出。这个过程中，被称为基于MS的标签免费量化是一个无标记的战略。

常用来降低所需蛋白质的定量运行的量的另一种策略是使用同位素。作为同位素的质量是不同的，质谱仪可以用来比较ELUT的强度荷兰国际集团肽。然而，与大多数其它细胞类型，某些同位素标记不能适用于精子。例如，通过添加稳定同位素（1重同位素被添加到一个样品，而较轻的版本被添加到另一个）可在组织培养物中使用。当同位素得到并入蛋白，蛋白组学分析可以通过组合两个样品（复用）进行。然而，在精子的情况下，这不能做，仅仅凭借的一个事实，即1）同位素标记需要几个通道（最多8个）在组织培养和2）的精子细胞不具有核基因的转录和翻译，因此，他们不能纳入同位素其所有的蛋白质而已。解决这个的一种方式是订购放射性标记的小鼠，但是，这些是众所周知的昂贵。另一种方法是使用一种化学标记。当非获能小鼠用获能的小鼠相比，这已经完成。在这种情况下，A D ₀以及D _{3 -label用一个样品和另一个在质谱仪³¹之间进行区分。其他方法可以包括使用的iTRAQ（等压标记相对和绝对定量），由此赖氨酸被化学不同质量同位素标记的; ICAT（同位素编码的亲和标签），由此半胱氨酸标记有不同质量的同位素和重链和轻水标记。}

在每一个情况，但是，有一点必须牢记。该MS仅报告什么是存在于样品中，而这是发生在该样品到这一点，一切的反映。最小化的样品处理，同时最大限度地提高产量在每一步是必要的一个成功的蛋白质组学分析。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-Dihydroxy-1,4-benzoquinone	Aldrich	195464
2-D Quantitation Kit	VWR (GE Healthcare)	80-6483-56
Albumin from bovine serum	Sigma	A7030
Ammonia solution 25%	Merck	1.05432
Ammonium bicarbonate	Sigma	A6141
Calcium chloride	Sigma	C5080
CHAPS 3-[3-(cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate	Research Organics	1300C
Chloroform	BDH	10077.6B
Disodium hydrogen phosphate	Merck	1.06580
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779
Formic acid	Sigma	O6440
Glucose	Sigma	G6152
Glutamine-L	Sigma	G7513
Hepes (free acid)	Sigma	H3375
Iodoacetic acid free acid	Sigma	I4386
Lactic acid	Sigma	L1750
Magnesium chloride	Res. Org.	0090M
Methanol	Merck	10158.6B
Percoll (sterile)	VWR (GE Healthcare)	GEHE17-0891-01
Phosphatase Inhibitor Cocktail Halt	ThermoFisher Scientific (Pierce)	PIE78420
Potassium chloride	Sigma	P9333
Potassium hydrogen carbonate	Medical Store	CH 600
Sodium bicarbonate	Sigma	S3817
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium dihydrogen phosphate	Merck	1.06346
Sodium hydrogen carbonate	BDH	10247.4V
Sodium pyruvate	Sigma	S8636
Tris, ultra pure grade	Amresco (Astral)	AM0497
Trypsin Gold, mass spec grade	Promega	V5280
Urea	Sigma	U5128
Zinc chloride	Sigma	Z0173
0.4 mm Polyethylene tubing	Goodfellow	ET317100
30 G needle	Terumo	NN2038R
3 ml Syringe	Terumo	SS035
4.2 mm Polyethylene tubing	Goodfellow	ET317640
Braided silk (5-0)	Dynek	CSS0100
Trichloroacetic acid	Sigma	299537
TiO2 beads (from disassembled column)	Titansphere	6HT68003
Eppendorf Tube	Eppendorf	22431081
C7B30	Sigma	C0856