指南<em&gt;在体内</em&gt;单单元从Optogenetically鉴定皮质抑制性录像

摘要

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

摘要

在神经生理学的一个主要挑战是在大脑皮质中表征的许多抑制性细胞类型的响应特性和功能。 在这里，我们分享我们的战略得到稳定的，良好的分离鉴定，从抑制性的单单元记录在麻醉的小鼠皮层利用利马和他的同事开发出¹的方法。录音小鼠在特定的神经元亚群表达Channelrhodopsin-2（的ChR2）上进行。该群体的成员是通过它们的响应于蓝光的短暂闪光。这种技术 - 被称为"PINP"，或神经元群体的光刺激辅助识别 - 可以与标准的细胞外记录设备来实现。它可以作为一种廉价的和可替代的钙成像或目视制导修补，用于靶向细胞外记录到确定的转基因细胞中的用途。 ħERE我们提供了一套指引，以优化在日常实践中的方法。我们具体地细化我们的策略用于靶向小清蛋白阳性（PV +）细胞，但已经发现，它适用于其它中间神经元的类型，以及，如促生长素抑制素表达（SOM +）和钙网膜蛋白表达（CR +）的interneurons。

引言

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors^2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue.

Recently, Lima and colleagues¹ developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed “PINP” – or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.

In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons⁴. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits^5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

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研究方案

注:以下协议是按照卫生指引的国家机构批准的俄勒冈州动物护理和使用委员会的大学。

1.急性手术

1. 麻醉用氯胺酮-美托咪定鸡尾酒的动物，通过腹膜内（IP）的注射剂（ 表1）。
   注意:在这些实验中使用的小鼠，通过杂交的依赖于Cre的ChR2-EYFP转基因line10到中间神经元驱动线（; SST-iCre12，SOM +;铬iCre12，CR + Pvalb-iCre11，PV +）生成的。病毒递送的ChR2或相关视蛋白的应该同样有效，假设类似的表达水平得到。
2. 在开始手术，确保动物展品温柔的脚趾捏没有反应。整个实验过程中重新施用麻醉剂按需要保持此深度麻醉。如果使用注射麻醉剂，可选择植入一个IP导管维护注射。
3. 保持水合用生理盐水或乳酸林格氏通过使用适当稀释的麻醉剂鸡尾酒进行维护注射剂（ 表1）在整个试验溶液（大约3毫升/千克/小时），例如动物。
4. 将动物在一个立体或其他头部保持装置。确保头骨是安全性很高。这是为维持稳定的单细胞记录必不可少的。
5. 适用opthalamic软膏的眼睛，防止干涩。保持体温在36.5-37℃。
6. 进行脑池排水的追加记录的稳定性。使用手术刀刀片，从头盖骨的后表面除去组织以暴露小脑延髓池。做一个小切口，在硬脑膜漏脑脊液。使用刀片的唯一的最前端，并避免接触小脑或脑干。
7. 使用手术刀，执行一个小开颅手术（〜2 mm ²的）在感兴趣的皮层区域（听觉皮层，大约-2.3毫米后前囟的，中线为4.5mm横向）。
8. 去除硬脑膜和覆盖暴露的皮层有一层暖琼脂糖0.5 - 1毫米厚（1.5％琼脂糖中的盐水，0.9％的NaCl;适用于〜37℃）。保持整个实验的琼脂糖湿润通过周期性地施加几滴盐水。

2.录像设置

1. 准备钨电极（7-14MΩ，127微米直径，12°锥尖，环氧涂层）。强力胶将电极在玻璃毛细管中，并添加热缩管为把手（ 图1）。
2. 安装在电动（或液压）显微电极，设置在旅游垂直于皮质表面。滑动线接地的皮肤下，对颅骨。避免与在头部的侧面和颈背部的肌肉接触，因为它们可以产生肌电工件。
3. 放大使用的细胞外安培的电信号适合于单细胞记录里音响器，优选配备一个阻抗检查模式。监控正在进行的扣球活动（带通300 - 5000赫兹）有两个示波器和一组有源音箱。这里，所记录的数据以10kHz的采样速率连续地进行数字化;尖峰离线提取。
4. 通过琼脂糖推进电极直到前端到达皮层的表面上。注意这一步通过显微镜。 "零"的显微这个位置。
5. 到最佳近似记录的深度，在视觉上确认，在一个渗透的末端抽出电极时电极尖端退出皮质表面处的深度为零。
   注:操纵器读取和观察到的电极位置之间的差异表明它已漂移相对于组织。这可以通过脑或动物，或操纵漂移的不稳定性引起的。
   1. 作为一个额外的检查，以确保这个零设定点对应于皮层的表面上，监视刺激诱发电位而穿过组织的第一几百微米前进。当监测场电位，降低细胞外放大器的低带通滤波器的截止到10赫兹。确认该局部场电位的极性反转周围的〜100μm的深度，该层I / II型边界¹³附近。这是为听觉皮层可靠的参考点，但是它可能不同其它皮层区。
6. 安装的光纤耦合到蓝色光源（ 图2）上的手动微操纵。使用显微镜，定位纤维尽量靠近琼脂糖尽可能的表面的前端。居中光束在电极将进入组织。
7. 调节光源的具有能够提供一个TTL指定的宽度和所需时间的（晶体管 - 晶体管逻辑）脉冲串的一个控制单元的输出正如一个Arduino（ 图3），一台计算机的I / O卡（如图所示），或市售的脉冲发生器。
   1. 监测两个示波器的信号。
8. 测量总的光功率（mW）在光纤使用功率计的前端。使用此值由纤维芯的横截面面积除以计算照度（毫瓦/毫米^2）。首先在10的范围内的强度值- 15毫瓦/毫米^2，如果需要向下调整，直到工件被消除。
9. 检查光文物在琼脂糖电极，准备进入组织。开始搜索的脉冲串（ 例如，30毫秒的光脉冲，500毫秒刺激间隔（ISI））。
   1. 消除瞬态光构件（ 图4），通过重新定位纤维相对于电极的光来改变入射光的角度。如果文物仍然存在，请尝试降低光功率。在日Ë极少数情况下的工件不能被完全消除（仅最小化），扩展搜索脉冲的持续时间。这可以识别真正的神经尖峰帮助。

3.直PINP式"

1. 通过大脑推进电极慢慢在约1微米/秒的速率。使用一个示波器监测正在进行的活动。另一方面，触发激光脉冲。
2. 监听的光诱发尖峰音频监视器上的微弱"散列"，这表明该电极接近的ChR2 +细胞和经常可以感知的电信号是在示波器上明显好之前。放慢前进的速度。
   注意:如果该小区直接处于所述电极的路径，光诱发活动将变得更大（响）。作为电极接近单个中间神经元，散列将解析成均匀的尺寸和形状的小而良好定义的峰值。
3. 当李向右诱发尖峰大到足以触发单独的示波器，开始这样做。调整在水平轴的缩放来观察尖峰的波形的精确形状。
4. 停止并等待组织来解决。抵制诱惑，将电极靠近细胞。本步骤是稳定的记录是至关重要的。如果几分钟之后的信号 - 噪声比并没有得到改善 - 即，组织已经解决，但它并没有使电池的任何靠近电极的前端 - 提前5微米还并再次等待。
   1. 重复这个过程，直到该峰或动作电位的槽能够可靠地捕获与设置远高于本底噪声（ 例如，+ 300μV或更大）的电压阈值。
      注意:有样品瓶抑制性时的误报或不明确的风险很小。大多数细胞可以很容易地跟随脉冲序列具有30毫秒的持续时间和间普勒本质上间隔500毫秒或更快，具有2-5毫秒（ 图5）的可靠第一穗延迟。多数光伏+细胞，尤其是能够维持烧成整整1秒（ 图6）。因为这些都是抑制性神经元，disynaptic（间接）激活是不是一个大问题。
5. 在录音时，显示屏上的第一个示波器正在进行的活动。保持的尺寸以及使用所述第二示波器尖峰形状密切关注。注意其对扬声器的声音质量。
   1. 倾听的突然变化，这表明该细胞要么是画得太靠近电极（它有可能被刺穿或损坏），或者是渐行渐远。如果尖峰变大和变形，退了出去;如果他们变得更小，推进电极。缓慢移动的2微米的步骤。
   2. 通过叠加所有尖峰的波形相一致的峰值或波谷确认记录事后的质量。改变电压THRES按住。在很宽的范围内的阈值的，应该永远只能是均匀的高度（ 图5a）中的一个一致的尖峰形状。
6. 如果在任何点上的信号变成与尖峰从相邻的神经元受到污染，继续前进。前进很慢，就断开的机会，该电极将传递出的相邻小区的范围内，但留在目标神经元的范围。 （这通常是不成功的。）
7. 通过皮层（900+微米）在各渗透的整个深度移动电极。如果没有光敏感的神经元被许多穿透，或者反过来，录音污染定期与邻国-CHR 2 - 细胞峰值后出现，尝试一种新的电极。
   注意:即使在同一个批次，各电极的阻抗和尖几何形状也有很大差别。这两个因素导致了有效的"侦听半径"的电极，其必须足够大，以检测光诱发尖峰的wh搜索ILE，但限于足以使记录孤立的单一中间神经元。
8. 如所希望的测试电极的阻抗。为了避免损坏组织，这样与所述电极中的琼脂糖层的上部的前端，以及外面的大脑。内含有7-14MΩ的范围内，确切的阻抗不是性能，或者收率肯定预测，对于这种应用。这就是说，它是听半径的合理代理:低阻抗电极拿起更多的单位;较高的阻抗，更少。
9. 在实验结束时，安乐死的动物通过体制认可的方法，例如麻醉剂过量，或麻醉下的深平面颈脱位。

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结果

在这里，我们分享我们的战略得到单单元录音来自遗传，分类抑制性的麻醉小鼠皮层，利用，利马等^[1]。 表1详细建议的麻醉剂鸡尾酒，氯胺酮美托咪定，乙酰丙嗪（开发的光遗传学方法"密匙"）。 图1示出了钨微电极，用于记录制备。 图2中包含的电路图一个简单的LED控制单元; 图3包含配置和代码为选通光输出与一个Arduino微...

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讨论

虽然PINP是从概念上简单的，也可以是在实践中具有挑战性。成功的一个主要因素是电极的选择。电气听音半径是关键的参数。它必须足够大，以检测光诱发尖峰时的前端还有一段距离远离的ChR2 +细胞，这样就可以相应地调整前进的速度。同时，它必须被限制，足以使良好的单单元隔离。也就是说，电极不能同时拾取尖峰来自相邻-CHR 2 - 单元。达成适当的平衡，听力半径而言将是任何靶细胞类型?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)	FST	10066-15
Surgical Scissors	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment	Foster & Smith	9N-76855
Homeothermic Blanket	Harvard Apparatus	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing	Warner Instruments	G150TF-3
Heat Shrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Use with standard Super Glue.
Microelectrode AC Amplifier 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorized Micromanipulator	Sutter	MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes	Tektronix	TDS2000C
Powered Speakers	Harman	Model JBL Duet
Manual Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Power Meter	ThorLabs	PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND