מדריך ל<em&gt; בשנת vivo</em&gt; הקלטה חד-יחידה מקליפת המוח המעכבת interneurons המזוהות Optogenetically

Summary

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Abstract

אתגר גדול בנוירופיזיולוגיה היה לאפיין את מאפייני התגובה ותפקוד של סוגים הרבים של תאים מעכבים בקליפת המוח. אנחנו כאן לשתף את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יציבה, מבודדות היטב יחידה אחת מinterneurons המעכבת שזוהתה בקליפת מוח העכבר הרדים בשיטה שפותחה על ידי לימה ^ו1 עמיתים. הקלטות מבוצעות בעכברים המבטאים Channelrhodopsin-2 (ChR2) בתת אוכלוסיות עצביות ספציפיות. בני האוכלוסייה מזוהים בתגובתם להבזק קצר של אור הכחול. טכניקה זו - המכונה "PINP", או זיהוי סייע-photostimulation של אוכלוסיות נוירונים - יכולה להיות מיושמת עם ציוד הקלטה תאי סטנדרטי. זה יכול לשמש חלופה זולה ונגישה להדמית סידן או תיקון חזותי מודרך, לשם מיקוד הקלטות תאית לתאים גנטיים מזוהים. Here אנו מספקים סדרה של הנחיות לייעול השיטה בפרקטיקה יומיומית. אנו מעודנים האסטרטגיה שלנו באופן ספציפי למיקוד תאי parvalbumin-חיובי (+ PV), אבל מצאנו שזה גם עובד עבור סוגים אחרים interneuron, כגון (SOM +) להביע סומטוסטטין וinterneurons להביע calretinin (CR +).

Introduction

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors^2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue.

Recently, Lima and colleagues¹ developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed “PINP” – or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.

In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons⁴. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits^5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא הוא בהתאם למכונים הלאומי לבריאות הנחיות כפי שאושר על ידי אוניברסיטת הטיפול בבעלי חיים אורגון ועדת שימוש.

1. ניתוח חריף

1. להרדים את החיה עם קוקטייל קטמין-medetomidine, באמצעות הזרקת intraperitoneal (IP) (טבלת 1).
   הערה: העכברים משמשים בניסויים אלה נוצרים על ידי חציית line10 המהונדס cre תלוי ChR2-EYFP לinterneuron קווי נהג (Pvalb-iCre11, PV +; SST-iCre12, + SOM; Cr-iCre12, CR +). משלוח ויראלי של ChR2 או opsins קשור צריך לעבוד באותה מידה, בהנחת רמות ביטוי דומות מתקבלות.
2. לפני תחילת ניתוח, להבטיח שמצגי שהחיה לא בתגובת קמצוץ הבוהן עדינה. -לנהל מחדש הרדמה לאורך הניסוי כנדרש בכדי לשמור על עומק זה של הרדמה. אם אתם משתמשים בחומרי הרדמה בזריקות, לחלופין להשתיל צנתר IP לזריקות תחזוקה.
3. לשמור על בעלי החיים התייבשות עם מי מלח או תמיסת רינגר לקטט לאורך כל הניסוי (מיליליטר כ 3 / קילוגרם / שעה), לדוגמא על ידי שימוש בקוקטייל הרדמה מדולל כראוי לזריקות תחזוקה (טבלה 1).
4. מניחים את החיה במנגנון הראש-אחזקת stereotaxic או אחר. ודא שהגולגולת היא מאובטחת היטב. זה חיוני לשמירת הקלטות תא בודדות יציבה.
5. החל המשחה opthalamic לעיניים למניעת יובש. לשמור על טמפרטורת גוף ב36.5-37 ° C.
6. לבצע ניקוז cisternal ליציבות הקלטה נוספת. באמצעות להב סכין מנתחים, הסרת רקמה מן הפנים האחוריים של הגולגולת כדי לחשוף את Magna Cisterna. הפוך ניק קטן בדורה כדי לנקז את נוזל המוח והשדרה. השתמש בקצה מאוד של הלהב, ולהימנע מיצירת קשר עם גזע המוח הקטן או במוח.
7. שימוש באזמל, לבצע פתיחת גולגולת קטנה (~ 2 מ"מ ²⁾ מעל האזור בקליפת המוח של עניין (לשמיעהקליפת מוח, בערך -2.3 מ"מ אחורי של גבחת, 4.5 רוחב מ"מ של קו האמצע).
8. הסר את הדורה ולכסות את הקליפה נחשפה בשכבה של agarose החם 0.5-1 מ"מ עובי (agarose 1.5% בתמיסת מלח, 0.9% NaCl; להחיל ב ~ 37 ° C). שמור לח agarose לאורך כל הניסוי על ידי מעת לעת יישום כמה טיפות של תמיסת מלח.

2. הקלטת סט-אפ

1. הכן אלקטרודה טונגסטן (7-14 MΩ, 127 מיקרומטר קוטר, 12 ° קצה מחודד, מצופה אפוקסי-). דבק מגע אלקטרודה לצינור זכוכית נימים ולהוסיף צינורות חום להתכווץ לאחיזה (איור 1).
2. הר אלקטרודה על micromanipulator ממונע (או הידראולי), להגדיר לנסוע מאונך למשטח קליפת המוח. להחליק קרקע חוט מתחת לעור, על הגולגולת. יש להימנע ממגע עם השרירים בצד של הראש והעורף כפי שהם יכולים ליצור חפצי electromyographic.
3. להגביר את האות החשמלית באמצעות מגבר תאיאה בדיוני li מתאים להקלטת יחידה אחת, מצויד רצוי עם מצב בדיקת עכבה. לעקוב אחר פעילות שוטפת spiking (מעבירי פס תדרים 300 - 5,000 הרץ) עם שני אוסצילוסקופ ומערכת של רמקולים מוגברים. כאן, הנתונים שנרשמו הוא דיגיטציה ברציפות בקצב דגימה של 10 kHz; קוצים מופקים מחובר.
4. לקדם את האלקטרודה באמצעות agarose עד הקצה מגיע לפני השטח של קליפת המוח. שים לב שלב זה דרך מיקרוסקופ. "אפס" עמדה זו על micromanipulator.
5. כקירוב לעומק של הקלטה הטובה ביותר, חזותי לאשר שהקצה האלקטרודה יוצא משטח קליפת המוח בעומק של אפס בעת משיכת האלקטרודה בסוף החדירה.
   הערה: פער בין קריאת מניפולטור ואת המיקום האלקטרודה נצפה מצביעה על כך שהוא נסחף ביחס לרקמה. זה יכול להיגרם על ידי חוסר יציבות של המוח או של בעל חיים, או להיסחף מניפולטור.
   1. כבדיקה נוספת, כדי לוודא שאפס הגדרת נקודה זו תואמת את פני השטח של קליפת המוח, לפקח פוטנציאלים בתחום עורר גירוי תוך קידום דרך כמה מאה מיקרומטרים הראשונים של רקמה. כאשר ניטור פוטנציאל בתחום, להוריד את הפסקת מסנן להקה עוברת התחתונה של המגבר תאי עד 10 הרץ. ודא שהקוטביות של פוטנציאל השדה המקומי הופכת סביב עומק של ~ 100 מיקרומטר, ליד שכבת גבול I / II ^13. זוהי נקודת התייחסות אמינה לשמיעת קליפה, אבל זה יכול להיות שונה לאזורים בקליפת המוח אחרים.
6. הר סיבים אופטיים מצמידים את מקור אור כחול (איור 2) על micromanipulator ידני. שימוש במיקרוסקופ, מקם את קצה הסיב הקרוב אל פני השטח של agarose ככל האפשר. מרכז את הקרן שבה אלקטרודה תיכנס לרקמה.
7. להסדיר את הפלט של מקור האור עם יחידת בקרה מסוגלת לספק TTL (היגיון טרנזיסטור-טרנזיסטור) רכבת דופק של רוחב וduratio צויןn- למשל, Arduino (איור 3), כרטיס שהמחשב / O (כפי שמוצג), או מחולל את דופק זמין מסחרי.
   1. לפקח על האות בשני אוסצילוסקופ.
8. מדידת כוח מוחלט אור (mW) בקצו של הסיב האופטי באמצעות מד כוח. השתמש בערך זה כדי לחשב irradiance (mW / מ"מ ²⁾ על ידי החלוקה בשטח החתך של ליבת הסיב. תתחיל עם ערך עוצמה בטווח של 10-15 mW / ² מ"מ ולהתאים כלפי מטה במידת צורך, עד שחפצים בוטלו.
9. בדקו חפצי אור עם אלקטרודה בagarose, על סף כניסה לרקמות. התחל רכבת דופק החיפוש (לדוגמא, 30 הבזקי אור msec, 500 מרווח interstimulus msec (ISI)).
   1. לחסל את החפצים חולפים אור (איור 4) על ידי מיקום מחדש של סיבים האופטיים ביחס לאלקטרודה כדי לשנות את הזווית של אור האירוע. אם חפצים להתמיד, נסה להקטין את כוח האור. בהדואר מקרה נדיר שממצאים לא ניתן למנוע לחלוטין (רק ממוזערים), להאריך את משך הזמן של דופק החיפוש. זה יכול לסייע בזיהוי קוצים עצביים אמיתיים.

3. PINP-בישר '

1. לקדם את האלקטרודה באיטיות דרך המוח בשיעור של כ 1 מיקרומטר / sec. השתמש אוסצילוסקופ אחד כדי לפקח על פעילות שוטפת. מצד השני, לעורר את פעימות הלייזר.
2. תקשיב ל'החשיש 'הקלוש של קוצים אור עורר על צג השמע, אשר מציין כי האלקטרודה מתקרבת תא ChR2 + ולעתים קרובות יכולה להיתפס גם לפני האות החשמלי ניכרת באוסצילוסקופ. להאט את קצב ההתקדמות.
   הערה: אם התא נמצא בדיוק במסלול של האלקטרודה, פעילות האור עורר תגדל גדולה יותר (ויותר). כמו האלקטרודה גישות interneuron אחת, החשיש יפתור בצורת קוצים קטנים אך מוגדרים היטב בגודל ובצורה אחידים.
3. ברגע שliקוצים עוררים ght הם גדולים מספיק כדי לעורר את של בנפרד על אוסצילוסקופ, תתחיל לעשות זאת. התאם את קנה המידה על הציר האופקי כדי לבחון את צורתו של גל העלייה החדה המדויקת.
4. לעצור ולחכות לרקמות להתיישב. אל תתפתה להעביר את האלקטרודה קרובה יותר לתא. שלב זה הוא קריטי עבור הקלטה יציבה. אם לאחר כמה דקות את יחס אות לרעש לא השתפר - כי הוא, הרקמה יש התיישבה, אבל זה לא הביא את כל התא קרוב יותר לקצה האלקטרודה - מראש 5 מיקרומטר נוסף ושוב לחכות.
   1. חזור על תהליך זה עד שאחד השיא או השפל של פוטנציאל הפעולה יכול לנפול בפח באופן אמין עם סף מתח להגדיר היטב מעל רצפת הרעש (לדוגמא, +/- 300 μV או יותר).
      הערה: יש סיכון הקטן של שקר-חיוביים או עמימות כאשר PINPing interneurons המעכבת. רוב התאים יכולים בקלות לעקוב רכבת של פולסים עם משך זמן של 30 מילים-שני ובין-pulמרווח se 500 אלפיות שני, או מהיר יותר, עם זמן אחזור ספייק ראשון אמין של 2-5 msec (איור 5). רוב תאי PV +, בפרט, יכול לקיים את הירי לשניות מלאה 1 (איור 6). כי אלה הם נוירונים מעכבים, הפעלת disynaptic (עקיפה) היא לא דאגה גדולה.
5. בעת ההקלטה, לעקוב אחר פעילות שוטפת באוסצילוסקופ הראשון. להשגיח מקרוב על הגודל והצורה של קוצים באמצעות אוסצילוסקופ השני. שים לב לאיכות הצליל שלהם ברמקול.
   1. להקשיב בתשומת לב לשינויים פתאומיים, שמצביעים על כך שהתא הוא גם ציור קרוב מדי לאלקטרודה (שבו מסתכן בכך שפדה או פגומה), או שהוא נסחף משם. אם הקוצים הופכים לגדולים ומעוותת, לסגת; אם הם גדלים קטנים יותר, לקדם את האלקטרודה. לנוע באיטיות ב2 מיקרומטר צעדים.
   2. לאשר את האיכות של פוסט הוק-ההקלטה בגבבם כל צורות גל העלייה החדה, ומיושר לשיא או שפל. להשתנות thres המתחלהחזיק. על פני מגוון רחב של ערכי סף, שלא צריך רק פעם להיות צורת ספייק עקבית אחד בגובה האחיד (איור 5 א).
6. אם בכל נקודת האות הופכת מזוהמת עם קוצים מתא עצב סמוך, להמשיך הלאה. להתקדם לאט לאט, על הסיכוי קלוש שהאלקטרודה תעבור מחוץ לטווח של התא השכן, אך תישאר בטווח של הנוירון היעד. (זה בדרך כלל לא מוצלח.)
7. הזז את האלקטרודה דרך כל העומק של קליפת מוח (900 + מיקרומטר) בכל חדירה. אם אין תאי עצב אור תגובה הם נתקלו לאחר חדירות רבות או, לחלופין, הקלטות מזוהמות באופן שיגרתי עם קוצים מתאי ChR2- שכנים, לנסות אלקטרודה חדשה.
   הערה: גם בתוך אצווה אחת, הגיאומטריה העכבה וקצה אלקטרודות בודדות יכולה להשתנות במידה ניכרת. שני הגורמים משפיע על "רדיוס ההקשבה" האפקטיבי של האלקטרודה, אשר חייב להיות גדולים מספיק כדי לזהות קוצים אור עורר ש"שחיפוש איל, עדיין מוגבל מספיק כדי לאפשר הקלטת interneuron בודד בבידוד.
8. בדוק את העכבה של אלקטרודות לפי הצורך. כדי למנוע נזק לרקמה, לעשות את זה עם קצה האלקטרודה בחלק העליון של שכבת agarose, גם מחוץ למוח. בטווח של 7-14 MΩ, העכבה המדויקת אינה מנבא בטוח בביצועים, או תשואה, עבור יישום זה. שאמרו, זה proxy סביר לרדיוס האזנה: אלקטרודות נמוכה עכבה להרים יותר יחידות; גבוהה עכבה, פחות.
9. בסופו של הניסוי, להרדימו באמצעות אושר-מוסדי, כגון מנת יתר הרדמה, או נקע בצוואר הרחם תחת מטוס עמוק של הרדמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אנחנו כאן לשתף את האסטרטגיה שלנו להשגת הקלטות יחידה אחת מinterneurons המעכבת גנטי-מסווגת בקליפת העכבר בהרדמה, באמצעות שיטת optogenetic שפותחה על ידי ואח לימה אל. ^1. טבלת פרטים 1 קוקטייל ההרדמה הציע, קטמין-medetomidine-Acepromazine (" KMA "). איור 1 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

למרות PINP באופן רעיוני פשוט, זה יכול להיות מאתגר בפרקטיקה. הקובע עיקרי של הצלחה הוא הבחירה של האלקטרודה. רדיוס ההאזנה החשמל הוא הפרמטר הקריטי. זה חייב להיות גדול מספיק כדי לזהות קוצים אור עורר כאשר הקצה הוא עדיין במרחק מה מתא ChR2 +, כך שאפשר להתאים את קצב התקדמות בהתאם. בא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)	FST	10066-15
Surgical Scissors	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment	Foster & Smith	9N-76855
Homeothermic Blanket	Harvard Apparatus	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing	Warner Instruments	G150TF-3
Heat Shrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Use with standard Super Glue.
Microelectrode AC Amplifier 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorized Micromanipulator	Sutter	MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes	Tektronix	TDS2000C
Powered Speakers	Harman	Model JBL Duet
Manual Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Power Meter	ThorLabs	PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND