へのガイド<em&gt;インビボ</emOptogenetically同定された皮質抑制性介在から&gt;シングル単位記録

要約

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

要約

神経生理学における主要な課題は、大脳皮質に多数の阻害性の細胞型の応答特性および機能を特徴づけることであった。 ここで私たちは、リマと同僚¹によって開発された方法を使用して麻酔をかけたマウスの大脳皮質内で識別抑制性介在ニューロンから安定し、十分に単離され、単一ユニット記録を取得するための戦略を共有しています。記録は、特定のニューロンの亜集団にチャネルロドプシン-2（ChR2を）を発現するマウスで行われる。集団のメンバーは、青色光の短いフラッシュに対する反応により同定される。 「PINP」と呼ば、またはニューロン集団の光刺激アシスト識別 - - この技術は、標準的な細胞外記録装置で実現することができる。これは、遺伝的に同定された細胞に細胞外記録を標的とする目的のために、カルシウムイメージングまたは視覚誘導パッチに安価でアクセス可能な代替物として機能することができる。 HERE私たちは毎日の練習方法を最適化するための一連のガイドラインを提供する。我々は、具体的にはパルブアルブミン陽性（PV +）細胞を標的化するための戦略を洗練が、それはそのようなソマトスタチン発現（SOM +）とカルレチニン発現（CR +）介在ニューロンとして、同様に他の介在ニューロンタイプのために働くことを見出した。

概要

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors^2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue.

Recently, Lima and colleagues¹ developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed “PINP” – or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.

In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons⁴. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits^5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

プロトコル

注：オレゴン大学の動物実験委員会によって承認され、次のプロトコルが健康ガイドラインの国立研究所によるものである。

1.急性手術

1. 腹腔内（ip）注射した（ 表1）を介して、ケタミン-メデトミジンカクテルで動物を麻酔。
   注：これらの実験で使用したマウスは、ドライバ·ライン（; SST-iCre12、SOMの+; CrをiCre12、CR + Pvalb-iCre11、PV +）を介在するCRE依存ChR2を-のeYFPトランスジェニックline10を交配することによって生成されます。 ChR2をまたは関連オプシンのウイルス送達は、同様の発現レベルが得られると仮定して、同様にうまく動作するはずです。
2. 手術を開始する前に、確実に、動物の展示穏やかつま先のピンチに応答がないという。麻酔のこの深さを維持するために必要に応じて、実験を通して麻酔薬を再投与する。注射用麻酔薬を使用する場合は、必要に応じてメンテナンス注射用のIPカテーテルを埋め込む。
3. メンテナンス注射（ 表1）のために適切に希釈した麻酔薬のカクテルを使用することにより、たとえば、（約3ミリリットル/ kg /時間）、実験を通して生理食塩水または乳酸加リンゲル液で水和動物を保管してください。
4. 定位や他のヘッド保持装置における動物を置きます。頭蓋骨はよく固定されていることを確認してください。これにより、安定した単一細胞記録を維持するために不可欠である。
5. 乾燥を防ぐために、目にopthalamic軟膏を適用します。 36.5から37℃の体温を維持する。
6. 追記安定性のための脳槽ドレーンを実行します。手術用メスの刃を使用して、大槽マグナを露出するために頭蓋骨の後部面から組織を除去する。脳脊髄液を排出する硬膜に小さなニックを作る。刃のごく先端を使用し、小脳や脳幹に接触することは避けてください。
7. メスを使用して、聴覚のために（対象の皮質領域の上に小さな開頭術（1~2 mm ²で） ^を行うブレグマの皮質、おおよそ-2.3 mmの後方、正中線の横4.5ミリメートル）。
8. 硬膜を取り出し、暖かいアガロースの層で0.5さらさ皮質をカバー - 1mm厚を（1.5％アガロース生理食塩水に、0.9％のNaCl;〜37℃で適用されます）。定期的に生理食塩水を数滴を適用することにより、実験を通して湿ったアガロースを保管してください。

2.録画セットアップ

1. タングステン電極（7〜14MΩ、127ミクロンの直径、12°テーパーチップ、エポキシコーティングされた）を準備します。ガラス毛細管に電極を瞬間接着剤と、グリップ（ 図1）のための熱収縮チューブを追加する。
2. 皮質表面に直交する移動するように設定電動（または油圧）マイクロマニピュレーター上に電極を、マウントします。頭蓋骨に対して、皮膚の下にワイヤー地面をスライドさせます。彼らは筋電図の成果物を生成することができますように頭部の側面と首の後ろに筋肉との接触を避ける。
3. 細胞外のアンプを用いて電気信号を増幅シングルユニット記録に適したLi FiのERが、好ましくは、インピーダンスチェックモードを装備。 2オシロスコープやパワードスピーカーのセット - 進行中のスパイク活動（5000 Hzのバンドパス300）を監視します。ここで、記録されたデータは、10kHzのサンプリングレートで連続的にデジタル化される。スパイクは、オフラインで抽出される。
4. 先端が皮質の表面に到達するまで、アガロースを介して電極を進める。顕微鏡でこの手順を守ってください。マイクロマニピュレータ上の "ゼロ"はこの位置。
5. 最高の記録の深さに近づけるために、視覚的に浸透の終わりに電極を引き出す際に電極先端がゼロの深さで皮質表面を出ることを確認します。
   注：マニピュレータの読み取りと観測された電極位置の間に不一致は、それが組織に比べてドリフトしたことを示しています。これは、脳または動物、またはマニピュレータドリフトの不安定性によって引き起こされ得る。
   1. ことを確実にするための追加のチェックとしてこのゼロ設定点は皮質の表面に対応する、組織の最初の数百メートルを進行しながら、刺激誘発電場電位を監視します。電場電位を監視する場合、10 Hzに細胞外アンプの低い帯域通過フィルタのカットオフを下げます。局所電場電位の極性は層I / IIの国境付近で^{13、〜100μm}の深さを中心に反転させることを確認します。これは聴覚皮質のための信頼性の基準点であるが、それは他の皮質領域のために異なる場合があります。
6. 手動マイクロマニピュレーター上に青色光源（ 図2）に結合された光ファイバをマウントします。顕微鏡を用いて、可能な限り、アガロースの表面に近いファイバの先端を位置決めする。電極が組織に入るビームをセンター。
7. 指定された幅とduratioのTTL（トランジスタ - トランジスタ論理）パルス列を送達することができる制御ユニットと、光源の出力を調整するn型、例えば、アルドゥイーノ（ 図3）、コンピュータI / Oカード（図示のように）、または市販のパルス発生器。
   1. 両方のオシロスコープ上の信号を監視します。
8. パワーメータを用いた光ファイバの先端に全光パワー出力（mW）を測定する。ファイバコアの断面積で割ることによって放射照度（ミリワット/ mm ²で） ^を計算するためにこの値を使用します。 10の範囲内の強度値で始まる- 15ミリワット/ mm ²であり、必要に応じて、アーチファクトが除去されるまで、下方向に調整する。
9. 組織に入るために態勢を整えて、アガロース内の電極、光のアーティファクトを確認してください。検索パルス列を起動します（ 例えば、30ミリ秒光パルス、500ミリ秒刺激間間隔（ISI））。
   1. 入射光の角度を変更するために、電極に対する光ファイバを再配置することにより、過渡光アーチファクト（ 図4）を除去する。アーティファクトが解決しない場合は、光パワーを減らしてみてください。目の中アーチファクトは、完全に排除することができない電子稀なケース（のみ最小化）、探索パルスの持続時間を延長する。これが本当のニューロンのスパイクを識別するのを助けることができる。

3.ストレートPINPイン」

1. 約1μm/秒の速度で脳をゆっくり電極を進める。継続的な活動を監視するために、1つのオシロスコープを使用してください。他方では、レーザパルスをオフトリガー。
2. 電極は、ChR2を+細胞に近づいていることが多い電気信号がオシロスコープ上明らかであるだけでなく前に知覚できることを示しオーディオモニター上に光誘発スパイクのかすかな「ハッシュ」、音を聞きます。前進速度を遅くする。
   注：セルは、電極の経路内に直接にある場合、光誘発活動は大きな（そして大声で）成長します。電極は、単一の介在ニューロンに近づくと、ハッシュは、均一なサイズおよび形状の小さいが明確に定義されたスパイクに解決される。
3. とすぐにLiなどGHT誘発スパイクは、そうすることを開始、オシロスコープ上で個別のオフを引き起こすのに十分な大きさである。スパイク波形の正確な形状を観察するために横軸にスケーリングを調整します。
4. 停止し、組織が安定するのを待つ。近いセルに電極を移動する誘惑に抵抗する。このステップでは、安定した記録のために重要である。数分後に、信号対雑音比が改善されない場合 - それは、組織が定着しているが、それは任意に近い電極の先端に細胞を持っていない - 事前さらに5ミクロンおよび再び待つ。
   1. ピークまたは活動電位の谷のいずれかが確実に良くノイズフロア（ 例えば、+/- 300μV以上）の上に設定された電圧閾値と捉えることができるまで、このプロセスを繰り返します。
      注：抑制性介在ニューロンをPINPingとき偽陽性または曖昧さの少ないリスクがあります。ほとんどの細胞は、容易に30ミリ秒の持続時間と間PULとのパルス列に従うことができます2-5ミリ秒（ 図5）の信頼性のある最初のスパイクレイテンシを持つSE間隔500ミリ秒、またはより速く、。 PV +細胞の大部分は、特に、完全な1秒（ 図6）のための焼成に耐えることができます。これらは抑制性ニューロンであるため、disynaptic（間接）活性化は主要な関心事ではありません。
5. 記録しながら、最初のオシロスコープで継続的な活動を監視する。第二オシロスコープを使用したスパイクの大きさや形状に近い目を離さない。スピーカー上の彼らのサウンドの品質に注意してください。
   1. セルは（それが刺しや損傷危険性がある）は、電極に接近しすぎて描画されるか、または離れて漂流していることを示す急激な変化のために聞き入る。スパイクが大きく歪む場合は、バックアウト。彼らは小さく成長する場合には、電極を進める。 2μmのステップでゆっくりと移動します。
   2. ピークまたは谷に揃え、すべてのスパイク波形を、重ね合わせることにより記録事後の品質を確認してください。電圧THRESを変えるホールド。しきい値の幅広い、しか均一な高さ（ 図5a）のいずれかの一貫性のあるスパイク形状があるはずです。
6. いずれかの時点で信号が隣接ニューロンからのスパイクで汚れた場合は、上に移動します。電極は、隣接セルの範囲外に渡すが、標的ニューロンの範囲内に残ることをオフのチャンスに、ゆっくりと進める。 （これは通常、成功しません。）
7. 各浸透皮質の深さ全体（900 +μm）を介して電極を移動します。何光応答性ニューロンは逆に、記録は日常の隣接ChR2-細胞からのスパイクで汚染されている多くの侵入や、後に遭遇されていない場合は、新しい電極を試してみてください。
   注：でも、単一のバッチ内で、個別電極のインピーダンスと先端形状がかなり変化することができます。両方の要因は、WH-光誘発スパイクを検出するのに十分な大きさでなければならない電極の有効」を聞い半径」に貢献Ileの検索は、まだ単独での単一ニューロン記録を可能にするために十分な制限された。
8. 必要に応じて、電極のインピーダンスをテストします。組織の損傷を避けるため、よく脳の外側に、アガロース層の上部に電極の先端でこれを行う。 7-14MΩの範囲内で、正確なインピーダンスは、このアプリケーションの性能、歩留まりの予測を確認し、ない。とは言う、それは半径を聴くための合理的なプロキシです：低インピーダンス電極は、より多くのユニットを拾う。高インピーダンス、少ない。
9. 実験の最後に、そのような麻酔薬の過剰投与、または麻酔の深い面下に頸椎脱臼などの制度的認定の手段により動物を安楽死させる。

結果

ここでは、「リマら ^1。 表1の詳細を示唆麻酔カクテル、ケタミン-メデトミジン-アセプロマジンを（によって開発された光遺伝学的方法を使用して、麻酔したマウス皮質で遺伝的に分類された抑制性介在からシングルユニット記録を取得するための我々の戦略を共有するKMA」）。 図1は、4図3は、Arduinoのマイクロコントローラと光出力をゲーティング?...

ディスカッション

PINPは、概念的には簡単であるが、それは実際に挑戦することができます。成功の主要な決定は、電極の選択である。電気リスニング半径は重要なパラメータである。それは1つがそれに応じて前進速度を調整できるように、先端が、少し離れChR2を+細胞からまだあるときに光誘発スパイクを検出するのに十分な大きさでなければならない。同時に、それは優れた単体分離を可能にするために?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)	FST	10066-15
Surgical Scissors	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment	Foster & Smith	9N-76855
Homeothermic Blanket	Harvard Apparatus	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing	Warner Instruments	G150TF-3
Heat Shrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Use with standard Super Glue.
Microelectrode AC Amplifier 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorized Micromanipulator	Sutter	MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes	Tektronix	TDS2000C
Powered Speakers	Harman	Model JBL Duet
Manual Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Power Meter	ThorLabs	PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND