Руководство по<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Регистрация отдельных единиц из Optogenetically Идентифицировано корковых ингибиторной интернейронов

Резюме

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Аннотация

Одна из основных задач в области нейрофизиологии в том, чтобы охарактеризовать свойства реагирования и функции многочисленных видов ингибирующее клеток в коре головного мозга. Мы здесь поделиться нашим стратегии получения устойчивых, хорошо изолированные единичные записи с определенных ингибирующих интернейронов в наркозом коры мыши с помощью метода, разработанного Лиме и ¹ коллегами. Записи выполняются в мышей, экспрессирующих Channelrhodopsin-2 (ChR2) в конкретных нейронных групп населения. Члены населения идентифицируются по их реакции на короткой вспышке синего света. Эта техника - называют "PINP", или Фотостимуляция-помощь идентификации нейрональных популяций - могут быть реализованы с помощью стандартного оборудования внеклеточной записи. Она может служить в качестве недорогой и доступной альтернативы визуализации кальция или визуально-управляемой коммутации, с целью ориентации внеклеточные записи на генетически определенных клеток. Hпрежде чем мы предоставляем набор руководящих принципов для оптимизации метода в повседневной практике. Мы усовершенствовали нашу стратегию специально для таргетинга парвальбумина-положительным (PV +) клеток, но обнаружили, что это работает для других типов интернейронов, а, например, соматостатин-выражающей (SOM +) и calretinin-выражения (CR +) интернейронов.

Введение

Characterizing the myriad cell types that comprise the mammalian brain has been a central, but long-elusive goal of neurophysiology. For instance, the properties and function of different inhibitory cell types in the cerebral cortex are topics of great interest but are still relatively unknown. This is in part because conventional blind in vivo recording techniques are limited in their ability to distinguish between different cell types. Extracellular spike width can be used to separate putative parvalbumin-positive inhibitory neurons from excitatory pyramidal cells, but this method is subject to both type I and type II errors^2,3. Alternatively, recorded neurons can be filled, recovered, and stained to later confirm their morphological and molecular identity, but this is a pain-staking and time-consuming process. Recently, genetically identified populations of inhibitory interneurons have become accessible by means of calcium imaging or visually guided patch recordings. In these approaches, viral or transgenic expression of a calcium reporter (such as GCaMP) or fluorescent protein (such as GFP) allows identification and characterization of cell types defined by promoter expression. These approaches use 2-photon microscopy, which requires expensive equipment, and are also limited to superficial cortical layers due to the light scattering properties of brain tissue.

Recently, Lima and colleagues¹ developed a novel application of optogenetics to target electrophysiological recordings to genetically identified neuronal types in vivo, termed “PINP” – or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. Unlike many other optogenetic applications, the goal is not to manipulate circuit function but simply to identify neurons belonging to a genetically-defined class, which can then be characterized during normal brain function. The technique can be implemented with standard extracellular recording equipment and can therefore serve as an accessible and inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching. Here we describe an approach to PINPing specific cell types in the anesthetized auditory cortex, with the expectation that the more general points can be usefully applied in other preparations and brain regions.

In cortex, PINP holds particular promise for investigating the in vivo response properties of inhibitory interneurons. GABAergic interneurons comprise a small, heterogeneous subset of cortical neurons⁴. Different subtypes, marked by the expression of particular molecular markers, have recently been shown to perform different computational roles in cortical circuits^5-9. As genetic tools improve it may eventually be possible to distinguish morphologically- and physiologically-separable types that fall within these broad classes. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. This strategy was developed specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but we have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons. Although PINPing is conceptually straightforward, it can be surprisingly unyielding in practice. We learned a number of tips and tricks through trial-and-error that may be useful to others attempting the method.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: следующий протокол в соответствии с Национальными Институтами принципов здравоохранения, утвержденным университета штата Орегон уходу и использованию животных комитета.

1. Острый хирургии

1. Обезболить животное смесью кетамина-медетомидин коктейль, с помощью внутрибрюшинного (IP) инъекции (Таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши, используемые в этих экспериментах генерируются путем скрещивания CRE-зависимых ChR2-EYFP трансгенной LINE10 к интернейрон линии драйверов (Pvalb-iCre11, PV +; SST-iCre12, SOM +; Cr-iCre12, CR +). Вирусный доставка ChR2 или смежных опсинов должен одинаково хорошо работать, предполагая аналогичные уровни экспрессии получаются.
2. Перед началом операции убедитесь, что экспонаты животных не реагирует на нежной пальца щепоткой. Повторно вводить обезболивающие в течение всего эксперимента по мере необходимости, чтобы поддерживать эту глубину анестезии. При использовании инъекционных анестетиков, возможно имплантировать IP катетер для инъекций обслуживания.
3. Держать животное гидратированный физиологическим раствором или раствором лактата Рингера в течение всего эксперимента (примерно 3 мл / кг / час), например, с помощью соответствующим образом разбавленного обезболивающий коктейль для инъекций обслуживания (таблица 1).
4. Поместите животное в стереотаксической или другой головной холдинговой аппарата. Убедитесь, что череп хорошо закреплены. Это очень важно для поддержания стабильных записи одной ячейки.
5. Применить opthalamic мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость. Поддерживать температуру тела в 36.5-37 ° C.
6. Выполните цистерн для слива дополнительной устойчивости записи. Используя лезвие скальпеля, удалить ткань от задней поверхности черепа, чтобы выставить большой цистерны. Сделайте небольшой ник в твердой мозговой оболочке, чтобы слить спинномозговую жидкость. Используйте только самый кончик лезвия, и избежать контакта мозжечка или ствола мозга.
7. Используя скальпель, выполнить небольшую трепанацию черепа (~ 2 мм ²⁾ по сравнению с кортикальной области, представляющей интерес (для слуховогокора, примерно -2,3 мм кзади от темени, 4,5 мм сбоку от средней линии).
8. Удалить твердую мозговую оболочку и покрытия подвергаются кору со слоем теплой агарозы 0,5 - 1 мм (1,5% агарозы в физиологическом растворе, 0,9% NaCl; применяют при ~ 37 ° C). Держите агарозном влажной в течение эксперимента, периодически применяя несколько капель физиологического раствора.

2. Запись Set-до

1. Подготовьте вольфрамовым электродом (7-14 МОм, 127 мкм в диаметре, 12 ° коническая наконечник, с эпоксидным покрытием). Суперклей электрод к стеклянной капиллярной трубки и добавить термоусадочной трубки для захвата (рисунок 1).
2. Установите электрод на моторизованной (или гидравлического) микроманипулятором, установите путешествовать ортогональна поверхности коры. Слайд проволочную основу под кожу, против черепа. Избегать контакта с мышц на стороне головы и задней части шеи, поскольку они могут генерировать электромиографические артефакты.
3. Amplify электрический сигнал, используя внеклеточный усилительЛи фантастические э подходит для одной единицы записи, предпочтительно оснащен режиме проверки сопротивления. Монитор постоянный пики активности (полосовой 300 - 5000 Гц) с двумя осциллографов и набор активных акустических систем. Здесь, записанные данные оцифрованы постоянно с частотой дискретизации 10 кГц; шипы извлекаются форума.
4. Предварительный электрод через агарозы, пока наконечник достигает поверхности коры. Соблюдайте этот шаг через микроскоп. "Ноль" эта позиция на микроманипулятором.
5. Чтобы лучше аппроксимируют глубину записи, визуально подтвердить, что кончик электрода выходит из поверхности коры на глубине нулю при снятии электрода в конце проникновения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: несоответствие между показаниями манипулятора и наблюдаемого положения электрода указывает, что он дрейфовал по отношению к ткани. Это может быть вызвано нестабильностью мозга или животного или манипулятора дрейфа.
   1. В качестве дополнительной проверки, чтобы обеспечить, чтоэтот нуль уставка соответствует поверхности коры, контролировать стимул-вызывала потенциалов поля при продвижении через первые несколько сотен микрометров ткани. При мониторинге полевых потенциалов, опустите нижнюю полосовой фильтр отсечки внеклеточной усилителя 10 Гц. Подтверждение, что полярность локального потенциала поля вокруг изменяет глубину ~ 100 мкм, вблизи слоя I / II пограничного ^13. Это является надежным ориентиром для слуховой коры, но она может отличаться для других областей коры.
6. Установите оптического волокна, соединенный с источником света синего (рисунок 2) на ручном микроманипулятором. Использование микроскопа, позиционировать кончик волокна как можно ближе к поверхности агарозы, как это возможно. Сосредоточьте луч, где электрод будет проникать в ткань.
7. Регулировать выход источника света с блоком управления, способным обеспечить доставку TTL (транзисторно-транзисторной логики) импульсов указанной ширины и ДлительностиN- например, Ардуино (фиг.3), компьютер ввода / вывода карты (как показано), или коммерчески доступным генератор импульсов.
   1. Контролировать сигнал на обоих осциллографов.
8. Измерение полной мощности света (Mw) на конце оптического волокна с использованием измерителя мощности. Используйте это значение для расчета освещенности (мВт / мм ²⁾ путем деления на площади поперечного сечения сердечника волокна. Начинают с величиной интенсивности в диапазоне 10 - 15 мВт / мм ² и отрегулировать вниз, если это необходимо, до тех пор, артефакты не будут устранены.
9. Проверка на легких артефактов с электродом в агарозы, на пороге ткани. Начните поиск импульсов (например, 30 мс импульсы света, 500 мс межстимульный интервал (ISI)).
   1. Исключите переходные легкие артефакты (рисунок 4) путем перестановки оптического волокна по отношению к электроду для изменения угла падающего света. Если артефакты сохраняются, попробуйте уменьшить силу света. В гое редкий случай, что артефакты не могут быть полностью устранены (только свести к минимуму), продлить срок поисковой импульса. Это может помочь в выявлении истинных нервных шипы.

3. Прямо ПИЯФ-в "

1. Предварительный электрод медленно через мозг со скоростью примерно 1 мкм / сек. Используйте один осциллограф для контроля текущей деятельности. С другой стороны, провоцировать лазерных импульсов.
2. Прислушайтесь к слабым "хэш" легких-вызвала шипами на звуковой монитор, который показывает, что электрод приближается ячейку ChR2 + и часто могут быть восприняты задолго до того, электрический сигнал очевидно на экране осциллографа. Медленная скорость заранее.
   Примечание: Если ячейка находится непосредственно на пути электрода, светло-вызывала активность будет расти больше (и громче). Как электрод приближается один интернейрон, хэш будет решить в небольших, но четко определенных шипы размером единой и формы.
3. Как только LiGHT-вызывала всплески являются достаточно большими, чтобы вызвать офф индивидуально на экране осциллографа, начинают это делать. Регулировка масштабирования на горизонтальной оси, чтобы наблюдать точную форму шипа сигнала.
4. Остановитесь и ждите ткани урегулировать. Не поддавайтесь искушению, чтобы переместить электрод ближе к камере. Этот шаг является критическим для стабильной записи. Если через несколько минут отношение сигнал-шум не улучшилась - то есть, ткани осела, но это не принесло клетку ближе к кончику электрода - продвижение 5 мкм дальше и ждать снова.
   1. Повторите этот процесс, пока либо пик или впадина потенциала действия не может быть достоверно захватили с порога напряжения, установленным значительно выше уровня шума (например, +/- 300 мкВ или более).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Там мало риск ложных срабатываний или двусмысленности, когда PINPing ингибирующие интернейроны. Большинство клеток может легко следовать серию импульсов с длительностью 30 мс и интер-Пульсебе интервал 500 мс, или быстрее, с надежным первой задержки шип 2-5 мс (рисунок 5). Большинство PV + клеток, в частности, может выдержать стрельбу на полный 1 сек (рисунок 6). Потому что эти тормозящие нейроны, disynaptic (косвенные) активация не является основной проблемой.
5. Во время записи, контролировать текущую деятельность на первом осциллографа. Следите от размера и формы шипов с помощью второй осциллограф. Обратите внимание на качество их звука на динамик.
   1. Слушайте внимательно к резким изменениям, которые указывают, что клетка либо рисунок слишком близко к электроду (где он рискует пронзил или поврежденного), или отходит. Если шипы становятся большими и искажены, отступать; если они растут меньше, продвигать электрод. Двигайтесь медленно в 2 мкм шагов.
   2. Подтвердите качество записи ретроспективном путем наложения все шипованные сигналов, выравнивание по пик или впадина. Вары Thres напряжениядержать. В широком диапазоне пороговых значений, не должно быть только когда один шип соответствует форма одинаковой высоты (рис 5а).
6. Если в любой момент сигнал становится загрязненной с шипами из соседнего нейрона, двигаться дальше. Авансовые медленно, на всякий случай, что электрод пройдет вне зоны соседней камере, но остаются в пределах целевого нейрона. (Это, как правило, неудачными.)
7. Перемещение электрода через всю глубину коры (900 + мкм) в каждой проникновения. Если нет света проблематику нейроны не встречаются через много проникновений или, наоборот, записи обычно загрязненных с шипами из соседних ChR2- клеток, попробовать новый электрод.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Даже в пределах одной партии, импеданс и наконечник геометрия отдельных электродов могут значительно различаться. Оба фактора способствуют эффективному "прослушивания радиуса» электрода, который должен быть достаточно большим, чтобы обнаружить легкие, вызвали шипы белыйИль поиск, пока ограничивается достаточно для того, чтобы записи одного интернейрон в изоляции.
8. Испытание на сопротивление электродов, как требуется. Во избежание повреждения ткани, сделать это с кончиком электрода в верхней части слоя агарозы, а вне мозга. В диапазоне 7-14 МОм, точное сопротивление не уверен предсказатель эффективности или доходности, для этого приложения. Тем не менее, это разумный прокси для радиуса прослушивания: меньше импеданса электродов подобрать более единиц; выше импеданс, меньше.
9. В конце эксперимента, эвтаназии животных по организационно-одобренных средств, таких как анестезирующего передозировки, или цервикальной дислокации под глубокой анестезией плоскости.

Результаты

Мы здесь поделиться нашей стратегии для получения одной единицы записи с генетически-секретных тормозных интернейронов в наркозом коры мыши, с помощью optogenetic метод, разработанный Лиме и др. Таблица 1 детали предложил анестетик коктейль, кетамин-Медетомидин-ацепромазина <...

Обсуждение

Хотя ПИЯФ концептуально проста, он может быть сложным на практике. Основным фактором, определяющим успех, является выбор электрода. Электрическая радиус прослушивания является критическим параметром. Он должен быть достаточно большим, чтобы обнаружить светло-вызывала всплески, когда...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChR2-EYFP Line	Jackson Colonies	12569
Pvalb-iCre (PV) Line	Jackson Colonies	8069
Sst-iCre (SOM) Line	Jackson Colonies	13044
Cr-iCre (CR) Line	Jackson Colonies	10774
Agarose	Sigma-Aldrich	A9793	Type III-A, High EEO
Micro Point (dural hook)	FST	10066-15
Surgical Scissors	FST	14084-09
Scalpel	FST	10003-12 (handle), 10011-00 (blades)
Puralube Ophthalmic Ointment	Foster & Smith	9N-76855
Homeothermic Blanket	Harvard Apparatus	507220F
Tungsten Microelectrodes	A-M Systems	577200	12 MΩ AC resistance, 127 μm diameter, 12° tapered tip, epoxy-coated
Capillary Glass Tubing	Warner Instruments	G150TF-3
Heat Shrink Tubing	DigiKey	A332B-4-ND
Zapit Accelerator	DVA	SKU ZA/ZAA	Use with standard Super Glue.
Microelectrode AC Amplifier 1800	AM Systems	700000
MP-285 Motorized Micromanipulator	Sutter	MP-285
4-channel Digital Oscilloscopes	Tektronix	TDS2000C
Powered Speakers	Harman	Model JBL Duet
Manual Manipulator	Scientifica	LBM-7
800 µm Fiber Optic Patch Cable	ThorLabs	FC/PC BFL37-800
Power Meter	ThorLabs	PM100D (Power Meter), S121C (Standard Power Sensor)
475 nm Cree XLamp XP-E	DigiKey	XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND	LED power and efficiency are continually increasing, so we recommend checking for the latest products (www.cree.com).
Arduino UNO	DigiKey	1050-1024-ND