从小鼠胰腺RNA提取:核糖核酸酶丰富的组织

摘要

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

摘要

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

引言

需要常规的分子生物学实验，如Northern印迹^9，定量RT-PCR检测¹或基因表达谱⁵与诚信度高的RNA分离。大多数现代的RNA分离方法，是根据对硫氰酸胍协议^2，修改^3。硫氰酸胍是一种强的蛋白质变性剂，并有效地破坏大多数条件下核糖核酸酶的活性。 Chomczynski和Sacchi ³的流行的方法结合到苯酚的硫氰酸胍裂解溶液，减少了隔离时间约4小时。许多市售的RNA提取试剂基于Chomczynski和Sacchi方法^3。

核糖核酸酶丰富的组织如人类或小鼠胰腺呈现为分离RNA一个额外的挑战。小鼠胰腺可含有高达75毫克核糖核酸酶⁶的其中一些将被释放超级碗造成组织自溶胰腺组织克中断。的异硫氰酸胍协议的修改已经被成功地用于分离RNA从胰腺具有高完整性^{2，4，7，10，}输液RNA稳定剂与高完整性^4，7，10的RNA小鼠胰腺促进隔离的，但是输注解决方案集成到胰腺需要很高的技巧，可能需要专门的工具，如解剖显微镜和手术过程中破坏的组织架构，可能会导致细胞裂解。组织灌注与RNA的稳定剂可能干扰其他应用，包括蛋白分离和组织学染色。此外，这种技术不适合于从人胰腺中分离RNA。其他协议需要由研究者²编制具体的解决方案。

我们报告一个协议来分离RNA从小鼠胰腺诚信度高。钍Ë协议使用先前公布的方法要素，并在很大程度上基于标准的酚/异硫氰酸胍基裂解试剂的协议。它不需要专门的解决方案的准备，也不需要输液剂进入胰腺。对于成功的RNA分离的关键步骤包括一个高酚/胍基裂解试剂对组织的比例，除去相分离和包容核糖核酸酶抑制剂到所得到的RNA溶液先未消化的组织。使用这些和其它的修改，我们通常分离RNA与RIN大于7被用于常规的基因表达分析。

研究方案

1。准备

以下做法坚持以该机构的动物护理和使用委员会（IACUC）设置的策略。

1. 建议在隔离不超过6小鼠胰腺中任何一天。让所有的手术器械清洁和灭菌，每只动物一组。
2. 标记所有离心管。 4个2 ml离心管每只动物。
3. 放置8毫升裂解试剂在冰上的50ml离心管中。注意:当纯化试剂盒自带的硫氰酸胍酚试剂，适合于胰腺分离，裂解试剂使用，因为大量是每个隔离必要的。
4. 免除约10毫升以下解决方案集成到15ml离心管清洗均质机的叶片。乙醇，70％（2管），HPLC级水（1管）和HPLC级水约含200μLRNA酶的客场或同等核糖核酸酶灭活。

2，外科，胰腺解剖和同质化

1. 将1-2毫升的异氟醚为含棉纱布或纸巾罐。将小鼠放置于阻止他们到达异氟醚的源的平台。加入新鲜的异氟醚的麻醉罐每只小鼠前。
2. 轻轻将鼠标放到含有异氟醚的罐子。盖上瓶子并通过轻轻地转动瓶子来回监测麻醉的效果。动物被麻醉，一旦它在无法站立在它自己的。
3. 为了确认麻醉，从罐子里取出的动物和应用坚定的脚趾捏。如果鼠标没有反应到脚趾捏，继续执行步骤2.5。
4. 如果鼠标反应到脚趾捏，然后重复步骤2.2至2.3。
5. 将动物麻醉的台式俯卧位。紧紧把左手放在鼠标的子宫颈脱臼鼠标的子宫颈。我们ing的右手抓住老鼠的尾巴，快速地向上拉以大约45°角脱臼子宫颈。
6. 通过使用25号皮下注射针头的每个动物的四只爪子的刺入平坦面固定到胎体的表面（一个电平片发泡胶覆盖纸巾）。
7. 用无菌手术器械，切断小鼠的中部开，并迅速从小鼠取出胰腺。使用镊子举行胰腺和使用弹簧剪刀从脾脏和小肠切开它。要小心，不要从鼠标的拆卸过程中拉伸胰腺。组织破坏可能释放核糖核酸酶。注意:它需要从鼠标移除胰脏的时间是至关重要的。本领域技术人员应该能够解剖胰腺在约1分钟或更少。
8. 将整个胰腺入50毫升的试管装有8毫升冰冷的裂解试剂。盖上管，并简要摇沉浸在TISSUE到试剂和进行无延迟的下一个步骤。裂解试剂来组织的比例是至关重要的。看到结果的RNA的完整性使用不同体积的裂解试剂中分离出来的比较部分。
9. 匀化，持续5秒。它以按均质叶片的离心管的底部，以允许组织被拉到到叶片效率均匀化是重要的。

3，去除未消化的组织的

注意:以下均质化，组织的小的位将保持在裂解试剂。它快速裂解组织留下一些未消化的组织，而不是通过均质化和RNA的降解风险是比较重要的。

1. 转让2毫升裂解试剂的含有溶解的胰腺2ml微量离心管中。收集每隔离匀浆两个离心管。倒掉剩余的匀浆或储存在-80°C为今后的研究。
2. 一分钱rifuge在4℃，12000×g离心5分钟以沉淀未消化的组织。这是一个重要的步骤，因为未消化的组织的残留成RNA的后续的解决方案可能会污染样品与核糖核酸（步骤5.13）。
3. 转让将1ml上清液到2ml微量离心管中。与隔离，立即进行和复制管储存于-80℃以备将来使用。放置装有匀浆于湿冰，而继续进行下一个步骤的所有管道。
4. 出售剩余裂解试剂到合适的化学废物容器。

在均质机叶片4。清洁

1. 前继续下一隔离，通过将它们放置在10毫升的70％乙醇清洗匀浆器叶片。激活有关的均化器进行20秒以除去组织可能被捕获在叶片任何块。
2. 用200μl的枪头移除留在均质机叶片的任何碎片。
3. 水，一般核糖核酸酶失活和70％乙醇重复步骤4.1。用干净的金均质轴擦拭。
4. 对于其余的动物的胰腺隔离重复步骤2.1中，从每个动物单独的，而不是集中在RNA分离饲养的RNA。

5，RNA分离

下面的部分是相同的纯化试剂盒协议。纯化试剂盒的优点是，它会分离，包括小RNA的总RNA。

1. 如果使用冷冻组织匀浆液，解冻湿冰上，静置在室温下5分钟。
2. 加入200μl氯仿，帽管，并用手用力摇动15秒。让所述管支架在室温下2-3分钟。
3. 离心15分钟，12,000×g离心，4°C。
4. 传送上层的水层到微量离心管中。加1.5倍体积的异丙醇，并通过上下吹打数次调匀。
5. 转让最多700微升的样品放入一个旋转柱是放置在2 ml收集管。盖上盖子，离心机在8000×g离心15秒在室温。
6. 弃去流过。
7. 重复步骤5.5-5.6，使用该样品的其余部分。
8. 加入700μlBuffer RWT到离心柱。离心15秒，8,000×g的。弃去流过。
9. 移液管将500μl缓冲液RPE到离心柱。离心15秒，8,000×g离心洗柱。弃去流过。
10. 加入500μl缓冲液RPE到离心柱。离心2分钟在8000 XG干柱。
11. 离心柱转移到1.5 ml离心管。吸取80微升核糖核酸酶的水直接喷在旋转柱膜。离心1分钟，在8000×g离心来洗脱RNA。
12. 加入1μlRNA酶抑制剂的RNA溶液。储存在-80°C或进行至5.13。
13. 为了验证RNA的完整性，首先计算RNA的conce使用分光光度计ntration和二百八十分之二百六十比。
14. 稀释的RNA溶液的一部分以约500纳克/微升用分子生物学级别水。
15. 确定RNA的完整性（ 即 RIN）利用毛细管电泳分析。约5微升RNA溶液是足够的分析。
16. 分装的RNA溶液（参见图2），并存储于-80℃。

结果

从1毫升裂解匀浆的总RNA得率是20〜40微克。外径260/280的比例通常约为2.0和RIN比7.0更加一致。如果RIN是≤6，隔离将需要被重复。有时，RIN，比8.0更高的实现。

去除之前的胰腺实施安乐死的小鼠的两种最常用的方法是CO ₂窒息或吸入异氟醚。后跟颈椎脱位两种技术。因为它是可能的化学剂和/或程序时，可能会影响RNA的完整性，用这两种方法进行了比较分离小鼠胰腺核糖核...

讨论

从被核糖核酸酶丰富的组织中分离RNA代表了分子生物学实验的一大挑战。各种试剂和试剂盒是市售的主要依据RNA提取的酚异硫氰酸胍法。硫氰酸胍变性蛋白，从而减少核糖核酸酶的活性。然而，核糖核酸酶在胰腺的庞大规模需要额外的修改，RNA分离标准协议。协议是在这里报道，基于标准的异硫氰酸胍法还包含几个关键的改进，以及提示RNA的核糖核酸酶丰富的组织如胰腺成功分离。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Power Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogenizer
5424R	Eppendorf		Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent	Invitrogen	15596018	Lysis reagent
Student Vannas spring scissors	Fisher	91500-09	Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch	Fisher	08-951-20	Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps	Fisher	1381239	Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetic
Rnase out (40 U/µl)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivator
HPLC grade water	Fisher	W5-4	For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water	Hyclone	SH30538.03	Elution of RNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free	USA Scientific Plastics	1620-2700
15 ml centrifuge tubes	Falcon	352099
70% ethanol	Fisher
100% ethanol	Fisher
200 µl pipet tips	Rainin	GPL200F	For cleaning homogenizer blades
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrophotometer
Bioanalyzer	Agilent		Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater	Ambion		RNA Stabilization Reagent
RNeasy spin columns	Qiagen		Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice	Chales River	Strain C57BL/6	Their age ranged from 4 to 12 months.
Mice	Jackson Lab	strain 129	Their age ranged from 4 to 12 months.