Isolamento dell'RNA da mouse Pancreas: Un Tessuto ricco Ribonucleasi

Riepilogo

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Abstract

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

Introduzione

È necessario isolamento di RNA con grande integrità per esperimenti di routine di biologia molecolare come Northern blotting ^9, qRT-PCR ¹ o gene expression profiling ^5. La maggior parte dei metodi contemporanei di isolamento dell'RNA si basano sulle modificazioni dei protocolli tiocianato di guanidina ^{2, 3.} Guanidina tiocianato è un forte proteina denaturante e verrà efficacemente interrompere l'attività di ribonucleasi in molte condizioni. Il metodo popolare di Chomczynski e Sacchi ³ combinato fenolo alla soluzione di guanidina tiocianato lisi, riducendo il tempo di isolamento per circa 4 ore. Molti reagenti di estrazione dell'RNA commercialmente disponibili sono basati sul metodo Chomczynski e Sacchi ^3.

Ribonucleasi ricchi tessuti come umano o il mouse pancreas presenta una sfida aggiuntiva per isolare RNA. Pancreas mouse può contenere fino a 75 mg di ribonucleasi ^6, alcune delle quali verrà rilasciato During rottura del tessuto pancreatico conseguente autolisi tessuto. Modifiche dei protocolli guanidina tiocianato sono stati utilizzati con successo per isolare l'RNA da pancreas con alta integrità ^{2, 4, 7, 10.} L'infusione di RNA stabilizzante in topo pancreas facilitato isolamento di RNA con elevata integrità ^{4, 7, 10,} tuttavia infusione di Le soluzioni nel pancreas richiede grande abilità, possono richiedere strumenti specializzati come un microscopio da dissezione e interrompere architettura del tessuto durante la procedura può provocare la lisi cellulare. Perfusione tissutale con reagente stabilizzazione dell'RNA potrebbe interferire con altre applicazioni, tra cui l'isolamento delle proteine ​​e la colorazione istologica. Inoltre, questa tecnica non è adatto per isolare l'RNA da pancreas umano. Altri protocolli richiedono la preparazione di soluzioni specifiche dallo sperimentatore ^2.

Riportiamo un protocollo per isolare l'RNA con grande integrità di topo pancreas. The protocollo utilizza elementi dei metodi precedentemente pubblicati ed è in gran parte basata su protocolli standard di fenolo / guanidina a base di tiocianato-lisi reagenti. Non richiede la preparazione di soluzioni specializzate né richiede infusione di reagenti nelle pancreas. Passaggi critici per il successo di isolamento di RNA comprendono un elevato fenolo / guanidina-basato lisi reagente rapporto tra tessuto, la rimozione del tessuto non digerito prima fase la separazione e l'inclusione di un inibitore della ribonucleasi alla soluzione RNA risultante. Utilizzando queste e altre modifiche, di solito isolare l'RNA con RIN superiore a 7 da utilizzare per l'analisi di espressione genica di routine.

Protocollo

1. Preparazione

Le seguenti pratiche aderiscono ai criteri impostati da cura degli animali ed uso commissione dell'Istituzione (IACUC).

1. Si raccomanda di isolare non più di 6 pancreas di topo in un dato giorno. Hanno tutti gli strumenti chirurgici puliti e sterilizzati in autoclave, un set per ogni animale.
2. Etichettare tutti i tubi microcentrifuga. Quattro 2 ml provette per animali.
3. Mettere 8 ml di reagente di lisi in 50 ml provette da centrifuga su ghiaccio. Nota: Mentre il kit di purificazione viene fornito con un guanidina tiocianato reagente fenolo che è adatto per l'isolamento pancreas, reagente di lisi viene utilizzato a causa dei grandi volumi che sono necessari per l'isolamento.
4. Versare circa 10 ml delle seguenti soluzioni in provette da 15 ml per centrifuga per la pulizia di spazzole del omogeneizzatore. Etanolo, 70% (2 tubi), acqua di qualità per HPLC (1 tubo) e acqua di qualità per HPLC contenente circa 200 ml di RNase via o inattivatore ribonucleasi equivalente.

2. Chirurgia, Pancreas Dissection e omogeneizzazione

1. Mettere 1-2 ml di isoflurano in un barattolo contenente garza di cotone o tovaglioli di carta. I topi sono posti su una piattaforma che impedisce loro di raggiungere la fonte del isoflurano. Aggiungi isoflurano fresco al vaso prima di anestetizzare ogni mouse.
2. Posizionare delicatamente il mouse nel barattolo contenente il isoflurano. Tappare il vaso e monitorare gli effetti dell'anestesia ruotando delicatamente il barattolo avanti e indietro. L'animale viene anestetizzato una volta che è in grado di stare nel suo '.
3. Per la conferma di anestesia, togliere l'animale dal vaso e applicare un pizzico punta ditta. Se il mouse non reagisce al pizzico punta, passare al punto 2.5.
4. Se il mouse reagisce pizzico punta, quindi ripetere i passaggi 2,2-2,3.
5. Posizionare l'animale anestetizzato sul banco in posizione prona. Dislocare cervice del mouse ermeticamente ponendo la mano sinistra sul collo del mouse. Noizione la mano destra afferrare la coda del topo e tirare verso l'alto ad un angolo di circa 45 ° per dislocare la cervice rapidamente.
6. Fissare la carcassa di una superficie (un pezzo livello di polistirolo ricoperto di carta assorbente) da piercing ciascuno dei quattro zampe dell'animale nella superficie piatta usando 25 calibro aghi ipodermici.
7. Utilizzando strumenti chirurgici sterili, tagliare la parte mediana del mouse aperta e rapidamente rimuovere il pancreas dal mouse. Utilizzare le pinze per tenere il pancreas e tagliarlo dalla milza e intestino tenue con le forbici a molla. Fare attenzione a non allungare il pancreas durante la cancellazione dal mouse. Turbativa del tessuto potrebbe rilasciare ribonucleasi. Nota: Il tempo necessario per rimuovere il pancreas dal mouse è critica. Un esperto dovrebbe essere in grado di sezionare pancreas di circa 1 minuto o meno.
8. Porre l'intero pancreas in una provetta da 50 ml contenente 8 ml di ghiaccio freddo reagente di lisi. Tappare la provetta e brevemente agitare per immergere il tiSSUE nel reagente e procedere alla fase successiva senza indugio. Il rapporto di reagente di lisi di tessuto è critica. Vedere la sezione Risultati per un confronto dell'integrità dell'RNA isolato utilizzando diversi volumi di reagente di lisi.
9. Omogeneizzare per 5 sec. È importante premere le lame omogeneizzatore al fondo della provetta da centrifuga per permettere al tessuto di essere tirato nelle lame di omogeneizzazione efficiente.

3. Rimozione di tessuto non digerito

Nota: Dopo omogeneizzazione, piccoli frammenti di tessuto rimarranno nel reagente di lisi. E 'più importante per la lisi rapidamente il tessuto lasciando un po' di tessuto non digerito, piuttosto che su di omogeneizzazione e il degrado rischio di RNA.

1. Trasferimento di 2 ml di reagente di lisi contenente il pancreas lisati di una provetta 2 ml. Raccogliere due tubi microcentrifuga di omogenato per isolamento. Eliminare l'omogeneizzato rimanente o conservare a -80 ° C per gli studi futuri.
2. Centrifuge a 4 ° C, 12000 × g per 5 min a pellet tessuto non digerito. Questo è un passo fondamentale, come riporto di tessuto non digerito nelle successive soluzioni di RNA probabilmente contaminare il campione con ribonucleasi (punto 5.13).
3. Trasferire 1 ml del supernatante in una provetta 2 ml. Procedere con l'isolamento subito e memorizzare il tubo replica a -80 ° C per un uso futuro. Posizionare tutte le provette contenenti omogeneizzato sul ghiaccio bagnato mentre si procede alla fase successiva.
4. Smaltire il restante reagente di lisi in un apposito contenitore di rifiuti chimici.

4. Pulizia delle Blades Omogeneizzatore

1. Prima di procedere all'isolamento successivo, pulire le lame omogeneizzatore mettendoli in 10 ml di etanolo al 70%. Attivare l'omogeneizzatore per circa 20 sec per rimuovere eventuali pezzi di tessuto che può essere catturato nelle lame.
2. Utilizzare una punta di 200 microlitri pipetta per rimuovere eventuali pezzi che rimangono nelle lame omogeneizzatore.
3. Ripetere il punto 4.1 in acqua, generale inattivatore Rnase e il 70% di etanolo. Asciugare l'albero omogeneizzatore con Kim pulito pulire.
4. Ripetere il punto 2.1 per l'isolamento pancreas dei rimanenti animali, mantenendo RNA isolato da ogni animale separato piuttosto che mettere in comune l'RNA.

5. Isolamento RNA

La sezione seguente è identico al protocollo del kit di purificazione. Il vantaggio del kit di purificazione è che sarà isolare l'RNA totale compreso piccoli RNA.

1. Se si utilizza la soluzione omogeneizzato congelato, scongelare il ghiaccio umido e lasciate riposare a temperatura ambiente per 5 min.
2. Aggiungere 200 ml di cloroformio, tappare la provetta e agitare vigorosamente a mano per 15 sec. Lasciate che il tubo di riposare a temperatura ambiente per 2-3 min.
3. Centrifugare per 15 minuti a 12.000 xg, a 4 ° C.
4. Trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta. Aggiungere 1,5 volumi di isopropanolo e mescolare accuratamente pipettando su e giù parecchie volte.
5. Trasferimento fino a 700 microlitri di campione in una colonna di spin che viene inserito in un tubo di raccolta da 2 ml. Chiudere il coperchio e centrifugare a 8000 xg per 15 secondi a temperatura ambiente.
6. Gettare il flow-through.
7. Ripetere i passaggi 5,5-5,6, con il resto del campione.
8. Aggiungere 700 microlitri Buffer RWT alla colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flow-through.
9. Dispensare 500 microlitri Buffer RPE nella colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8000 xg per lavare la colonna. Gettare il flow-through.
10. Aggiungere 500 microlitri Buffer RPE alla colonna di spin. Centrifugare per 2 minuti a 8000 xg per asciugare la colonna.
11. Trasferire la colonna di selezione per una provetta da 1,5 ml. Dispensare 80 microlitri acqua priva di ribonucleasi direttamente sulla membrana colonna di spin. Centrifugare per 1 min a 8000 xg per eluire l'RNA.
12. Aggiungere inibitore RNasi 1 microlitri di soluzione di RNA. Conservare a -80 ° C o procedere alla 5.13.
13. Per convalidare l'integrità dell'RNA, prima calcolare il conce RNAntration e 260/280 rapporto utilizzando uno spettrofotometro.
14. Diluire una porzione della soluzione di RNA a circa 500 ng / ml con acqua per biologia molecolare.
15. Determinare l'RNA Integrity (cioè, RIN) utilizzando l'analisi di elettroforesi capillare. Circa 5 ml di soluzione di RNA è sufficiente per l'analisi.
16. Aliquotare la soluzione RNA (vedere Figura 2) e conservare a -80 ° C.

Risultati

La resa RNA totale da 1 ml di omogenato lisi è 20-40 mg. OD 260/280 rapporti sono in genere circa il 2,0 e il RIN sono costantemente maggiore di 7.0. Se il RIN è ≤ 6, l'isolamento dovrà essere ripetuta. Occasionalmente, un RIN che è superiore a 8,0 si ottiene.

I due metodi più comunemente usati di eutanasia topi prima della rimozione del pancreas sono CO ₂ asfissia o inalazione di isoflurano. Entrambe le tecniche sono seguiti da dislocazione cervicale. Poiché è possib...

Discussione

Isolare RNA da tessuti che sono ribonucleasi ricco rappresenta una grande sfida per esperimenti di biologia molecolare. I vari reagenti e kit sono disponibili in commercio che si basano principalmente sul metodo fenolo guanidina tiocianato di estrazione di RNA. Guanidina tiocianato denatura proteine ​​e quindi riduce l'attività di ribonucleasi. Tuttavia, l'ampiezza delle ribonucleasi nel pancreas richiede ulteriori modifiche ai protocolli standard di isolamento dell'RNA. Un protocollo è riportato qui c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Power Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogenizer
5424R	Eppendorf		Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent	Invitrogen	15596018	Lysis reagent
Student Vannas spring scissors	Fisher	91500-09	Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch	Fisher	08-951-20	Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps	Fisher	1381239	Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetic
Rnase out (40 U/µl)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivator
HPLC grade water	Fisher	W5-4	For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water	Hyclone	SH30538.03	Elution of RNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free	USA Scientific Plastics	1620-2700
15 ml centrifuge tubes	Falcon	352099
70% ethanol	Fisher
100% ethanol	Fisher
200 µl pipet tips	Rainin	GPL200F	For cleaning homogenizer blades
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrophotometer
Bioanalyzer	Agilent		Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater	Ambion		RNA Stabilization Reagent
RNeasy spin columns	Qiagen		Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice	Chales River	Strain C57BL/6	Their age ranged from 4 to 12 months.
Mice	Jackson Lab	strain 129	Their age ranged from 4 to 12 months.