RNA-Isolierung aus Maus Pankreas: Eine Ribonuklease-reichen Gewebe

Zusammenfassung

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Zusammenfassung

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

Einleitung

Isolierung von RNA mit hoher Integrität ist für die routinemäßige molekularbiologische Experimente wie Northern Blot ^9, qRT-PCR ¹ oder Genexpressions ⁵ erforderlich. Die meisten zeitgenössischen Methoden der RNA-Isolierung werden bei Änderungen der Guanidinthiocyanat Protokolle ^{2, 3} basiert. Guanidinthiocyanat ist eine starke Proteindenaturierungsmittel und effektiv stören die Aktivität der Ribonuklease unter den meisten Bedingungen. Die beliebte Methode der Chomczynski und Sacchi ³ kombiniert Phenol zu dem Guanidinthiocyanat Lyse-Lösung, die Verminderung der Isolation Zeit, über 4 Stunden. Viele im Handel erhältliche RNA-Extraktion Reagenzien werden von der Chomczynski und Sacchi Methode ³ basierend.

Ribonuklease reichen Geweben wie Mensch oder Maus Bauchspeicheldrüse stellt eine zusätzliche Herausforderung für die Isolierung von RNA. Maus Bauchspeicheldrüse kann bis zu 75 mg Ribonuklease ⁶ enthalten von denen einige Durin freigegeben werdeng Störung der nachfolgenden Gewebe Autolyse Pankreasgewebe. Modifikationen der Guanidinthiocyanat-Protokolle wurden erfolgreich verwendet, um RNA aus Pankreas mit hoher Integrität ^{2, 4, 7, 10.} Infusion von RNA-Stabilisierung in Maus-Pankreas-Reagens erleichtert Isolierung von RNA mit hoher Integrität ^{4, 7, 10,} jedoch Infusion isolieren Lösungen in der Bauchspeicheldrüse erfordert viel Geschick, können spezialisierte Instrumente wie einem Binokular und stören Gewebearchitektur während des Verfahrens kann in Zell-Lyse führen müssen. Perfusion Gewebes mit RNA-Stabilisierung Reagenz könnte mit anderen Anwendungen, einschließlich der Proteinisolierung und histologischen Färbung stören. Darüber hinaus ist diese Technik nicht geeignet zur Isolierung von RNA aus menschlichen Pankreas. Andere Protokolle erfordern die Herstellung von spezifischen Lösungen durch den Prüfarzt ^2.

Wir berichten über ein Protokoll zur RNA mit hoher Integrität von Maus Bauchspeicheldrüse zu isolieren. ThE-Protokoll verwendet Elemente der bisher veröffentlichten Methoden und wird weitgehend von den Standard-Phenol / Guanidinthiocyanat-basierte Lyse-Reagenz-Protokollen. Es erfordert nicht die Herstellung von Speziallösungen noch erfordert es Infusion von Reagenzien in die Bauchspeicheldrüse. Kritische Schritte für eine erfolgreiche RNA-Isolierung sind eine hohe Phenol / Guanidin-basierte Lyse-Reagenz, um Gewebe-Verhältnis, die Entfernung von unverdauten Gewebe vor der Trennung und Aufnahme einer Ribonuklease-Hemmstoff, um die resultierende RNA-Lösung auslaufen. Mit diesen und anderen Modifikationen, die wir in der Regel isolieren RNA mit RIN größer als 7 um Routine Genexpressionsanalyse verwendet werden.

Protokoll

1. Vorbereitung

Die folgenden Praktiken halten sich an die Richtlinien von Animal Care und Verwenden Ausschuss der Institution (IACUC) eingestellt.

1. Es wird empfohlen, nicht mehr als 6 Maus Pankreas in einem bestimmten Tag zu isolieren. Haben alle chirurgischen Instrumente sauber und autoklaviert, ein Set pro Tier.
2. Kennzeichnen Sie alle Mikrozentrifugenröhrchen. Vier 2-ml-Röhrchen pro Tier.
3. Platz 8 ml Lyse-Reagenz in 50 ml Zentrifugenröhrchen auf Eis. Hinweis: Während der Reinigung-Kit kommt mit einem Guanidinthiocyanat Phenol Reagenz, das für Bauchspeicheldrüse Isolation ist, wird Lysereagens wegen der großen Mengen, die notwendig sind pro Isolierung verwendet.
4. Dispense etwa 10 ml der folgenden Lösungen in 15 ml Zentrifugenröhrchen für die Reinigung der Homogenisator Klingen. Ethanol, 70% (2 Röhren), HPLC-Wasser (1-Rohr) und HPLC-Wasser, das etwa 200 ul RNase Auswärts oder gleichwertig Ribonuklease Inaktivators.

2. Chirurgie, Bauchspeicheldrüse Dissection und Homogenisierung

1. Zeigen 1-2 ml Isofluran in ein Gefäß mit Baumwolle Gaze oder Papiertücher. Mäuse werden auf einer Plattform, die sie vor dem Erreichen der Quelle des Isofluran verhindert platziert. Add frischen Isofluran in das Gefäß vor der Anästhesie jede Maus.
2. Sanft statt mit der Maus in das Glas mit der Isofluran. Verschließen Sie das Glas und die Auswirkungen der Narkose zu überwachen, indem Sie vorsichtig Drehen Sie das Glas hin und her. Das Tier wird anästhesiert, sobald es nicht mehr in seiner eigenen stehen.
3. Zur Bestätigung der Anästhesie, entfernen Sie das Tier aus dem Glas und tragen Sie eine Firma Zehe Prise. Wenn die Maus nicht auf die Zehen Prise reagieren, gehen Sie zu Schritt 2.5.
4. Wenn die Maus bis zu den Zehen Prise reagiert, wiederholen Sie die Schritte 2,2 bis 2,3.
5. Setzen Sie den narkotisierten Tier auf der Werkbank in der Bauchlage. Verrücken der Maus die Zervix durch dicht indem die linke Hand auf der Maus den Gebärmutterhals. Unsten die rechte Hand die Maus am Schwanz und schnell nach oben ziehen ungefähr in einem Winkel von 45 °, um den Muttermund zu verrücken.
6. Sichern Sie die Karkasse zu einer Oberfläche (eine Stufe Stück Styropor mit Papiertüchern abgedeckt) durch Einstechen in jedem der vier Pfoten des Tieres in die flache Oberfläche mit 25 Gauge Injektionsnadeln.
7. Mit einer sterilen chirurgischen Instrumenten, schneiden Sie den Mittelteil der Maus öffnen und schnell zu entfernen, die Bauchspeicheldrüse von der Maus. Verwenden Sie die Zange, um die Bauchspeicheldrüse zu halten und schneiden Sie es aus der Milz und Dünndarm mit Feder Schere. Achten Sie darauf, die Bauchspeicheldrüse bei der Entfernung von der Maus zu dehnen. Störung des Gewebes konnte Ribonuklease freizugeben. Hinweis: Die Zeit, die von der Bauchspeicheldrüse der Maus zu entfernen, ist kritisch. Ein Fachmann sollte in der Lage, die Bauchspeicheldrüse in ca. 1 min oder weniger sezieren können.
8. Legen Sie die gesamte Bauchspeicheldrüse in ein 50-ml-Tube mit 8 ml eiskaltem Lyse-Reagenz. Das Röhrchen und kurz schütteln, um die ti eintauchenusgabe in das Reagenz und fahren Sie mit dem nächsten Schritt ohne Verzögerung. Das Verhältnis von Lysereagenz, um Gewebe ist kritisch. Siehe Abschnitt Ergebnisse zum Vergleich der RNA-Integrität getrennt unter Verwendung unterschiedlicher Mengen von Lysereagenz.
9. Homogenisieren für 5 Sekunden. Es ist wichtig, die Homogenisator Schaufeln zum Boden des Zentrifugenröhrchens drücken, damit das Gewebe in die Messer für die effiziente Homogenisierung gezogen werden.

3. Entfernen von Gewebe Unverdaute

Anmerkung: Nach der Homogenisierung werden kleine Stücke von Gewebe in dem Lysereagenz bleiben. Es ist wichtiger, die so dass einige Gewebe und nicht über Homogenisieren und Risiko Abbau von RNA unverdaut Gewebe schnell aufzulösen.

1. 2 ml Lyse-Reagenz, das die Lyse der Bauchspeicheldrüse in einem 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Sammeln Sie zwei Mikrozentrifugenröhrchen pro Homogenat Isolation. Entsorgen Sie die verbleibenden Homogenat oder bei -80 ° C für zukünftige Studien.
2. Centrifuge bei 4 ° C, 12.000 × g für 5 min, um das unverdaute Gewebe zu pelletieren. Dies ist ein kritischer Schritt, da Verschleppung von unverdauten Gewebe in nachfolgenden Lösungen von RNA wahrscheinlich die Probe verunreinigt mit Ribonuclease (Schritt 5.13).
3. 1 ml des Überstands in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Fahren Sie mit der Isolation sofort und speichern Sie die Wiederholungsrohr bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung. Legen Sie alle Röhrchen mit Homogenat auf nassem Eis, während Sie mit dem nächsten Schritt.
4. Entsorgen Sie die verbleibenden Lyse-Reagenz in eine geeignete chemische Abfallbehälter.

4. Reinigung der Homogenisator Blades

1. Bevor Sie mit dem nächsten Isolation, reinigen Sie die Homogenisator Klingen, indem sie in 10 ml 70% Ethanol. Aktivieren Sie den Homogenisator für ca. 20 Sekunden, um alle Stücke von Gewebe, das von den Messern erfasst werden können, zu entfernen.
2. Verwenden Sie ein 200 ul Pipettenspitze, alle Stücke, die in den Homogenisator Klingen bleiben zu entfernen.
3. Wiederholen Sie Schritt 4.1 in Wasser, allgemeine RNase Inaktivators und 70% Ethanol. Trocknen der Homogenisator Welle mit einem sauberen Kim zu wischen.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.1 für die Bauchspeicheldrüse Isolation der verbleibenden Tiere, halten RNA von jedem Tier trennen, anstatt die Bündelung der RNA isoliert.

5. RNA-Isolierung

Der folgende Abschnitt ist identisch mit der Reinigungskits Protokoll. Der Vorteil des Reinigungs-Kits ist, dass sie die Gesamt-RNA auch kleine RNAs zu isolieren.

1. Wenn Sie gefrorene Homogenisat Lösung, tauen auf nassem Eis und stehen lassen bei RT für 5 min.
2. In 200 ul Chloroform, Röhrchen verschließen und kräftig mit der Hand für 15 Sekunden. Lassen Sie den Schlauch stehen bei RT für 2-3 min.
3. Zentrifugieren für 15 min bei 12.000 × g, 4 ° C
4. Übertragen Sie die obere wässrige Schicht in einem Mikrozentrifugenröhrchen. In 1,5 Volumen Isopropanol und mischen durch Pipettieren von oben und unten mehrmals.
5. Übertragen Sie bis zu 700 ul der Probe in eine Spin-Säule in ein 2 ml-Sammelröhrchen angeordnet ist. Schließen Sie den Deckel und Zentrifuge bei 8000 g für 15 sec bei RT.
6. Entsorgen Sie die Durchströmung.
7. Die Schritte von 5,5 bis 5,6, mit dem Rest der Probe.
8. Add 700 ul Puffer RWT auf die Spinsäule. Zentrifuge für 15 s bei 8.000 x g. Entsorgen Sie die Durchströmung.
9. Pipettieren Sie 500 ul Puffer RPE in die Spin-Säule. Zentrifugieren für 15 Sekunden bei 8000 × g, um die Säule zu waschen. Entsorgen Sie die Durchströmung.
10. Gib 500 ul Puffer RPE auf die Spinsäule. Zentrifugieren für 2 min bei 8.000 × g, um die Säule zu trocknen.
11. Übertragung der Spin-Säule in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie 80 ul Ribonuklease-freies Wasser direkt auf die Spin-Säule Membran. Zentrifugieren für 1 min bei 8.000 × g, um die RNA zu eluieren.
12. 1 ul RNase-Inhibitor auf die RNA-Lösung. Lagern bei -80 ° C oder fahren Sie mit 5.13.
13. Um die Unversehrtheit der RNA zu bestätigen, berechnen wir zuerst die RNA concentration und 260/280 Verhältnis mit einem Spektralphotometer.
14. Verdünnte einen Teil der RNA-Lösung auf etwa 500 ng / &mgr; l mit Molekularbiologie Wasser.
15. Bestimmen Sie die RNA-Integrität (dh RIN) mit Kapillar-Elektrophorese-Analyse. Etwa 5 &mgr; l RNA-Lösung ist für die Analyse ausreicht.
16. Aliquot der RNA-Lösung (siehe Abbildung 2) und bei -80 ° C

Ergebnisse

Die Gesamt-RNA-Ausbeute aus 1 ml Lyse-Homogenat ist 20-40 ug. OD 260/280 Verhältnisse sind in der Regel rund 2,0 und die RIN sind durchweg größer als 7,0. Wenn das RIN ≤ 6, wird die Isolation müssen wiederholt werden. Gelegentlich wird ein RIN, die höher als 8,0 ist erreicht.

Die beiden am häufigsten verwendeten Methoden der euthanizing Mäuse vor der Entfernung der Bauchspeicheldrüse sind CO _2-Erstickung oder Inhalation von Isofluran. Beide Techniken werden durch zervika...

Diskussion

Isolierung von RNA aus Gewebe, die Ribonuklease reich sind eine große Herausforderung für die Molekularbiologie Experimenten. Verschiedene Reagenzien und Kits sind kommerziell erhältlich, die in erster Linie von dem Phenol Guanidinthiocyanat-Methode der RNA-Extraktion basieren. Guanidinthiocyanat denaturiert Protein und verringert die Aktivität der Ribonuklease damit. Die schiere Größe der Ribonuklease in der Bauchspeicheldrüse benötigt jedoch zusätzliche Modifikationen Standardprotokollen der RNA-Isolierung. E...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Power Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogenizer
5424R	Eppendorf		Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent	Invitrogen	15596018	Lysis reagent
Student Vannas spring scissors	Fisher	91500-09	Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch	Fisher	08-951-20	Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps	Fisher	1381239	Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetic
Rnase out (40 U/µl)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivator
HPLC grade water	Fisher	W5-4	For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water	Hyclone	SH30538.03	Elution of RNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free	USA Scientific Plastics	1620-2700
15 ml centrifuge tubes	Falcon	352099
70% ethanol	Fisher
100% ethanol	Fisher
200 µl pipet tips	Rainin	GPL200F	For cleaning homogenizer blades
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrophotometer
Bioanalyzer	Agilent		Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater	Ambion		RNA Stabilization Reagent
RNeasy spin columns	Qiagen		Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice	Chales River	Strain C57BL/6	Their age ranged from 4 to 12 months.
Mice	Jackson Lab	strain 129	Their age ranged from 4 to 12 months.