בידוד RNA מן העכבר לבלב: רקמות ribonuclease עשיר

Summary

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Abstract

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

Introduction

בידוד של RNA עם יושרה גבוהה נדרש לניסויים בביולוגיה מולקולריים שיגרתי כגון סופג צפוני ^9, qRT-PCR ¹ או ביטוי פרופיל גנטי ^5. רוב השיטות עכשוויות של בידוד RNA מבוססות על שינויים של פרוטוקולי thiocyanate guanidine ^{2, 3.} Thiocyanate guanidine הוא denaturant חלבון חזק ויהיה יעיל לשבש את הפעילות של ribonuclease תחת רוב התנאים. השיטה הפופולרית של Chomczynski וסאקי ³ בשילוב פנול לפתרון תמוגה thiocyanate guanidine, צמצום זמן הבידוד לכ -4 שעות. ריאגנטים מיצוי RNA, זמינים מסחרי רבים מבוססים על Chomczynski וסאקי שיטת ^3.

רקמות ribonuclease עשירות כגון לבלב אנושי או עכבר מציגה אתגר נוסף לבידוד RNA. לבלב של עכבר עשוי להכיל עד 75 מ"ג ribonuclease ⁶ שחלקם ישוחרר דוריןשיבוש גרם של רקמת הלבלב וכתוצאה מכך autolysis רקמות. שינויים של פרוטוקולי thiocyanate guanidine שימשו בהצלחה לבודד RNA מלבלב עם רמה גבוהה של יושרה ^{2, 4, 7, 10.} עירוי של מגיב ייצוב RNA לבידוד בהנחייתם לבלב של עכברים של RNA עם רמה גבוהה של יושרה ^{4, 7, 10,} לעומת זאת עירוי של פתרונות ללבלב דורש מיומנות רבה, עשוי לדרוש מכשירים מיוחדים כגון מיקרוסקופ לנתח ושיבוש ארכיטקטורת רקמה במהלך ההליך עלול לגרום לתמוגה תא. מרוססים רקמות עם מגיב ייצוב RNA עשוי להפריע ליישומים אחרים, כולל בידוד חלבון וצביעה היסטולוגית. יתר על כן, טכניקה זו אינה מתאימה לבידוד RNA מן הלבלב אנושי. פרוטוקולים אחרים דורשים ההכנה של פתרונות ספציפיים על ידי החוקר ^2.

אנו מדווחים על פרוטוקול לבודד RNA עם יושרה גבוהה מלבלב עכבר. הפרוטוקול דואר משתמש באלמנטים של שיטות שפורסמו בעבר, והוא מבוסס במידה רבה על הפרוטוקולים סטנדרטי פנול / guanidine מבוסס thiocyanate תמוגה מגיב. היא אינה דורשת ההכנה של פתרונות מיוחדים ואינו דורש עירוי של חומרים כימיים ללבלב. שלבים קריטיים עבור בידוד RNA מוצלח כוללים פנול / מבוסס guanidine מגיב תמוגה גבוהה יחס רקמות, הסרת הרקמה מעוכלת מראש לשלב הפרדה והכללת מעכב ribonuclease לפתרון RNA וכתוצאה מכך. באמצעות אלה ושינויים אחרים, אנחנו בדרך כלל לבודד RNA עם רין יותר מ 7 שישמשו לניתוח ביטוי גנים שבשגרה.

Protocol

1. הכנה

השיטות הבאות לדבוק במדיניות שנקבעה על ידי הוועדה של המוסד לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC).

1. מומלץ לבודד לא יותר מ -6 לבלב של עכבר בכל יום נתון. יש את כל מכשירי הניתוח נקיים וautoclaved, סט אחד לכל בעל חיים.
2. לייבל כל microcentrifuge הצינורות. ארבעה 2 צינורות מיליליטר לכל בעל חיים.
3. הנח 8 מיליליטר של מגיב תמוגה ב50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר על קרח. הערה: בעוד שערכת הטיהור מגיעה עם מגיב פנול thiocyanate guanidine כי הוא מתאים לבידוד לבלב, מגיב תמוגה משמש בשל הכמויות הגדולות הנדרשות לבידוד.
4. לוותר על 10 מיליליטר מהפתרונים הבאים ל15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר לניקוי הלהבים של homogenizer. אתנול, 70% (2 צינורות), מים כיתה HPLC (צינור 1) ומים HPLC כיתה מכילים כ 200 μl של RNase משם או inactivator ribonuclease המקביל.

2. כירורגיה, Dissection לבלב ולתפעול

1. הנח 1-2 מיליליטר של isoflurane לתוך צנצנת המכילה מגבות גזה כותנה או נייר. עכברים מונחים על פלטפורמה המונעת מהם להגיע למקור של isoflurane. הוספת isoflurane הטרי לצנצנת לפני הרדמת כל עכבר.
2. מניח בעדינות את העכבר לתוך הצנצנת המכילה את isoflurane. מכסה את הצנצנת ולנטר את ההשפעות של ההרדמה על ידי בעדינות לסובב את הצנצנת קדימה ואחורה. בעל החיים הוא מורדם פעם אחת זה באינו מסוגל לעמוד ב'משלו.
3. לאישור של הרדמה, להסיר את החיה מהצנצנת ולהחיל קמצוץ הבוהן משרד. אם העכבר אינו מגיב לקמצוץ הבוהן, המשך לשלב 2.5.
4. אם העכבר מגיב לקמצוץ הבוהן, ולאחר מכן לחזור על השלבים 2.2-2.3.
5. מניחים את החיה מורדמת על גבי הספסל במצב המועדים. לנקוע את צוואר הרחם של העכבר על ידי הצבת בחוזקה עם יד שמאל על צוואר הרחם של העכבר. לנוing יד ימין לתפוס את זנבו של העכבר ובמהירות למשוך כלפי מעלה בזווית של כ 45 ° ללנקוע את צוואר הרחם.
6. לאבטח את הפגר למשטח (חתיכת רמה של קלקר מכוסה במגבות נייר) על ידי פירסינג כל אחת מארבע כפות רגליו של בעל החיים למשטח השטוח באמצעות מחטים תת עורי 25 מד.
7. שימוש במכשירי ניתוח סטרילי, לחתוך את הבטן של העכבר פתוח ובמהירות להסיר את הלבלב של העכבר. השתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלבלב ולחתוך אותו מהטחול והמעי הדק באמצעות מספריים האביב. היזהר לא למתוח את הלבלב במהלך ההסרה מהעכבר. שיבוש של הרקמה יכול לשחרר ribonuclease. הערה: הזמן שנדרש כדי להסיר את הלבלב של העכבר הוא קריטי. אדם מיומן אמור להיות מסוגל לנתח את הלבלב בכ -1 דקות או פחות.
8. הנח את הלבלב כולו לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 8 מיליליטר של מגיב תמוגה קר כקרח. שווי הצינור ובקצרה לנער לטבול tissue למגיב ולהמשיך לשלב הבא ללא דיחוי. היחס של מגיב תמוגה לרקמה הוא קריטי. ראה סעיף תוצאות עבור השוואה של שלמות RNA מבודדת באמצעות כרכים שונים של מגיב תמוגה.
9. Homogenize במשך 5 שניות. חשוב ללחוץ על להבי homogenizer לחלק התחתון של צינור צנטריפוגות כדי לאפשר לרקמות להיות מורמות אל תוך הלהבים להומוגניזציה יעילה.

3. הסרת רקמות מעוכלת

שים לב: בעקבות הומוגניזציה, פיסות קטנות של רקמה תישאר במגיבה תמוגה. זה יותר חשוב לי lyse הרקמה להשאיר כמה רקמות מעוכלות ולא מעל homogenizing והשפלה סיכון של RNA במהירות.

1. העברה 2 מיליליטר של מגיב תמוגה מכיל לבלב lysed לצינור microcentrifuge 2 מיליליטר. לאסוף שני צינורות microcentrifuge של homogenate לבידוד. מחק את homogenate שנותר או בחנות ב -80 מעלות צלזיוס למחקרים עתידיים.
2. סנטrifuge ב 4 ° C, G 12,000 × למשך 5 דקות עד גלולה הרקמות מעוכלת. זהו צעד קריטי כמו שריד של רקמה מעוכלת לפתרונות הבאים של RNA צפוי לזהם את המדגם עם ribonuclease (שלב 5.13).
3. העברה 1 מיליליטר של supernatant לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר. להמשיך בבידוד באופן מיידי ולאחסן את הצינור לשכפל ב -80 ° C לשימוש עתידי. מניחים את כל הצינורות המכילים homogenate על קרח רטוב תוך שתמשיך לשלב הבא.
4. השלך את מגיב תמוגה נותר לתוך כלי קיבול פסולת כימית מתאים.

4. ניקוי של להבי Homogenizer

1. לפני שתמשיך לבידוד הבא, לנקות את להבי homogenizer ידי הצבת אותם ב10 מיליליטר של 70% אתנול. הפעל את homogenizer במשך לכ20 שניות כדי להסיר כל גושים של רקמה שעלולה להיתפס בלהבים.
2. השתמש קצה 200 pipet μl כדי להסיר כל חתיכות שתישארנה בלהבי homogenizer.
3. חזור על שלב 4.1 במים, inactivator RNase הכללי ו70% אתנול. ייבש את פיר homogenizer עם קים נקייה לנגב.
4. חזור על שלב 2.1 לבידוד הלבלב של בעלי החיים שנותרו, RNA שמירה מבודד מכל חיה נפרדת ולא איגום RNA.

5. בידוד RNA

הסעיף הבא הוא זהה לפרוטוקול ערכת הטיהור. היתרון של ערכת הטיהור הוא שזה יבודד רנ"א הכל כולל RNA הקטן.

1. אם אתם משתמשים בפתרון homogenate קפוא, להפשיר על קרח רטוב ולתת לעמוד על RT במשך 5 דקות.
2. הוסף 200 μl של כלורופורם, מכסה את הצינור ולנער במרץ ביד ל15 שניות. בואו הצינור עומד על RT במשך 2-3 דקות.
3. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 XG, 4 ° C.
4. מעביר את השכבה העליונה המימית לתוך צינור microcentrifuge. הוסף 1.5 כרכים של isopropanol ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים.
5. העבר עד 700 μl של המדגם לעמודת ספין שממוקם בצינור אוסף 2 מיליליטר. סגור את המכסה וצנטריפוגות ב 8,000 XG במשך 15 שניות ב RT.
6. מחק את הזרימה דרכו.
7. חזור על שלבים 5.5-5.6, תוך שימוש בשאר המדגם.
8. הוסף 700 μl הצפת RWT לעמודת הספין. צנטריפוגה במשך 15 שניות ב8,000 x גרם. מחק את הזרימה דרכו.
9. Pipet 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין. צנטריפוגה במשך 15 שניות ב8,000 XG לשטוף את העמודה. מחק את הזרימה דרכו.
10. הוסף 500 μl הצפת הרשתית לעמודת הספין. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 8,000 XG לייבש את העמודה.
11. העבר את טור הספין לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. Pipet 80 ללא מים ribonuclease μl ישירות על גבי קרום טור ספין. צנטריפוגה 1 דקות ב8,000 XG לelute RNA.
12. הוספת מעכב RNase μl 1 לפתרון RNA. אחסן ב-80 ° C או להמשיך ל5.13.
13. כדי לאמת את השלמות של RNA, לחשב את conce RNA הראשוןיחס ntration ו260/280 באמצעות ספקטרופוטומטר.
14. לדלל חלק מפתרון RNA כ 500 ng / μl עם מים כיתה ביולוגיה מולקולרית.
15. לקבוע את Integrity RNA (כלומר, רין) באמצעות ניתוח אלקטרופורזה נימים. כ 5 μl של פתרון RNA הוא מספיק לניתוח.
16. Aliquot פתרון RNA (ראה איור 2) ולאחסן ב -80 ° C.

תוצאות

תשואת רנ"א הכל מ1 מיליליטר של homogenate תמוגה היא 20-40 מיקרוגרם. יחסי 260/280 OD הם בדרך כלל סביב 2.0 ורין הם גדול יותר באופן עקבי מאשר 7.0. אם רין הוא ≤ 6, הבידוד צריך להיות חוזר ונשנה. לפעמים, רין שהוא גבוה יותר מאשר 8.0 מושגת.

שתי שיטות הנפוצות ...

Discussion

בידוד RNA מן הרקמות הribonuclease עשירים מהווה אתגר גדול לניסויים בביולוגיה מולקולריים. ריאגנטים וערכות שונים זמינים באופן מסחרי המבוססים בעיקר על שיטת thiocyanate guanidine פנול של מיצוי RNA. thiocyanate guanidine denatures חלבון ובכך מפחית את הפעילות של ribonuclease. עם זאת, הגודל העצום של ribonuclease בלבלב ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Power Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogenizer
5424R	Eppendorf		Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent	Invitrogen	15596018	Lysis reagent
Student Vannas spring scissors	Fisher	91500-09	Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch	Fisher	08-951-20	Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps	Fisher	1381239	Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetic
Rnase out (40 U/µl)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivator
HPLC grade water	Fisher	W5-4	For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water	Hyclone	SH30538.03	Elution of RNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free	USA Scientific Plastics	1620-2700
15 ml centrifuge tubes	Falcon	352099
70% ethanol	Fisher
100% ethanol	Fisher
200 µl pipet tips	Rainin	GPL200F	For cleaning homogenizer blades
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrophotometer
Bioanalyzer	Agilent		Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater	Ambion		RNA Stabilization Reagent
RNeasy spin columns	Qiagen		Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice	Chales River	Strain C57BL/6	Their age ranged from 4 to 12 months.
Mice	Jackson Lab	strain 129	Their age ranged from 4 to 12 months.