Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Özet

We report a procedure to isolate RNA with high integrity from the ribonuclease rich mouse pancreas.

Özet

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge. As a primary function of the pancreas is to aid in digestion, mouse pancreas may contain as much a 75 mg of ribonuclease. We report modifications of standard phenol/guanidine thiocyanate lysis reagent protocols to isolate RNA from mouse pancreas. Guanidine thiocyanate is a strong protein denaturant and will effectively disrupt the activity of ribonuclease under most conditions. However, critical modifications to standard protocols are necessary to successfully isolate RNA from ribonuclease-rich tissues. Key steps include a high lysis reagent to tissue ratio, removal of undigested tissue prior to phase separation and inclusion of a ribonuclease inhibitor to the RNA solution. Using these and other modifications, we routinely isolate RNA with RNA Integrity Number (RIN) greater than 7. The isolated RNA is of suitable quality for routine gene expression analysis. Adaptation of this protocol to isolate RNA from ribonuclease rich tissues besides the pancreas should be readily achievable.

Giriş

Yüksek bütünlük RNA izolasyonu örneğin kuzey blot ^9, qRT-PCR ¹ ve ⁵ gen ekspresyonu gibi rutin moleküler biyoloji deneyleri için gereklidir. RNA izolasyonu çoğu modern yöntemler, guanidin tiyosiyanat protokolleri ^2, modifikasyonları dayanmaktadır ^3. Guanidin tiyosiyanat güçlü protein denatüran ve etkili bir çoğu durumda ribonükleaz aktivitesini bozacak. Chomczynski ve Sacchi ^3'ün yaygın kullanılan yöntem, yaklaşık 4 saat için izolasyon süresini azaltmak, guanidin tiyosiyanat lizis çözeltisine fenol birleştirildi. Pek çok ticari olarak temin edilebilen RNA ekstraksiyon reaktifleri Chomczynski ve Sacchi yöntem ³ üzerine dayanır.

Bu tür insan veya fare gibi pankreas Ribonuclease zengin dokuların RNA'nın izole edilmesi için ek bir zorluktur. Fare pankreas bazıları Durin çıkacak ribonükleaz ⁶ kadar olan 75 mg içerebilirg doku otoliz sonuçlanan pankreas dokusunun bozulması. Guanidin tiyosiyanat protokollerin modifikasyonları başarılı bir şekilde yüksek bütünlüğü ^{2, 4, 7, 10,} yüksek bütünlüğü ^{4, 7, 10,} RNA fare pankreası kolaylaştırılmış izolasyon içine RNA stabilizasyonu reajanı. Infusion Ancak infüzyon of ile pankreasından RNA'yı izole etmek için kullanılmıştır pankreas içine çözümler, büyük bir beceri gerektirir böyle bir mikroskop ve işlem sırasında doku mimarisini bozan hücre parçalama neden olabilir gibi özel araçlar gerekebilir. RNA stabilizasyon reaktif ile dokuyu perfüze protein izolasyonu ve histolojik boyama gibi diğer uygulamaları ile etkileyebilir. Ayrıca, bu teknik, insan pankreasından RNA'nın izole edilmesi için uygun değildir. Diğer protokoller ² araştırmacı tarafından özel çözümler hazırlanmasını gerektirir.

Biz fare pankreas yüksek bütünlük RNA izole etmek için bir protokol rapor. The protokolü daha önce yayınlanmış yöntemlerden elemanları içeren ve büyük ölçüde standart fenol / guanidin tiyosiyanat tabanlı liziz reaktif protokoller üzerine dayanır. Bu, özel bir çözeltilerin hazırlanmasını gerekli değildir, ne de pankreas içine reaktiflerin infüzyon gerektirir. Başarılı bir RNA izolasyonu için kritik adım doku oranı, elde edilen RNA çözeltiye ayırma ve bir ribonükleaz inhibitörü dahil faz önce sindirilmemiş doku çıkarılması için yüksek bir fenol / guanidin bazlı liziz reaktif içerir. Bu ve diğer değişiklikler kullanarak, tipik olarak daha büyük 7 rutin gen ekspresyon analizi için kullanılacak RIN ile RNA izole eder.

Protokol

1.. Hazırlık

Aşağıdaki uygulamalar Kurum'un Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen politikalara bağlı.

1. Bu, herhangi bir gün içinde en fazla 6 fare pankreasları izole edilmesi tavsiye edilir. Temiz ve otoklav tüm cerrahi aletler, hayvan başına bir set var.
2. Tüm Mikrosantrifüj tüpleri etiketleyin. Hayvan başına dört 2 ml tüpler.
3. Buz üzerinde bir 50 ml santrifüj tüplerine reaktifi ile 8 ml yerleştirin. Not: Saflaştırma kiti pankreas izolasyonu için uygun olan bir guanidin tiyosiyanat fenol maddesi ile birlikte olsa da, liziz reaktif nedeniyle izolasyon başına gerekli olan büyük hacimlerde kullanılır.
4. Homojenleştirici ait bıçaklar temizlenmesi için bir 15 ml santrifüj tüplerine aşağıdaki çözümlerden yaklaşık 10 ml dağıtın. Etanol,% 70 (2 tüpler), HPLC dereceli su (1 tüp) yaklaşık 200 RNaz'ın ul Dışarıda veya eşdeğer ribonükleez inaktivatör içeren HPLC dereceli su.

2.. Cerrahi, Pankreas Diseksiyon ve Homojenleşmesi

1. Pamuklu gazlı bez veya kağıt havlu içeren bir kavanoza izofluran 1-2 ml yerleştirin. Fareler izofluran kaynağını ulaşmasını engelleyen bir platform üzerine yerleştirilir. Öncesinde her fare anestezi için kavanoza taze isofluranın ekle.
2. Yavaşça izofluran içeren kavanozun içine fare yerleştirin. Kavanoz kapağı ve yavaşça ileri ve geri kavanoz çevirerek anestezi etkilerini izlemek. Onun kendi durmak mümkün olduğunu bir kez hayvan anestezi.
3. Anestezi teyidi için, kavanozdan hayvan kaldırmak ve sağlam bir ayak tutam uygulayın. Fare ayak tutam tepki vermezse, 2.5 adıma geçin.
4. Fare ayak tutam tepki, o adımları 2,2-2,3 tekrarlayın.
5. Yüzüstü pozisyonda tezgah üzerine anestezi hayvan yerleştirin. Sıkıca fare serviks üzerinde sol el koyarak mouse serviksini yerinden. Bizesağ fare kuyruğu kavramak ve hızlı bir şekilde rahim dağıtacağına yaklaşık yukarı bir 45 ° açı çekin ing.
6. 25 gauge derialtı iğneler kullanarak düz bir yüzeyin içine hayvanın dört pençeleri her delici bir yüzeye (kağıt havlu ile kaplı strafor bir seviye parça) için karkas sabitleyin.
7. Açık fare midsection kesti ve hızlı fare pankreas kaldırmak, steril cerrahi aletler kullanarak. Pankreas tutun ve yaylı makas kullanılarak dalak ve ince bağırsaktan kesmek için forseps kullanabilir. Fare çıkarılması sırasında pankreas germek için dikkatli olun. Doku bozulması Ribonuclease serbest olabilir. Not: Bu fare pankreas kaldırmak için gereken zamanı önemlidir. Yetenekli bir kişi, yaklaşık 1 dakika veya daha kısa bir pankreas incelemek gerekir.
8. Soğuk lisiz tepkin maddesinin 8 ml içeren 50 ml'lik bir tüp içine tüm pankreas yerleştirin. Tüp kap ve kısaca ti öğrenmek sallamakayıraç içine ssue ve gecikmeden bir sonraki adıma geçin. Dokuya reaktifi oranı önemlidir. Liziz reaktifi farklı hacimleri kullanılarak izole RNA bütünlüğü bir karşılaştırma için sonuçlar bölümüne bakın.
9. 5 sn için homojenize edilmiştir. Bu doku etkili homojenizasyon için bıçakların içine çekilmesine izin vermek için, santrifüj tüpünün dibine homojenleştirici bıçakları basın önemlidir.

Sindirilmemiş Doku 3. Kaldırma

Not: Homojenizasyondan sonra doku küçük bit reaktifi kalacaktır. Bu hızlı homojenleştirici ve RNA risk bozulması üzerine yerine sindirilmemiş bazı doku bırakarak dokuyu parçalamak için daha önemlidir.

1. Transfer 2 ml mikrosantrifüj tüpüne lize pankreas ihtiva eden liziz reaktifi 2 ml. Izolasyon başına homojenat iki mikrosantrifüj tüpleri toplayın. Gelecekteki çalışmalar için -80 ° C'de kalan homojenatın veya mağaza atın.
2. Sent4 ° C, sindirilmemiş doku pellet haline getirmek için 5 dakika için 12,000 x g'da rifuge. Bu büyük olasılıkla ribonüleaz (adım 5.13) ile numuneyi kontamine RNA sonraki çözümleri içine sindirilmemiş doku taşınmadan kaynaklanan gibi kritik bir adımdır.
3. 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpü içine aktarın süpernatan 1 ml. Hemen izolasyonu ile devam edin ve gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de suret tüp saklayın. Bir sonraki aşamaya geçmeden ıslak buz üzerinde Homojenat içeren tüm tüpler yerleştirin.
4. Uygun bir kimyasal atık yuvasına kalan reaktifi atınız.

Homojenizetör Blades 4. Temizleme

1. Bir sonraki izolasyon geçmeden önce,% 70 etanol, 10 ml yerleştirerek homojenleştirici bıçakları temizleyin. Bıçakları yakalanmış olabilir dokusunun herhangi parçalarını kaldırmak için 20 saniye boyunca yaklaşık için homojenizer etkinleştirin.
2. Homogenizer bıçakları kalan herhangi parçaları kaldırmak için bir 200 ul pipet ucu kullanın.
3. Suyu, genel Rnase inaktivatör ve% 70 etanol adımı tekrarlayın 4.1. Temiz Kim ile homojenleştirici şaft silin kurulayın.
4. Kalan hayvanların pankreas izolasyonu için yineleyin 2.1, yerine RNA havuzu daha her hayvan ayrı izole tutmak RNA.

5. RNA İzolasyon

Aşağıdaki bölüm, saflaştırma kiti protokol ile aynıdır. Saflaştırma kiti avantajı küçük RNA'ların de dahil olmak üzere, toplam RNA izole olmasıdır.

1. Dondurulmuş homojenat çözeltisi kullanılarak ise, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında beklemeye ıslak buz üzerinde ve çözülme sağlar.
2. Kloroform 200 ul ekleyin, tüp kap ve 15 saniye boyunca elle kuvvetlice sallayın. Tüp, 2-3 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
3. 12,000 xg, 4 ° C'de 15 dakika boyunca santrifüj
4. Bir mikro santrifüj tüpüne üst Sulu tabakayı aktarın. Izopropanolün 1.5 sayılarını ve yukarı ve aşağı pipetleme birkaç kez iyice karıştırın.
5. 70 kadar transfer2 ml'lik bir toplama tüpü içine yerleştirilen bir sıkma kolona numunenin 0 ul. Oda sıcaklığında 15 saniye boyunca 8000 x g'de santrifüj kapağı ve kapatın.
6. Flow-through atın.
7. Tekrar, numunenin geri kalanı ile, 5,5-5,6 adımları.
8. Döndürme kolonuna 700 ul Tampon RWT ekleyin. 8,000 x g de 15 saniye boyunca santrifüjleyin. Flow-through atın.
9. Spin kolon içine pipet 500 ul Tampon RPE. Sütunu yıkamak için 8.000 xg 15 saniye santrifüj. Flow-through atın.
10. Döndürme kolonuna 500 ul Tampon RPE ekleyin. Sütunu kuru 8000 x g'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
11. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne spin kolon aktarın. Doğrudan spin kolon zar üzerine Pipet 80 ul ribonükleaz içermeyen su. RNA elüt edilmesi için 8000 x g 'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin.
12. RNA çözeltisine, 1 ul Rnaz inhibitörü ekleyin. -80 ° C'de saklayın veya 5,13 geçin.
13. RNA bütünlüğünü doğrulamak için, ilk olarak RNA conce hesaplamakBir spektrofotometre kullanılarak ntration ve 260/280 oranı.
14. Moleküler biyoloji dereceli su ile yaklaşık olarak 500 ng / ul RNA çözeltinin bir bölümünün seyreltin.
15. Kapiller elektroforez analizi kullanılarak RNA Dürüstlük (yani, Rin) belirleyin. RNA çözelti yaklaşık 5 ul analiz için yeterlidir.
16. -80 ° C'de RNA çözeltisi (bkz. Şekil 2) ve mağaza alikotu

Sonuçlar

Liziz Homojenat 1 ml toplam RNA verimi 20-40 ug'dır. OD 260/280 oranı tipik olarak yaklaşık 2.0 'dir ve RIN, 7.0' dan, daha geniş bir bulunmaktadır. RIN 6 ≤ ise, izolasyon tekrar edilmesi gerekecektir. Bazen, 8.0 'dan daha yüksek olan bir RIN elde edilir.

Önce pankreas kaldırılması için fareler ötenazi iki en yaygın olarak kullanılan yöntemler, CO ₂ asfiksi ya da izofluran teneffüs bulunmaktadır. Her iki teknik, servikal dislokasyon ile takip ed...

Tartışmalar

Zengin ribonükleaza olan dokulardan RNA izole moleküler biyoloji deneyleri için büyük bir sorun teşkil etmektedir. Çeşitli belirteçler, ve kitler öncelikle RNA ekstraksiyon fenol guanidin tiyosiyanat yöntemine bağlı ticari olarak temin dayanır ki. Guanidin tiyosiyanat protein denatüre ve böylece ribonükleaz etkinliğini azaltır. Ancak, pankreas ribonükleaz çokluğu bir RNA izolasyonu standart protokollere ek değişiklikler gerektirir. Standart bir protokol guanidin tiyosiyanat yöntemine göre oldu?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Power Gen 500	Fisher Scientific	14-261-03	Homogenizer
5424R	Eppendorf		Refrigerated microcentifuge
Trizol reagent	Invitrogen	15596018	Lysis reagent
Student Vannas spring scissors	Fisher	91500-09	Use to cut pancreas from attached tissues
Surgical scissors, 6 inch	Fisher	08-951-20	Use to cut scin of mouse
Blunt end forceps	Fisher	1381239	Use to hold pancreas while dissecting
Isoflurane USP	Abbott Labs	4/8/5210	Anesthetic
Rnase out (40 U/µl)	Invitrogen	10777-019	Rnase inhbitor
Rnase Away	Ambion	10328-011	General Rnase inactivator
HPLC grade water	Fisher	W5-4	For washing homogenizer blades
Molecular biology grade water	Hyclone	SH30538.03	Elution of RNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Purification Kit
2 ml microcentrifuge tubes, certified Rnase Dnase free	USA Scientific Plastics	1620-2700
15 ml centrifuge tubes	Falcon	352099
70% ethanol	Fisher
100% ethanol	Fisher
200 µl pipet tips	Rainin	GPL200F	For cleaning homogenizer blades
Chloroform	Fisher	BP1145-1
Nanodrop	Thermo	ND-1000	Spectrophotometer
Bioanalyzer	Agilent		Capillary electrophoresis analyzer to measue RNA integrity
RNAlater	Ambion		RNA Stabilization Reagent
RNeasy spin columns	Qiagen		Spin columns as a part of the miRNeasy Mini kit
Mice	Chales River	Strain C57BL/6	Their age ranged from 4 to 12 months.
Mice	Jackson Lab	strain 129	Their age ranged from 4 to 12 months.